ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF CONIFEROUS EXTRACT

Full Text

Введение. Коринебактерии, выделенные из клинических образцов, за исключением C. diphtheriae, ранее считались непатогенными. Однако недавние исследования показали, что некоторые штаммы, такие как C. xerosis, могут быть вовлечены в инфекционный процесс. Было установлено, что C. xerosis вы- зывает проблемы у людей с ослабленным иммунитетом и был изолирован от людей с эндокардитом [[1]. Исследования показали наличие C. xerosis в ранах [2], в абсцессах молочной железы [3] и в протезах 4]. Кроме того, эта бактерия поражала людей, которые долгое время находились в больницах, а также людей с конъюнктивитом или септицемией [5]. Часто недифтерийные коринебактерии были вовлечены в инфекции центрального венозного катетера у пациентов с детской онкологией [6] и были выделены из катетера у ряда пациентов. Другие коринебактерии, такие как C. flavescens, также были вовлечены в инфекционный процесс при кожных инфекциях [7, 8]. Исследования чувствительности к антибиотикам показали, что коринебактерии, в том числе C. xerosis, развивают устойчивость к антибиотикам. Показано, что изоляты C. xerosis из абсцессов молочной железы устойчивы к клиндамицину [3]. В более ранних исследованиях было обнаружено, что C. xerosis устойчивы к клиндамицину, эритромицину, азитромицину и ципрофлоксацину [2]. Рядом исследователей показано, что некоторые растения и их части обладают антимикробными, противогрибковыми, противовирусными и противовоспалительными свойствами [9, 10]. Действительно, препараты сосновой и еловой хвои использовались в качестве средств лечения простудных заболеваний и при дефиците железа и витаминов [11]. Интересно, что были проведены исследования по изучению антибактериальных свойств природных веществ в косметических продуктах, таких как дезодоранты [12, 13] и ополаскиватели для рта [14]. Косметические продукты, которые используются повторно, такие как кремы для лица и тушь для ресниц, могут быть загрязнены бактериями [15, 16], а консерванты, исполь- зуемые в этих продуктах, могут быть токсичными или вызывать гиперчувствительность у людей. В ответ на эти вопросы отказ от использования синтетических химических веществ в качестве консервантов в кос- метических продуктах привел к тому, что исследователи изучают природные вещества в качестве дос- тойной альтернативы [17, 18]. Материалы и методы. В работе использован ЭХД - комплексное вещество, полученное из иголок сосновых и еловых деревьев. Он содержит производные хлорофилла, каротиноиды, витамины А, Е и К, фитостеролы, полипренолы, сквален, в том числе природные антибиотики (фитонциды). Концентрация основного раствора ЭХД составляла 500 мкг/мл. Для проверки чувствительности бактерий к ЭХД в дан- ном исследовании использовали метод серийных разведений в бульоне и в агаре. Антибактериальное действие ЭХД проверяли на штаммах C. xerosis и C. flavescens, выделенных из слезных протоков больных. Для проведения исследования основной раствор ЭХД разбавляли путем двукратного разбавления до получения рабочих растворов с концентрациями 250, 125, 60, 30, 15, 7 и 3,5 мкг/мл. Концентрации ЭХД, используемые для тестирования чувствительности C. xerosis и C. flavescens, были следующими: 500, 250, 125, 60, 30, 15, 7 и 3,5 мкг/мл. В исследование были включены три клинических штамма C. xerosis и один штамм C. flavescens. Культуры выращивали на кровяном агаре при температуре 37°С. Плотность иноку- лята каждого штамма была стандартизирована с помощью стандарта мутности 0,5 по Макфарланду. 5Суспензия имела конечную концентрацию около 5×10 КОЕ/мл. Также был включен контроль, не содер- жащий ЭХД. Эту процедуру проводили для каждого из изолятов. По 1 мл инокулята добавляли в пробир- ки, содержащие ЭХД, инкубировали при 37°С в течение 20 часов. Эксперимент проводился в трех по- вторениях. Для проведения эксперимента на плотной питательной среде использовали чашки Петри с кровяным агаром, на поверхность которых наносили суспензию из каждого штамма бактерий в концентрации 61×10 КОЕ/мл и распределяли ее по поверхности агаровой пластины. Затем на высушенную поверх- ность агара наносили 3 мкл каждой концентрации исследуемого вещества (ЭХД). Агаровые пластины помещали в термостат при 37°С на 20 часов. Для изучения временного фактора при воздействии ЭХД на бактерии готовили разведения 3,5; 7; 15; 30; 125 и 500 мкг/мл в бульоне, в каждую пробирку инокулировали 0,5 мл бактериальной суспензии (C. 4xerosis и C. flavescens, приготовленные в концентрации 1×10 ). Бактерии подвергались воздействию ЭХД в течение 30 минут, 1, 3 и 24 часов. В качестве контроля была также включена пробирка, не содержащая ЭХД. В конце каждой временной точки образец высевали на плотную питательную среду и инкубирова- ли в течение 48 часов. Регистрировали количество колоний, которые росли при каждом разведении и в каждый момент времени. Результаты исследования. Самая низкая концентрация ЭХД, которая полностью подавляла визуаль- ный рост бактерий (отсутствие помутнения), была зарегистрирована в качестве минимальной ингиби- рующей концентрации (МИК). Антибактериальное действие ЭХД против C. xerosis и C. flavescens оцени- вали с помощью теста на разведение в бульоне и агарового метода. При использовании теста на раз- ведение в бульоне МИК ЭХД для C. xerosis находилась в диапазоне от 15 до 60 мкг/мл, в то время как МИК ЭХД для C. flavescens, составляла 60 мкг/мл (табл. 1). МИК ЭХД для C. xerosis на плотной питательной среде находился в диапазоне от 60 до 125 мкг/мл, в то время как МИК для C. flavescens составляла 125 мкг/мл (табл. 2). Антибактериальное действие ЭХД против C. xerosis и C. flavescens после воздействия в течение 30 ми- нут и 1, 3 и 24 часов представлено в таблице 3. После 30-минутного воздействия 500 мкг/мл ЭХД рост всех штаммов C. xerosis был полностью подавлен. ЭХД не подавлял рост этого штамма при 125, 30, 7 и 3,5 мкг/мл, однако наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. Воздей- ствие ЭХД в течение 30 минут не подавляло рост C. flavescens ни в одной из концентраций (500, 125, 30, 7 и 3,5 мкг/мл), хотя наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. Рост всех штаммов C. xerosis подавлялся при воздействии на бактерии 500 и 125 мкг/мл ЭХД в течение 1 часа. При более низких концентрациях (30, 7 и 3,5 мкг/мл) наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. Рост C. flavescens подавлялся при 500 мкг/мл ЭХД через 1 час, а также наблю- далось существенное снижение количества колоний C. flavescens при 125 мкг/мл ЭХД по сравнению с контролем. После 3-часового воздействия ЭХД рост всех штаммов C. xerosis и C. flavescens был полно- стью ингибирован при 500 и 125 мкг/мл. Рост одного штамма C. xerosis также ингибировался при 30 мкг/мл, и наблюдалось снижение числа колоний для этого штамма на 7 и 3,5 мкг/мл по сравнению с контролем. Рост C. flavescens не ингибировался при более низких концентрациях (30, 7 и 3,5 мкг/мл), хотя наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. Воздействие ЭХД в те- чение 24 часов приводило к ингибированию роста при всех концентрациях (500, 125, 30, 7 и 3,5 мкг/мл) для всех штаммов C. xerosis и C. flavescens. Обсуждение. Результаты, полученные в данном исследовании, показали, что ЭХД является эффек- тивным бактерицидным средством против C. xerosis и C. flavescens, выделенных из клинических образцов (табл.1-3). Снижение бактериального загрязнения в широко используемых косметических продуктах без добав- ления веществ, вызывающих бактериальную устойчивость, является важной целью, поскольку предыду- щие исследования показали, что устойчивость к антибиотикам у Corynebacterium spp является постоян- ной проблемой [12, 15, 16]. Действительно, исследователи обнаружили, что некоторые Corynebacterium spp. проявляют одновременную резистентность к трем группам антибиотиков. Оппортунистическая ин- фекция, обусловленная Corynebacterium spp, показала устойчивость к макролидам, линкозамидам, тетрациклинам и фторхинолонам [19]. В проведенных экспериментах штаммы C. xerosis подавлялись при воздействии низких уровней ЭХД (от 15 до 60 мкг/мл), тогда как антибактериальное действие на C. flavescens наблюдалось при несколь- ко более высоких уровнях, а именно 60 и 125 мкг/мл (табл.1-2). ЭХД также ингибировал рост C. xerosis и C. flavescens в различные моменты времени инкубации (табл. 3). Наиболее выраженный эффект на- блюдался через 24 ч (табл. 3), когда весь рост подавлялся при всех концентрациях (3, 5, 7, 30, 125 и 500 мкг/мл). Однако ЭХД ингибировал или снижал рост Corynebacterium spp. даже при меньшем времени экспозиции (табл. 3). Результаты этих исследований позволяют предположить, что ЭХД потенциально может быть применим для обеспечения альтернативы консервантам, используемым в настоящее время в косметических про- дуктах.

About the authors

V. V Rymar

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

D. A Unachev

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files