ВЫЯВЛЕНИЕ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ЯДЕРНЫХ АНОМАЛИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ DANIO RERIO В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Полный текст

Введение. Основной формой генотоксического воздействия ионизирующего излучения является внесение двуцепочечных разрывов в структуру ДНК. Некорректная репарация таких повреждений может привести к формированию аберрантных кольцевых и дицентрических хромосом. «Золотым стандар- том» среди методов биодозиметрии является метод учета перестроек метафазных хромосом [1]. Од- нако в условиях крупной техногенной катастрофы, характеризующейся значительным количеством по- раженных и необходимостью срочной диагностики поглощенной дозы у большого числа людей, эта техника окажется слишком энергоемкой в связи с длительным предварительным культивированием кле- ток. Поиск универсальных экспресс-маркеров лучевого воздействия на организм ведется до сих пор. После первого постлучевого митоза в клетках, содержащих дицентрические хромосомы, фор- мируются различимые на светооптическом уровне ядерные аномалии. Причиной их появления является неравномерное расхождение дицентриков к разным полюсам клетки в ходе анафазы. Так, при обо- соблении отдельной дицентричской хромосомы или ацентрического фрагмента формируются микро- ядра, известные также как тельца Хоуэлла-Джолли [2]. Микроядра являются наиболее изученной фор- мой кариопатологии и используются как маркер для биодозиметрических исследований в рамках мик- роядерного теста. Если две центромеры в составе дицентрической хромосомы оказываются направле- ны к противоположным полюсам в ходе анафазы митоза, то между дочерними ядрами формируется хроматиновый мост, который также различим в световой микроскоп. При разрыве таких мостов обра- зуются ядра, содержащие протрузии, или «хвостатые» ядра. Наименее изученной формой кариопато- логии являются гантелевидные ядра, представляющие собой сближенные дочерние ядра делящейся клетки, соединенные толстой перемычкой [3]. Все указанные аномалии были обнаружены в ряде биологических объектов, а также в крови пе- риферической крови ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС [4] и могут быть использованы как маркеры воздействия ионизирующего излучения. Danio rerio, известная в иностранной литературе как Zebrafish, представляет собой небольшую пресноводную рыбу, которая неоднократно использовалась в генетике и молекулярной биологии как модельный объект. В последнее время данный вид довольно широко используется как модельный орга- низм и для экотоксикологических исследований по нескольким причинам: прозрачность эмбрионов и мальков, высокая функциональная гомология генома с геномом человека, относительно быстрое раз- множение и большое потомство, дешевизна. Мы предполагаем возможность использования аквариум- ной рыбы Danio rerio в качестве модели для радиобиологических исследований. Целью настоящего исследования было установить значения частот встречаемости ядерных ано- малий четырех видов (микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, гантелевид- ные ядра) в эритроцитах периферической крови Danio rerio в зависимости от дозы ионизирующего из- лучения. В дальнейшем идентификация наиболее специфичного клеточного маркера позволит исполь- зовать эритроциты Danio rerio как тест-систему для оценки эффективности радиопротекторов и радио- сенсибилизаторов. Материалы и методы. Для исследования использовались пресноводные аквариумные рыбы Danio rerio мужского и женского пола. Размеры варьировались в пределах 2,5-3,0 сантиметров. Рыбы были получены из коммерческого источника и поддерживались в условиях нормальной аквакультуры. Исполь- зовались аквариумы, снабженные фильтрами и аэраторами воды. Температура воды в аквариумах поддерживалась на постоянном уровне (22,0 ± 0,5ºС), кормление рыб осуществлялось 2 раза в день. Для определения частоты встречаемости различных ядерных аномалий в эритроцитах перифери- ческой крови 63 особи Danio rerio были подвергнуты воздействию рентгеновского излучения в дозах 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 Гр. Облучение проводилось с помощью рентгеновского аппарата РУМ-17. После облучения особи возвращались в первоначальные условия. Через 48 часов после облучения пе- риферическую кровь забирали из хвостовой вены путем обрезания хвостового плавника. Кровь наноси- ли на чистое предметное стекло и распределяли ровным слоем. На одну особь производился анализ двух мазков. Кровь фиксировали в 96% этиловом спирте в течение 25-30 минут до полного высушивания. Затем мазки окрашивались азур II эозином по методу Романовского (краситель «Диахим-ГемиСтейн- Р»). Полученные мазки из каждой группы облученных рыб были подвергнуты ранжированию с присвое- нием слепых номеров. Микроскопия полученных мазков крови производилась на микроскопе «Leica DM-1000» при увеличении 1000х. В каждом мазке подсчитывали 3000 клеток, при этом фиксировали ко- личество обнаруженных микроядер, межъядерных хроматиновых мостов, ядерных протрузий и гантеле- видных ядер в эритроцитах рыб каждой группы. Статистическая обработка данных производилась с по- мощью пакета Graph Prism 8.0. Достоверность отличий средних в каждой группе от контрольной выявля- лись при помощи критерия Манна-Уитни. Корреляция частоты встречаемости отдельных ядерных ано- малий с дозой ионизирующего излучения выявлялась при помощи линейного коэффициента корреля- ции r-Пирсона. Результаты. Через 48 часов после воздействия рентгеновского излучения в разных дозах (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 Гр) в эритроцитах периферичесской крови Danio rerio обнаруживались ядер- ные аномалии четырех типов: микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, ган- телевидные ядра. Результаты подсчета встречаемости всех видов ядерных аномалий в эритроцитах представлены в таблицеꢀ 1. Примечание: средняя ± стандартная ошибка среднего, * - значения, достоверно отличающиеся от контрольных, критерий Манна-Уитни, p < 0,05. На рисунке 1 отображены зависимости встречаемости ядерных аномалий разных типов в эритро- цитах Danio rerio от дозы рентгеновского излучения. При помощи линейного коэффициента корреляции r-Пирсона было показано, что встречаемость микроядер в эритроцитах Danio rerio коррелировала со значением дозы ионизирующего излучения, воздействовавшего на организм (r=0.9245, p < 0.05), встречаемость ядерных протрузий также коррели- ровала со значением дозы (r=0.9062, p < 0.05). В то же время встречаемость межъядерных хроматиновых мостов и гантелевидных ядер от дозы не зависела (r=0.0642 и r=0.5259, соответственно). Значения частоты встречаемости микроядер достоверно отличались от контрольных в группах особей, облученных в дозах 4,0 Гр (p=0,0245), 6,0 Гр (p=0,0043) и 8,0 (p=0,0079) Гр. Значения частоты встречаемости ядерных протрузий также достоверно отличались от контрольных в группах особей, облу- ченных в дозах 4,0 Гр (p=0,0275), 6,0 Гр (p=0,0088), 8,0 Гр (p=0.0317). Обсуждение. Danio rerio - широко распространенная пресноводная рыба, населяющая внутрен- ние водоемы Бутана, Индии, Китая, Бангладеш. В ряде работ Danio rerio успешно применялись для иден- тификации тератогенов, установления механизмов воздействия токсинов, а также определения тканес- пецифичного ответа на них [5-7]. Мы предположили возможность использования Danio rerio и как моде- ли для радиобиологических исследований, в частности, как лабораторной in vivo тест-системы для оценки эффективности радиосенсибилизаторов или радиопротекторов. В качестве вероятных экс- пресс-маркеров лучевого воздействия мы предположили ядерные аномалии, формирующиеся в клет- ках после воздействия ионизирующего излучения и внесения двуцепочечных разрывов в структуру ДНК. В эритроцитах Danio rerio обнаруживались 4 типа ядерных аномалий после воздействия ионизи- рующего излучения: микроядра, ядерные протрузии, межъядерные хроматиновые мосты, гантелевидные ядра. При этом корреляция частоты встречаемости с дозой была выявлена только для двух видов карио- патологии: микроядер и ядерных протрузий. Мы предполагаем, что межъядерные хроматиновые мосты редко идентифицировались в клетках во всех группах экспериментальных животных в связи с тем, что в ходе постлучевых митозов мосты претерпевают циклы «разрыв-слияние-мост», в связи с чем зачастую могут формировать ядерные протрузии. Гантелевидные ядра, вероятно, представляют собой поли- морфную группу ядерных аномалий, чье происхождение до сих пор окончательно не выяснено. Мы предполагаем, что их формирование в эритроцитах Danio rerio может носить характер, не связанный с воздействием ионизирующего излучения. Встречаемость микроядер и протрузий достоверно отличалась от контрольных значений только при воздействии в дозах 4, 6 и 8 Гр. Это указывает на крайнюю радиорезистентность рыб Danio rerio, что согласуется с полученными ранее данными по расчету полулетальной дозы ионизирующего излучения для данного организма [8, 9]. Выводы. Danio rerio можно использовать в качестве модельного организма для радиобиологиче- ских исследований, однако, учитывая их крайнюю радиорезистентность, идентификация таких марке- ров как микроядра и ядерные протрузии в эритроцитах периферической крови позволит идентифици- ровать лучевое воздействие только в дозах, превышающих 4 Гр.

Об авторах

А. А Панкратов

ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Санкт-Петербург, Россия

М. П Привалов

ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Санкт-Петербург, Россия

А. А Ливанова

ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Санкт-Петербург, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы