DETERMINATION OF THE OCCURENCE OF NUCLEAR ANOMALIES IN DANIO RERIO PERIPHERAL BLOOD ERYTH- ROCYTES DEPENDING ON THE DOSE OF IONIZING RADIATION



Cite item

Full Text

Abstract

Ionizing radiation induces double-stranded breaks in the DNA structure, following by the formation of dicentric chromosomes. With the passage of subsequent postradiation mitoses, dicentric chromosomes are unevenly distributed to the poles of the cell, as a result of which nuclear anomalies of various types are formed, distinguishable at the light-optical level. The aim of this study was to assess the occurrence of nuclear anomalies in the peripheral blood erythrocytes of freshwater fish Danio rerio after exposure to ionizing radiation, as well as to assess the possibility of using these organisms as model animals in radiobiological studies. To determine the frequency of occurrence of nuclear anomalies in peripheral blood erythrocytes of freshwater fish Danio rerio, fish were exposed to X-ray radiation at doses of 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 Gy. 48 hours after irradiation in fish peripheral blood erythrocytes by light microscopy, four types of nuclear anomalies were identified: micronuclei, nuclear protrusions, nucleoplasmic bridges, dumbbell-shaped nuclei. The frequency of detection of micronuclei and nuclear protrusions was found to be dose-dependent (r = 0.9245, p < 0.05 and r = 0.9062, p < 0.05 respectively), while the appearance of nucleoplasmic bridges and dumbbell-shaped nuclei did not correlate with the dose. More than that, the frequencies of micronuclei and nuclear protrusions detected after irradiation of fish at doses of more than 4 Gy (4.0, 6.0 and 8.0 Gy) significantly differed from the control values. Thus, Danio rerio can be used as a laboratory test system for radiobiological research, for example, to determine the effect of the developed radioprotectors and radiosensitizers, despite the extreme radioresistance of these organisms. It is advisable to use micronuclei or nuclear protrusions as cell markers, given, however, that the identification of these markers will allow detecting radiation exposure only in doses above 4 Gy.

Full Text

Введение. Основной формой генотоксического воздействия ионизирующего излучения является внесение двуцепочечных разрывов в структуру ДНК. Некорректная репарация таких повреждений может привести к формированию аберрантных кольцевых и дицентрических хромосом. «Золотым стандар- том» среди методов биодозиметрии является метод учета перестроек метафазных хромосом [1]. Од- нако в условиях крупной техногенной катастрофы, характеризующейся значительным количеством по- раженных и необходимостью срочной диагностики поглощенной дозы у большого числа людей, эта техника окажется слишком энергоемкой в связи с длительным предварительным культивированием кле- ток. Поиск универсальных экспресс-маркеров лучевого воздействия на организм ведется до сих пор. После первого постлучевого митоза в клетках, содержащих дицентрические хромосомы, фор- мируются различимые на светооптическом уровне ядерные аномалии. Причиной их появления является неравномерное расхождение дицентриков к разным полюсам клетки в ходе анафазы. Так, при обо- соблении отдельной дицентричской хромосомы или ацентрического фрагмента формируются микро- ядра, известные также как тельца Хоуэлла-Джолли [2]. Микроядра являются наиболее изученной фор- мой кариопатологии и используются как маркер для биодозиметрических исследований в рамках мик- роядерного теста. Если две центромеры в составе дицентрической хромосомы оказываются направле- ны к противоположным полюсам в ходе анафазы митоза, то между дочерними ядрами формируется хроматиновый мост, который также различим в световой микроскоп. При разрыве таких мостов обра- зуются ядра, содержащие протрузии, или «хвостатые» ядра. Наименее изученной формой кариопато- логии являются гантелевидные ядра, представляющие собой сближенные дочерние ядра делящейся клетки, соединенные толстой перемычкой [3]. Все указанные аномалии были обнаружены в ряде биологических объектов, а также в крови пе- риферической крови ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС [4] и могут быть использованы как маркеры воздействия ионизирующего излучения. Danio rerio, известная в иностранной литературе как Zebrafish, представляет собой небольшую пресноводную рыбу, которая неоднократно использовалась в генетике и молекулярной биологии как модельный объект. В последнее время данный вид довольно широко используется как модельный орга- низм и для экотоксикологических исследований по нескольким причинам: прозрачность эмбрионов и мальков, высокая функциональная гомология генома с геномом человека, относительно быстрое раз- множение и большое потомство, дешевизна. Мы предполагаем возможность использования аквариум- ной рыбы Danio rerio в качестве модели для радиобиологических исследований. Целью настоящего исследования было установить значения частот встречаемости ядерных ано- малий четырех видов (микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, гантелевид- ные ядра) в эритроцитах периферической крови Danio rerio в зависимости от дозы ионизирующего из- лучения. В дальнейшем идентификация наиболее специфичного клеточного маркера позволит исполь- зовать эритроциты Danio rerio как тест-систему для оценки эффективности радиопротекторов и радио- сенсибилизаторов. Материалы и методы. Для исследования использовались пресноводные аквариумные рыбы Danio rerio мужского и женского пола. Размеры варьировались в пределах 2,5-3,0 сантиметров. Рыбы были получены из коммерческого источника и поддерживались в условиях нормальной аквакультуры. Исполь- зовались аквариумы, снабженные фильтрами и аэраторами воды. Температура воды в аквариумах поддерживалась на постоянном уровне (22,0 ± 0,5ºС), кормление рыб осуществлялось 2 раза в день. Для определения частоты встречаемости различных ядерных аномалий в эритроцитах перифери- ческой крови 63 особи Danio rerio были подвергнуты воздействию рентгеновского излучения в дозах 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 Гр. Облучение проводилось с помощью рентгеновского аппарата РУМ-17. После облучения особи возвращались в первоначальные условия. Через 48 часов после облучения пе- риферическую кровь забирали из хвостовой вены путем обрезания хвостового плавника. Кровь наноси- ли на чистое предметное стекло и распределяли ровным слоем. На одну особь производился анализ двух мазков. Кровь фиксировали в 96% этиловом спирте в течение 25-30 минут до полного высушивания. Затем мазки окрашивались азур II эозином по методу Романовского (краситель «Диахим-ГемиСтейн- Р»). Полученные мазки из каждой группы облученных рыб были подвергнуты ранжированию с присвое- нием слепых номеров. Микроскопия полученных мазков крови производилась на микроскопе «Leica DM-1000» при увеличении 1000х. В каждом мазке подсчитывали 3000 клеток, при этом фиксировали ко- личество обнаруженных микроядер, межъядерных хроматиновых мостов, ядерных протрузий и гантеле- видных ядер в эритроцитах рыб каждой группы. Статистическая обработка данных производилась с по- мощью пакета Graph Prism 8.0. Достоверность отличий средних в каждой группе от контрольной выявля- лись при помощи критерия Манна-Уитни. Корреляция частоты встречаемости отдельных ядерных ано- малий с дозой ионизирующего излучения выявлялась при помощи линейного коэффициента корреля- ции r-Пирсона. Результаты. Через 48 часов после воздействия рентгеновского излучения в разных дозах (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 Гр) в эритроцитах периферичесской крови Danio rerio обнаруживались ядер- ные аномалии четырех типов: микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, ган- телевидные ядра. Результаты подсчета встречаемости всех видов ядерных аномалий в эритроцитах представлены в таблицеꢀ 1. Примечание: средняя ± стандартная ошибка среднего, * - значения, достоверно отличающиеся от контрольных, критерий Манна-Уитни, p < 0,05. На рисунке 1 отображены зависимости встречаемости ядерных аномалий разных типов в эритро- цитах Danio rerio от дозы рентгеновского излучения. При помощи линейного коэффициента корреляции r-Пирсона было показано, что встречаемость микроядер в эритроцитах Danio rerio коррелировала со значением дозы ионизирующего излучения, воздействовавшего на организм (r=0.9245, p < 0.05), встречаемость ядерных протрузий также коррели- ровала со значением дозы (r=0.9062, p < 0.05). В то же время встречаемость межъядерных хроматиновых мостов и гантелевидных ядер от дозы не зависела (r=0.0642 и r=0.5259, соответственно). Значения частоты встречаемости микроядер достоверно отличались от контрольных в группах особей, облученных в дозах 4,0 Гр (p=0,0245), 6,0 Гр (p=0,0043) и 8,0 (p=0,0079) Гр. Значения частоты встречаемости ядерных протрузий также достоверно отличались от контрольных в группах особей, облу- ченных в дозах 4,0 Гр (p=0,0275), 6,0 Гр (p=0,0088), 8,0 Гр (p=0.0317). Обсуждение. Danio rerio - широко распространенная пресноводная рыба, населяющая внутрен- ние водоемы Бутана, Индии, Китая, Бангладеш. В ряде работ Danio rerio успешно применялись для иден- тификации тератогенов, установления механизмов воздействия токсинов, а также определения тканес- пецифичного ответа на них [5-7]. Мы предположили возможность использования Danio rerio и как моде- ли для радиобиологических исследований, в частности, как лабораторной in vivo тест-системы для оценки эффективности радиосенсибилизаторов или радиопротекторов. В качестве вероятных экс- пресс-маркеров лучевого воздействия мы предположили ядерные аномалии, формирующиеся в клет- ках после воздействия ионизирующего излучения и внесения двуцепочечных разрывов в структуру ДНК. В эритроцитах Danio rerio обнаруживались 4 типа ядерных аномалий после воздействия ионизи- рующего излучения: микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, гантелевидные ядра. При этом корреляция частоты встречаемости с дозой была выявлена только для двух видов карио- патологии: микроядер и ядерных протрузий. Мы предполагаем, что межъядерные хроматиновые мосты редко идентифицировались в клетках во всех группах экспериментальных животных в связи с тем, что в ходе постлучевых митозов мосты претерпевают циклы «разрыв-слияние-мост», в связи с чем зачастую могут формировать ядерные протрузии. Гантелевидные ядра, вероятно, представляют собой поли- морфную группу ядерных аномалий, чье происхождение до сих пор окончательно не выяснено. Мы предполагаем, что их формирование в эритроцитах Danio rerio может носить характер, не связанный с воздействием ионизирующего излучения. Встречаемость микроядер и протрузий достоверно отличалась от контрольных значений только при воздействии в дозах 4, 6 и 8 Гр. Это указывает на крайнюю радиорезистентность рыб Danio rerio, что согласуется с полученными ранее данными по расчету полулетальной дозы ионизирующего излучения для данного организма [8, 9]. Выводы. Danio rerio можно использовать в качестве модельного организма для радиобиологиче- ских исследований, однако, учитывая их крайнюю радиорезистентность, идентификация таких марке- ров как микроядра и ядерные протрузии в эритроцитах периферической крови позволит идентифици- ровать лучевое воздействие только в дозах, превышающих 4 Гр.
×

About the authors

A. A Pankratov

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

M. P Privalov

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

A. A Livanova

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

  1. Kato, T.A. Human Lymphocyte Metaphase Chromosome Preparation for Radiation-Induced Chromosome Aberration Analysis / T.A. Kato // Methods Mol. Biol. - 2019. - №1984. - P.1-6.
  2. Fenech, M. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells / M. Fenech [et al.] // Mutagenesis. - 2011. - Vol.26, №1. - P.125-132.
  3. Kravtsov, V. Nuclear Abnormalities of Lymphocytes as the Simplest Markers for Bioindication Test in Case of Mass Casualty Events Involving Radiation Exposure / V. Kravtsov [et al.] // Emergency Medicine: Open Access. - 2017. - Vol.7. - P.356.
  4. Kravtsov, V.Y. Tailed nuclei and dicentric chromosomes in irradiated subjects / V.Y. Kravtsov [et al.] // Appl. Radiat. Isot. - 2000. - Vol.52, №5. - P.1121-1127.
  5. Gamse, J.T. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish / J.T. Gamse, D.A. Gorelick // Zebrafish. - 2016. - Vol.13, №5. - P.377-378.
  6. Gorelick, D.A. Use of reporter genes to analyze estrogen response: The transgenic zebrafish model / D.A. Gorelick [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2016. - №1366. - P.315-325.
  7. Lee, O. Transgenic fish systems and their application in ecotoxicology / O. Lee [et al.] // Crit. Rev. Toxicol. - 2015. - Vol.45, №2. - P.124-141.
  8. Есин, Т.А. Определение некоторых характеристик Danio rerio как in vivo модели для радиобиологических исследований / Т.А. Есин [и др.] // Известия Военно-медицинской академии. - 2019. - Т.38(1), прил. 1, часть 1. - С.156-159.
  9. Praveen Kumar, M.K. Molecular Cytogenetic Studies on the Toxic Effects of Gamma Radiation in Zebrafish and Common Carp: дис. - Goa University. - 2017. - 207 с.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2020 Pankratov A.A., Privalov M.P., Livanova A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 77760 от 10.02.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies