The use of liquid and gas chromatography in combination with mass spectroscopy and the method of capillary electrophoresis to study hydroxycinnamic acids in plants growing in Russia

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Гидроксикоричные кислоты (ГКК) и их производные являются представителями обширного класса фенилпропаноидов [1]. Изучение подходов к анализу фенольных соединений лекарственного растительного сырья (ЛРС), включенных в Государственную фармакопею Российской Федерации (РФ) XIV издания (70 наименований), показало, что наличие ГКК достаточно редко используется как для идентификации, так и для определения их количественного содержания [2]. Так, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) использован для идентификации ГКК в 10 фармакопейных статьях (ФС). Количественное же определение суммы ГКК представлено только в двух ФС [2]. Включенные в XIV издание Государственной фармакопеи РФ способы экстракции и спектрофотометрический метод позволяют определять только сумму биологически активных веществ (БАВ), поглощающих в аналитической области спектра.

Благодаря наличию фенольных гидроксилов ГКК обладают антиоксидантными свойствами, наряду с которыми проявляют бактериостатическое, противовоспалительное, антимикозное, радиопротекторное и противовирусное действие [3]. Таким образом, закономерен возрастающий интерес к поиску новых сырьевых источников, содержащих достаточные количества ГКК различного строения. Известно, что ГКК в растениях чаще всего содержатся в виде сложных эфиров с органическими кислотами. Однако отсутствие стандартных образцов (СО) эфиров ГКК и их изомерных форм приводило к необходимости предварительного гидролиза указанных соединений в извлечениях из растительного сырья, что значительно усложняло анализ. Получение СО ранее недоступных соединений позволяет в настоящее время идентифицировать не только общеизвестные ГКК, но и их изомеры, эфиры, гликозиды и т. д. Этому способствуют также развитие и совершенствование физико-химических методов, в частности высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая, как правило, позволяет обнаруживать ГКК в экстрактах растительных объектов без их предварительной тщательной очистки. Так, в последние годы надежно идентифицировать многие БАВ в растительном сырье, в том числе ГКК, позволяет метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) или сочетанием диодно-матричного и масс-спектрометрического детектирования (высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия с УФ-детектированием (ВЭЖХ-УФ/МС) с различными источниками ионизации) [4–7]. Значительно расширяет возможности изучения фенольных соединений применение таких современных методов анализа, как ультраэффективная жидкостная хроматография (УЭЖХ) и масс-спектрометрия высокого разрешения [8]. При отсутствии СО в методе ВЭЖХ или невозможности установления структуры соединений вышеописанными методами с достаточно высокой степенью достоверности возможна идентификация ГКК методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) по библиотеке масс-спектров, что позволяет значительно расширить их компонентный состав [9–11]. В ряде работ показана возможность идентификации ГКК методом капиллярного электрофореза (КЭ) [12, 13].

В обзоре проведен анализ опубликованных в отечественных периодических научных журналах материалов и материалов конференций за 15 лет. Представлены результаты исследований российских ученых. В цитируемых работах представлены результаты выбора условий извлечения и изучения содержания и структуры ГКК и их производных указанными выше методами около 200 видов растений, произрастающих или культивируемых в РФ, а также в растительном сырье, используемом для производства биологически активных добавок к пище (БАД) или растительных лекарственных препаратов.

Все вышесказанное может способствовать совершенствованию методов стандартизации растительного сырья по содержанию ГКК и поиску их новых перспективных источников.

Цель исследования — критический анализ и обобщение данных отечественной литературы по выбору условий извлечения и использования современных методов жидкостной и газовой хроматографии в сочетании с масс-спектроскопией, а также метода КЭ для изучения наличия и структуры ГКК и их производных в растениях, произрастающих на территории РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Результаты исследований российских ученых. Публикации в отечественных периодических научных журналах и материалы конференций за последние 15 лет. Методом исследования служил ретроспективный информационно-аналитический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методы ВЭЖХ-УФ/МС и ВЭЖХ/МС/МС

В рассмотренных работах на первых этапах исследований прежде всего обсуждались способы извлечения суммы фенольных соединений, которые отличаются большим разнообразием. ГКК извлекают, используя воду, метиловый и этиловый спирт различной концентрации при нагревании на водяной бане, применяя обработку в ультразвуковой (УЗ) ванне или настаивание в течение нескольких суток при комнатной температуре. В качестве примеров ниже приведены некоторые методики получения извлечений из растительного сырья.

БАВ измельченной травы тысячелистника обыкновенного (Achilléa millefólium L. сем. Asteraceae) экстрагировали горячей водой в конической колбе с обратным холодильником при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин [9].

Свежезамороженные плоды калины обыкновенной (Vibúrnum ópulus L. сем. Adoxaceae), собранные в Тамбовской, Тверской и Московской областях, экстрагировали водой дважды по 30 мин при 40 °C, затем 30 мин в УЗ-ванне [14].

БАВ из собранной в Воронежской области травы горца почечуйного (Persicaria maculosa Gray (синоним Polygonum persicaria L.) сем. Polygonaceae) экстрагировали спиртом метиловым 60 % на водяной бане в течение 2 ч [15].

Для определения ГКК в растительном сырье, используемом в производстве БАД и растительных препаратов, БАВ экстрагировали метанолом в течение 15 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником с последующей обработкой ультразвуком [16].

Для анализа листьев недоспелки копьевидной (Parasenecio hastatus (Cacalia hastata) L. сем. Asteraceae), произрастающей в Бурятии, сырье экстрагировали спиртом этиловым 70 % в УЗ-ванне (50 кГц, 40 мин, 35 °C) [7].

Полифенольные соединения травы колокольчика круглолистного (Campanula rotundifolia L. сем. Campanulaceae Juss.) сначала извлекали из измельченного сырья спиртом этиловым 70 % при нагревании на кипящей водяной бане под вакуумом в течение 1 ч, затем настаивали в течение 2 сут [17].

Для изучения ГКК травы володушки многожилковой (Bupleurum multinerve DC сем. Apiaceae) сначала сырье экстрагировали спиртом этиловым 70 % в ультразвуковой ванне в течение 30 мин при температуре 50 °C. Затем полученное извлечение центрифугировали и пропускали через мембранный фильтр [18].

При изучении травы пустырника пятилопастного (Leonurus quinquelobatus Gilib. сем. Lamiaceae), собранного в областях Центральной России, экстракцию сырья проводили спиртом этиловым 95 % при нагревании на водяной бане [4].

Описано применение кислотного гидролиза в сочетании с микроволновой экстракцией для извлечения фенольных кислот из травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L. сем. Hypericaceae). Выявлено, что при использовании в качестве экстрагента воды с добавлением 2 М раствора хлористоводородной кислоты оптимальными условиями являются мощность микроволнового излучения 500 Вт и нагревание при 70 °C в течение 20 мин [11].

При исследовании БАВ в свежих корнях и корневищах лапчатки белой (Potentilla alba L. сем. Rosaceae) сырье измельчали на шаровой мельнице в присутствии ацетона. Экстракт отделяли центрифугированием. Экстракцию повторяли еще дважды 80 % водным ацетоном при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 15 мин. Объединенные экстракты упаривали досуха в концентраторе при 45 °C и хранили при –20 °С [8].

В работе Ю.В. Загурской с соавт. показано, что важным этапом пробоподготовки при ВЭЖХ является отделение от экстрактов хлорофиллов, которые могут удерживаться обращенно-фазовым сорбентом колонки и искажать параметры хроматографирования. При изучении ГКК заготовленной в Сибири травы пустырника пятилопастного (Leonurus quinquelobatus Gilib. сем. Lamiaceae) хлорофилл отделяли методом твердофазной экстракции, пропуская экстракт через патрон «Диапак С16», заполненный обращенно-фазовым сорбентом [19].

Для получения экстрактов листьев жимолости синей (Lonicera caerulea subsp. altaica сем. Caprifoliaceae) измельченное сырье исчерпывающе экстрагировали спиртом этиловым 70 % на водяной бане. Охлажденный экстракт очищали от примесей гидрофильной природы методом твердофазной экстракции, пропуская через концентрирующий патрон «Диапак С16» (ЗАО «БиоХимМак») и промывая последовательно спиртом этиловым 70 % и затем 96 % [20].

БАВ из плодов растений рода Арония извлекали настаиванием в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты в течение 24 ч. Полученные извлечения очищали, пропуская через подготовленный (активированный пропусканием ацетона и 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты) насадочный картридж (патрон) «Диапак С18» до проскока первых окрашенных фракций [21].

Изучение других научных публикаций показало, что для идентификации и установления структуры отдельных ГКК извлечения из сырья получены, как правило, вышеописанными способами. Авторы оптимизировали процесс экстракции, используя индивидуальный подход к выбору как способа извлечения, так и экстрагента, температуры и времени экстракции в зависимости от исследуемого растения и вида сырья.

Некоторые авторы для повышения достоверности идентификации ГКК полученные извлечения дополнительно подвергали последовательной экстракции различными органическими растворителями и дальнейшему фракционированию. Так, траву пикульника двунадрезанного (Galeopsis bifida Boenn. сем. Lamiaceae) дважды экстрагировали спиртом этиловым 70 % (1 : 20) в УЗ-ванне при 45 °C. Извлечение отфильтровывали, концентрировали в вакууме до водного остатка и подвергали жидкофазной экстракции этилацетатом и н-бутанолом [22].

В полученных извлечениях ГКК идентифицировали с помощью масс-детекторов или масс-спектрометров, которые путем ионизации молекул исследуемых соединений и последующего разделения ионов в соответствии с их массовым числом (m/z) позволяли отнести эти соединения или их ионы к соответствующему классу соединений. Для сравнения использовали сопоставление полученных аналогичных характеристик с соответствующими СО или с данными MC-библиотеки [4–7].

В табл. 1–3 представлены результаты идентификации ГКК с помощью методов ВЭЖХ-УФ/МС и ВЭЖХ/МС/МС в исследованных видах растительного сырья. Для некоторых исследованных растений приведены результаты количественного определения, которые выполнены одновременно на тех же приборах для ВЭЖХ-анализа, дополнительно снабженных масс-спектрометрическими детекторами.

 

Таблица 1. Результаты идентификации и количественного определения ГКК методом ВЭЖХ — масс-спектрометрии в некоторых растениях, произрастающих в России

Table 1. Results of identification and quantitative determination of hydroxycinnamic acids by HPLC — mass spectrometry in some plants growing in Russia

Объект исследования, сырье, источник литературы	Содержание ГКК
Арония (Aronia) 5 видов, плоды [21]	См. табл. 3
Брокколи (спаржевая капуста) (Brassica oleracea L.), плоды [23]	1,2-дисинапилгентиобиозид, 1-синапил-2-ферулоилгентиобиозид, 1,2,2'-трисинапилгентиобиозид, 1,2'-дисинапил-2-ферулоилгентиобиозид
Будра плющевидная (Glechoma hederacea L.), трава [24]	Кофейная кислота
Володушка многожилковая (Bupleurum multinerve DC), трава [18]	5-О-кофеоилхинная, 3-О-кофеоилхинная, 5-О-п-кумароилхинная, 3,5-ди-О-кофеоилхинная, 4,5-ди-О-кофеоилхинная, 5-О-ферулоилхинная, 3-О-ферулоилхинная
Горец почечуйный (Persicaria maculosa S.F. Gray), трава [15, 25]	Хлорогеновая — 0,56 мг/г, криптохлорогеновая — 0,24 мг/г, 5 неидентифицированных производных ГКК — 1,31 мг/г в сумме
Горлюха ястребинковая (Pícris hieracioídes L.), трава [26]	n-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, феруловая
Калина обыкновенная (Viburnum opulus L.), плоды [14]	4 изомера кофеоилхинной кислоты — 96 % от суммы хлорогеновых кислот
Колокольчик круглолистный (Campanula rotundifolia), трава [17]	Хлорогеновая — 0,016 %, кофейная — 0,009 %, феруловая — 0,014 %, n-кумаровая — 0,019 %
Котовник мятный (Nepeta cataria L.), листья [6]	Кофейная, кофеилтартроновая, кафтаровая, цикориевая, фазеловая, розмариновая, кофеоилвинная, кофеоиляблочная
Крапива двудомная (Urtica dioica L.), трава [16]	Сумма ГКК — 2,51 % (3-КХК — 0,21 %, 5-КХК — 0,73 %, кофеоиляблочная кислота — 1,57 %)
Кровохлебка лекарственная (Sanquisorba officinalis L.), трава [27]	О-кофеоилхинная, 5-О-кофеоилхинная, 3-О-кумароилхинная
Лапчатка белая (Potentilla alba L.), корни и корневище [8]	n-кумароилвинная (изомер 1), n-кумароилвинная (изомер 2)
Лихнис халцедонский (Lychnis chalcedonica L.), трава [28]	5 изомеров хлорогеновой кислоты — в сумме 97,8 мг/100 г экстракта; кофейная — 15,0 мг/100 г; розмариновая — 1506,5 мг/100 г экстракта
Мать-и-мачеха (Tussilago farfara L.), листья [16]	Сумма ГКК — 5,92 % (5-КХК — 1,02 %, диКХК — 4,27 %)
Мята длиннолистная (Mentha longifolia L.), трава [29]	5 изомеров хлорогеновой кислоты — в сумме 97,8 мг/100 г экстракта; кофейная — 15,0 мг/100 г; розмариновая — 1506,5 мг/100 г экстракта
Недоспелка копьевидная (Parasenecio hastatus L.), листья [7]	См. табл. 2
Ортосифон тычиночный (Orthosiphon stamineus Benth), листья [16]	Сумма ГКК — 1,55 % (кафтаровая — 0,09 %, кофейная — 0,03 %, цикориевая — 0,28 %, розмариновая — 1,15 %)
Подсолнечник клубненосный (топинамбур) (Helianthus tuberosum L.), трава [30]	Кофейная, хлорогеновая, изохлорогеновая А, изохлорогеновая В, изохлорогеновая С, неохлорогеновая, кумароилхинная (изомер 1), кумароилхинная (изомер 2), феруловая, ферулоилхинная
Пикульник двунадрезанный (Galeopsis bifida Boenn.), трава [22]	3-О-кофеоилхинная, кофейная, фазеловая, лавандулифолиозид, вербаскозид (актеозид) — β-(3',4'-дигидроксифенил) этил-О-α-L-рамнопиранозил(1→3)-β-D-(4-O-кофеоил)-глюкопиранозид
Пустырник пятилопастной (Leonurus quinquelobatus Gilib.), 8 образцов из различных регионов РФ, трава [4]	Хлорогеновая — 3,2 мг/г, вербаскозид (актеозид)-кофеоил-глюкозил-рамнозил-тиразол — 4,5 мг/г, лавандулифолиозид (арабиозид вербаскозида) — 4,0 мг/г, неидентифицированные ГКК — 4,0 мг/г
Пустырник пятилопастной (Leonurus quinquelobatus Gilib.), трава, Западная Сибирь [19]	Кофеоилхинная (хлорогеновая), тетрозодипентозид кофеоилхинной кислоты, тетрозопентозид кофеоилхинной кислоты
Рябина обыкновенная (Sorbus aucuparia L.), плоды [5]	Хлорогеновая, кофейная, кумаровая, феруловая, коричная
Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.), трава [9]	Транскофейная — 0,72 %

Примечание. 3-КХК, 5-КХК — кофеоилхинные кислоты; диКХК — дикофеоилхинные кислоты.

 

Таблица 2. Хроматографические характеристики и содержание ГКК в листьях недоспелки копьевидной (Parasenecio hastatus) в фазу плодоношения

Table 2. Chromatographic characteristics and content of hydroxycinnamic acids in the leaves of the unripe lance-shaped (Parasencio hastatus) in the fruiting phase

Гидроксикоричная кислота	Время удерживания, мин	Найдено, мг/г
4-О-кофеоилхинная	4,75	1,26
5-О-кофеоилхинная	5,25	25,29
Кофейная	5,81	1,30
Эхинакозид	5,97	1,37
3-О-ферулоилхинная	6,57	0,52
Цикориевая	6,75	0,96
5-О-ферулоилхинная	6,93	0,89
1,5-ди-О-кофеоилхинная	7,32	0,43
3,4-ди-О-кофеоилхинная	7,62	1,38
3,5-ди-О-кофеоилхинная	8,04	21,12
4,5-ди-О-кофеоилхинная	8,35	0,97
3,4,5-три-О-кофеоилхинная	8,73	4,53
Сумма, мг/г		60,02

 

Таблица 3. Хлорогеновые кислоты (QCA) плодов видов рода Арония (Aronia) [21]

Table 3. Chlorogenic acids (QCA) of fruits of species of the genus Aronia [21]

Вид аронии	Доля изомеров в смеси, моль %			Сумма, мг /100 г*
	3QCA	5CQA	4CQA
Арония черноплодная (A. Melanocarpa)	71,9	13,3	14,7	0,341
Арония сливолистная (A. Prunifolia)	37,7	59,1	3,1	0,157
Арония Мичурина (A. Mitchurinii)	52,3	45,2	2,6	0,177
Деревья личного подворья**	42,5	53,5	2,9	н/о***

Примечание. * — в пересчете на цианидин-3-глюкозид хлорид; ** — среднее с 4 участков; *** — не определяли.

 

Анализ статей отечественных ученых показал, что все исследования по установлению структуры ГКК и их производных в исследуемых растениях проведены в основном на оборудовании производства Японии и США.

Ю.А. Медведевым с соавт. растения исследованы на жидкостном хроматографе «Agilent 1100 Series» (США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2 растворителей, автосемплером для ввода проб, термостатом, фотодиодно-матричным детектором и масс-детектором «Agilent LC/MSD» (TrapSL family, США). Исследования 115 видов растительного сырья, используемого в производстве БАДов и растительных препаратов в России, позволили авторам выделить из них 61 перспективный вид для дальнейшего изучения как содержащий значительные количества ГКК [16]. В табл. 1 в качестве таких примеров представлены трава крапивы двудомной, листья мать-и-мачехи и ортосифона тычиночного, произрастающих в РФ.

При анализе корневищ с корнями лапчатки белой (Potentilla alba L. сем. Rosaceae) (см. табл. 1) использована система УЭЖХ, объединенная с масс-спектрометром «Thermo Scientific QExactive Orbitrap 2.5», оснащенным источником нагретой электрораспылительной ионизации (HESI) [8].

ГКК травы володушки многожилковой (Bupleurum multinerve DC сем. Apiaceae) (см. табл. 1) идентифицированы методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим (ионизация электрораспылением), а также диодно-матричным детектированием (УВЭЖХ-ДМД-ИЭР-МС) на приборе «LCMS-8050» производства Shimadzu (США). Из 15 обнаруженных фенольных соединений 7 являются ГКК и их производными. 5 соединений идентифицированы впервые и представлены эфирами хинной кислоты и коричных кислот (кофейной, феруловой, кумаровой) [18].

Д.И. Оленниковым с соавт. проведен сравнительный анализ ГКК листьев недоспелки копьевидной (Cacalia hastata L. сем. Compositae) (см. табл. 1, 2) на TQ-масс-спектрометре «LCMS-8050» (Shimadzu, США). Показано, что кофеоилхинные кислоты являются доминантными компонентами. Концентрация 5-О-кофеоилхинной и 3,5-ди-О-кофеоилхинной кислот в одном из образцов достигала 25,3 и 21,1 мг/г соответственно, что составило 60,3 % от содержания идентифицированных соединений [7].

В табл. 3 приведено содержание изомеров хлорогеновой кислоты (QCA) в плодах некоторых видов рода Арония (см. табл. 1), культивируемых в Белгородской области. Состав экстрактов плодов различных видов аронии определен методом ВЭЖХ на хроматографе «Agilent 1200 Infinity» при использовании диодно-матричного детектирования и комбинации двух последовательно соединенных детекторов (диодно-матричного и масс-спектрометрического). Установлено, что плоды аронии черноплодной содержат наибольшее количество ГКК, среди которых преобладающим компонентом является 3QCA [21].

В качестве примера фракционирования и разделения приведены результаты идентификации индивидуальных БАВ листьев котовника мятного (Nepeta cataria L. сем. Lamiaceae) (см. табл. 1) методом колоночной хроматографии на силикагеле, обращенно-фазовом силикагеле и полиамиде (Sigma-Aldrich, США). На указанных сорбентах из водно-эфирного извлечения из исследуемого сырья выделено 31 соединение фенольной природы, из н-бутанольной фракции — 7 соединений, отнесенных к группе ГКК (фенилпропаноидов), строение которых было установлено на основании данных УФ-, ИК-, МС-, ЯМР-спектроскопии. Среди всех выделенных БАС листьев Nepeta cataria доминировали ГКК и их производные (16,60–27,47 мг/г). Основным компонентом являлась кофеоилтартроновая кислота, концентрация которой достигала 12,38–21,59 мг/г, что составляло 75–81 % от общего содержания фенилпропаноидов [6].

При использовании для подтверждения структуры ГКК масс-спектрометра одновременно определяли их количественное содержание с помощью микроколоночной ВЭЖХ с УФ-детектированием на приборе «Милихром А-02» марки «Эконова». Для анализа ГКК травы володушки многожилковой (Bupleurum multinerve DC сем. Apiaceae) использованы следующие условия: колонка «ProntoSIL-120-5-C18 AQ» (1 × 60 мм × 5 мкм); элюент А — 0,2 М раствор хлората лития в 2,5 мкМ растворе хлорной кислоты, элюент B — ацетонитрил. Суммарное содержание фенилпропаноидов составило 9,53 мг/г с преобладанием 5-О-кофеоилхинной (6,60 мг/г) и 3,5-ди-О-кофеоилхинной кислот — 1,58 мг/г (см. табл. 2) [18].

При идентификации ГКК в траве пикульника двунадрезанного (Galeopsis bifida Boenn. сем. Lamiaceae) на хромато-масс-спектрометре «LSMS-8040» (Shimadzu, Япония) с тройным квадрупольным масс-анализатором одновременно определено их количественное содержание методом микроколоночной ВЭЖХ. Содержание компонентов рассчитано по градуировочным графикам, построенным с применением коммерческих образцов СО (3-О-кофеоилхинная кислота, кофейная кислота, вербаскозид) и выделенных образцов соединений с чистотой 95 % (фазеловая кислота, лавандулифолиозид) (см. табл. 1) [22].

ГКК травы пустырника пятилопастного (Leonurus quinquelobatus Gilib. сем. Lamiaceae), собранной в Западной Сибири, исследовали на жидкостном хроматографе «Agilent 1200 SL» (с диодно-матричным детектором) и гибридном квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре «micrOTOFQ» (Bruker) [19]. Идентификацию ГКК и их производных в траве пустырника пятилопастного, собранного в областях Центральной России, проводили методами ВЭЖХ-МС/МС и ВЭЖХ-УФ/МС. Использовали систему ВЭЖХ «Agilent 11000» (Agilent Technologies, США) со спектрофотометрическим диодно-матричным детектором «Agilent 11000 Series Diode Array», времяпролетным масс-селективным детектором «Agilent 6200 TOF LC/MC» c ионизацией распылением и масс-детектором «Agilent 6410» (тройной квадруполь) [4].

Е.А. Виницкой идентифицированы ГКК в траве зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L. сем. Hypericaceae) и траве эхинацеи пурпурной (Echinácea purpúrea L. сем. Asteraceae) на жидкостном хрoматoграфе «LC-20 Prominence» (Shimadzu, Япония) со спектрофотометрическим детектором на основе диодной матрицы «SPD-M20A» и квадрупольном масс-спектрометре «LCMS-2010EV» посредством сравнения времен удерживания, УФ-спектров и МС-спектров определяемых соединений с аналогичными характеристиками СО. Количественное содержание ГКК в исследуемом сырье устанавливали методом ВЭЖХ-ДМД (табл. 4) [11].

 

Таблица 4. Параметры идентификации и количественное содержание ГКК в водно-спиртовых экстрактах в системе ВЭЖХ-ДМД-МС [11]

Table 4. Identification parameters and quantitative content of HCA in aqueous-alcoholic extracts in the HPLC-DMD-MS system [11]

Кислота	tR, мин	m/z	λmax, нм	мг/г
Зверобой продырявленный (трава)
Неохлорогеновая	6,8	352,9	320	2,30
Хлорогеновая	8,6	352,9	320	1,15
Эхинацея пурпурная (трава)
Кафтаровая	7,8	310,9	327	4,90
Хлорогеновая	8,6	352,9	320	0,29
Кофейная	9,3	178,8	326	0,23
Цикориевая	16,2	472,9	327	15,00
Феруловая	17,1	193,1	328	–

 

Хроматографическое определение ГКК в ЛРС сем. Яснотковые (Lamiaceae): шалфее лекарственном (Salvia officinalis L.), чабреце ползучем (Thymus serpyllum L.), душице обыкновенной (Origanum vulgare L.) и мелиссе лекарственной (Melissa officinalis L.), выполнено с использованием сочетания системы ВЭЖХ «LC-20 Prominence» (Shimadzu, Япония) со спектрофотометрическим детектором на основе диодной матрицы «SPD-M20A» и масс-спектрометрическим детектором «LCMS-2010EV». БАВ при МС-детектировании ионизировали электрораспылением. ГКК на хроматограммах идентифицированы посредством сравнения полученных характеристик испытуемых и СО (табл. 5) [31].

 

Таблица 5. Результаты идентификации ГКК в лекарственных растениях [31]

Table 5. Results of identification of GCA in medicinal plants [31]

ГКК	Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.)	Чабрец ползучий (Thymus serpyllum L.)	Душица обыкновенная (Origanum vulgare L.)	Мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.)
Розмариновая	+	+	+	+
Цикориевая	+	–	–	–
Кафтаровая	–	–	–	+
3-О-кофеоилхинная	–	+	+	–
4-О-кофеоилхинная	–	+	–	–
5-О-кофеоилхинная	–	+	–	–
3,5-дикофеоилхинная	–	+	–	–

 

Изученные образцы содержат кофейную (0,19–0,62 мг/г) и розмариновую кислоты (4–23 мг/г). Наибольшее количество розмариновой кислоты содержит душица обыкновенная (23 мг/г) [31].

С использованием метода ВЭЖХ-МС изучена изменчивость в высотном градиенте индивидуально-группового состава ГКК природной популяции жимолости синей (Lonicera caerulea subsp. altaica сем. Caprifoliaceae) Горного Алтая. Система для ВЭЖХ-МС включала жидкостный хроматограф «Agilent 1200» (с диодно-матричным детектором) и гибридный квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения серии «micrOTOF-Q» (Bruker). Установлено, что основными компонентами экстрактов из различных органов растения независимо от высоты произрастания были хлорогеновая и дикофеоилхинная кислоты. В то же время авторы отмечают, что максимальное накопление хлорогеновой кислоты наблюдалось на высоте 1550 м над уровнем моря при одновременном минимальном содержании дикофеоилхинной кислоты. При сборе образцов сырья на участках ниже и выше по высотному профилю содержание хлорогеновой кислоты в образцах уменьшалось, а дикофеоилхинной кислоты — увеличивалось [20].

Газовая хромато-масс-спектрометрия

Достоверную информацию о строении БАВ позволяет получить метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ/МС). Этим методом (с применением триметилсилильных производных) определено содержание розмариновой, кофейной и хлорогеновой кислот в листьях 14 видов сем. Boraginaceae и розмариновой кислоты в листьях 45 видов сем. Lamiaceae, произрастающих в естественных условиях на территории европейской части России и в условиях интродукции (Санкт-Петербург). БАВ из исследуемых листьев извлекали, выдерживая сырье в мeтaнoлe пpи комнатной температуре в тeчeниe 24 ч в виалах c завинчивающимися крышками. Метанольное извлечение упаривали на роторном испарителе. B виалы с извлечением добавляли БСТФА (триметилсилильный реагент — [N,O-бuc-(триметилсилил) трифторацетамид]) и выдерживали 15 мин пpи температуре 100 °C в специальном термоблоке. БАВ разделяли на хромато-масс-спектрометре фирмы «Agilent» «Maestro 7820» с масс-селективным детектором «Agilent 5975 D» на капиллярной колонке «AgilentHP-5MS». Программа: 70-6°/мин-325° (50 мин), газ-носитель — гелий. Температура испарителя 300 °C, деление потока при вводе проб 1 : 20. Посредством сравнения полученных масс-спектров с данными MC-библиотеки NIST 2011 в исследуемых образцах идентифицированы розмариновая, кофейная и хлорогеновая кислоты [10, 32].

Розмариновая кислота обнаружена во всех 14 исследованных видах сем. Boraginaceae, кофейная кислота — в 11 видах, хлорогеновая кислота — только в 8 видах. Наибольшее количество ГКК найдено в незабудке редкоцветковой (Myosotis spasiflora Porl.) — 524 900 ppm, пупочнике весеннем (Ompalodes verna Moench) — 4390 ppm, бруннере крупнолистной (Brunnera macrophylla (Adams) I.M. Jihhnst.) — 5000 ppm [32]. В исследованных 45 видах растений сем. Lamiaceae розмариновая кислота обнаружена только в 18 видах, причем ее содержание в большей степени характерно для представителей подсем. Nepetiodeae. Установлено, что у подавляющего числа исследованных видов растений содержание розмариновой кислоты возрастает в период от цветения к плодоношению. Значительные количества розмариновой кислоты содержат мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.) — до 56 000 ppm; тимьян ползучий (Thymus serpyllum L.) — 32 500 ppm; душица обыкновенная (Origanum vulgare L.) — 27 000 ppm; монарда дудчатая (Monarda fistulosa L.) — 29 000 ppm; мята перечная (Mentha piperita L.) — 17 000 ppm; пахучка обыкновенная (Clinopodium vulgare L.) — 17 000 ppm [10].

В водных экстрактах травы тысячелистника обыкновенного (Achilléa millefólium сем. Asteraceae) методом ВЭЖХ-УФ-ДМД по времени удерживания и характеристикам УФ-спектров идентифицирована только транскофейная кислота (см. табл. 1). Для получения информации о структуре остальных неидентифицированных соединений в экстрактах травы тысячелистника обыкновенного использован метод ГХ-МС. Полученные извлечения предварительно пропускали через картридж «Диапак С18» (Россия). Затем ацетонитрилом исчерпывающе элюировали из них фенольные соединения. Элюат сушили в токе азота, осадок растворяли в ацетонитриле. К аликвоте полученного раствора добавляли БСТФА, выдерживали при 80 °C в термостате в течение 30 мин. Триметилсилилпроизводные фенольных соединений идентифицированы с БСТФА с помощью библиотеки NIST0S7 по характерным m/z как 4-О-кофеоилхинная, 3-О-кофеоилхинная, 5-О-кофеоилхинная, 3,4-О-дикофеоилхинная, 3,5-О-дикофеоилхинная и 4,5-О-дикофеоилхинная кислоты [9].

Методом ГЖХ/МС исследованы ГКК некоторых видов растений рода Тимьян (Thymus). Для этого измельченное воздушно-сухое сырье помещали в виалы «Agilent», приливали раствор внутреннего стандарта (тридекана в гексане) и «Supelco 3-3033», 14 % раствор трихлорида бора в спирте метиловом (метилирующие агенты) и выдерживали в течение 8 ч в герметично закрытой виале при температуре 65 °C (в этих условиях метилируются все свободные органические кислоты, в том числе и ГКК). Полученное извлечение сливали из виалы и разбавляли водой. Образовавшиеся метиловые эфиры извлекали хлористым метиленом и хроматографировали на газожидкостном хроматографе «Agilent Technologies 6890» с масс-спектрометрическим детектором «5973N» на капиллярной хроматографической колонке «INNOWax» (Agilent Technologies, Inc.). Метиловые эфиры ГКК идентифицированы посредством сравнения с данными библиотеки масс-спектров NIST0S5 и WILLEY2007 с помощью программ для идентификации AMDIS и NIST. Количественное содержание индивидуальных ГКК определено методом внутреннего стандарта. Для детального изучения состава и содержания фенольных соединений применяли также метод ВЭЖХ. Пики идентифицировали по времени удерживания с соответствующими СО или посредством сравнения УФ-спектров с базой данных (табл. 6) [33].

 

Таблица 6. Содержание ГКК в сырье растений рода Тимьян (Thymus) [33]

Table 6. Content of HCA in raw materials of plants of the genus Thyme (Thymus) [33]

Растение	Содержание ГКК, мг/кг
	кофейная	n-кумаровая	феруловая	изоферуловая	розмариновая
Тимьян Палласа (Thymus pallasianus Heinr. Braun)	52,7	–	85,1	45,9	3016,0
Тимьян меловой (Thymus cretaceus Klok. еt Schost.)	74,4	–	150,6	–	10202,5
Тимьян ползучий (Thymus serpýllum L.)	77,9	85,6	326,5	59,9	2246,2
Тимьян блошиный (Thymus pulegioides L.)	80,2	260,1	274,7	–	14351,7
Тимьян Маршалла (Thymus marchalianii Willd.)	58,4	40,1	303,1	–	5740,7
Тимьян двуликий (Thymus dimorphus Klok. еt Shost.)	93,9	–	240,9	–	2343,4
Тимьян Черняева (Thymus tschernjajevii. Кlok. et Shost.)	197,8	116,7	546,8	–	7885,6

 

В аналогичных условиях были получены и проанализированы извлечения из собранной в период массового цветения травы шалфея гарминового (Salvia horminum L. сем. Lamiaceae), показавшие наибольшее содержание n-кумаровой (834,87 мг/кг) и феруловой (389,94 мг/кг) кислот [34].

В траве кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L. сем. Rosaceae), произрастающей в Республике Бурятия, методом ВЭЖХ-ДМД-ИЭР-МС обнаружены 4-О-кофеоилхинная, 5-О-кофеоилхинная и 3-О-кумароилхинная кислоты [27].

Таким образом, установлено: метод газовой хроматографии требует предварительной дериватизации фенольных компонентов извлечений из растительного сырья, что значительно усложняет и удлиняет процедуру пробоподготовки. Однако метод заслуживает внимания при невозможности идентификации и установления структуры ГКК и их производных с помощью метода ВЭЖХ с масс-детектированием. Следует также отметить, что не лишен некоторых недостатков и используемый для идентификации ГКК метод ВЭЖХ. Так, с помощью метода ВЭЖХ сложно анализировать ароматические кислоты ввиду высоких и в то же время близких значений полярности. В связи с этим требуется использовать специальные колонки и сложные схемы градиента.

Метод капиллярного электрофореза (КЭ)

При наличии широкого ассортимента СО с целью предварительной идентификации ГКК и их производных в исследуемом растительном сырье возможно использование метода КЭ [12]. По сравнению с методом ВЭЖХ метод КЭ обладает более высокими параметрами эффективности, и его преимущества заключаются в возможности определения малых количеств вещества, экспрессности проведения анализа, малом расходе реактивов (микролитры) и высокочистых растворителей, простой пробоподготовке, надежной работе капилляра с экономичными водными буферами. КЭ не требует насосов высокого давления, необходимых для метода ВЭЖХ. Отсутствие твердого сорбента в капилляре исключает возможность его «старения», химической и физической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы [35].

Для подтверждения возможности определения ГКК методом КЗЭ исследовали надземные части редиса посевного (Raphanus sativus L. сем. Brassicaceae) и репы огородной (Brassica rapa L. сем. Brassicaceae) как растений, богатых коричными кислотами и их производными [12]. Исследования выполнены при температуре 20 °C на приборе «Капель-105» (ОАО «НПФ «Люмэкс»», Россия) с УФ-детектором при длине волны 280 нм и термостатируемым капилляром с рабочей длиной 65 см и диаметром 75 мкм. В качестве СО использованы коричная, феруловая, синаповая, кофейная и n-кумаровая кислоты (Sigma-Aldrich). В качестве буферного щелочного раствора был использован раствор натрия тетрабората десятиводного с концентрацией 5 мг/мл и рН 9,2, поскольку ГКК как ароматические фенолокислоты обладают электрофоретической подвижностью, обусловленной кислотными свойствами фенольных гидроксилов и карбоксильных групп и способностью ионизироваться в щелочной среде по обеим группам. В свободном виде в листьях редиса посевного обнаружены феруловая, п-кумаровая и кофейная кислоты, а в листьях репы огородной — феруловая и п-кумаровая. Одновременно анализ электрофореграмм извлечений из обоих растений показал присутствие значительной фракции соединений с более высокими значениями эффективной электрофоретической подвижности, чем у коричных кислот. Это косвенно может свидетельствовать о наличии в растениях эфиров ГКК [12].

А.М. Сампиевым с соавт. методом КЭ на приборе «Капель-103Р» (ОАО «НПФ «Люмэкс»», Россия) с кварцевым капилляром (L_эфф/L_общ = 50/60 см, ID = 75 мкм при напряжении на капилляре 16 кВ и температуре капилляра 20–30 °C) исследованы БАВ плодов софоры японской (Styphnolóbium japónicum (L.) Schott сем. Fabaceae) после извлечения СВЧ-экстракцией спиртом этиловым 10 % на СВЧ-минерализаторе «Минотавр-1». После разделения фенольные соединения детектированы на электрофореграмме при 254 нм и идентифицированы посредством сопоставления времени удерживания пиков со временем удерживания СО (хлорогеновая и кофейная кислоты) [13].

При использовании метода КЭ авторы цитируемых работ количественное содержание идентифицированных ГКК в исследуемых образцах определяли по площади пиков по установленным ранее градуировочным графикам растворов СО ГКК, используя программное обеспечение к прибору (табл. 7). Полученные результаты показали значительное суммарное содержание ГКК в большинстве исследованных растений и перспективность исследования их антиоксидантной активности.

 

Таблица 7. Результаты определения ГКК методом КЭ

Table 7. Results of determination of GCA by capillary electrophoresis

Растение	Латинское название	Сырье	Найдено ГКК, %
Голубика болотная [36]	Vaccinium uliginosum L.	Листья	Хлорогеновая (1,7–4,3)
Перилла кустарниковая [37]	Perilla frutescens L. Britt	Трава	Розмариновая (0,46)
Посконник конопляный [38]	Eupatorium cannabinum L.	Трава	Кумаровая (0,57), феруловая (0,08), кофейная (0,06), хлорогеновая (0,02)
Редис посевной [12]	Raphanus sativus L.	Листья	Сумма ГКК (0,50)
Репа огородная [12]	Brassica rapa L.	Листья	Сумма ГКК (0,31)
Розмарин лекарственный [39]	Rosmarinus officinalis L.	Листья	Розмариновая (0,87)
Софора японская [13]	Sophora japonica L.	Плоды	Хлорогеновая (0,09), кофейная (0,0008)
Татарник колючий [40]	Onopordum acanthium L.	Трава	Кофейная (0,049)

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГКК, их изомеры и эфиры являются широко распространенной в растительных объектах группой природных фенольных соединений. Благодаря мощным антиоксидантным свойствам они проявляют широкий спектр фармакологической активности. В связи с этим изучение ГКК в растениях, произрастающих в России, в том числе используемых для производства БАДов или растительных лекарственных препаратов, является одним из приоритетных направлений поиска природных БАВ для фармацевтической отрасли.

Анализ данных литературы показал, что использование сочетания методов газовой и жидкостной хроматографии с масс-спектроскопией и создание новых СО позволяют определять и достоверно идентифицировать не только ГКК, но и их изомеры, эфиры и гликозиды.

Метод ГХ-МС является наиболее информативным и обладает высокой эффективностью и чувствительностью. Он позволил обнаружить и подтвердить строение ГКК описанных в обзоре 7 видов рода Тимьян, 14 видов растений сем. Бурачниковые и 19 видов растений сем. Яснотковые, а также в тысячелистнике обыкновенном.

Менее трудоемким в связи с отсутствием стадии пробоподготовки, необходимой для получения летучих соединений в методе ГХ/МС, и чаще используемым является метод ВЭЖХ в сочетании с масс-спектроскопией. Этим методом Ю.А. Медведевым с соавт. исследовано 107 растений из 195 видов, включенных в обзор, произрастающих или используемых в фармацевтическом производстве или в производстве БАД в России. Ими обнаружено растительное сырье, содержащее более 1 % суммы ГКК. Остальные виды растений, описанных в цитируемых источниках литературы, исследованы методом ВЭЖХ/МС учеными Сибири и центральных районов РФ.

Одновременно показано, что перспективным направлением предварительных научных исследований является использование метода КЭ ввиду возможности решения важнейшей задачи — высокоэффективного разделения БАВ для идентификации и количественного определения ГКК в растительном сырье.

Отсутствие в основной массе изученных научных публикаций унифицированной методики пробоподготовки и обоснованной системы выбора ее критериев (масса и степень измельчения растительного сырья, экстрагент и его объем, способ, кратность, время и температура экстракции) может быть обусловлено разнообразием растительного сырья и количественным содержанием ГКК в нем.

Перечень и анализ представленных в обзоре методов позволяют создать методологическую базу для выбора ГКК и их производных как критериев совершенствования стандартизации ЛРС. Однако, несмотря на возможности приведенных методов, в источниках литературы практически нет сведений по изучению динамики накопления данной группы БАВ в зависимости от климатообразующих факторов, регионов произрастания, а также их стабильности в растительном сырье в процессе хранения. Такие сведения необходимы для совершенствования методик анализа действующих и впервые разработанных ФС, где в качестве критериев стандартизации выбраны ГКК. Это создает перспективы создания фитопрепаратов отечественного производства с разнообразной и эффективной фармакологической активностью.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Финансирование данной работы не проводилось.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией этой статьи.

Вклад авторов. Е.В. Компанцева — существенный вклад в концепцию и дизайн статьи; сбор, анализ просмотренных научных статей, утверждение окончательного варианта статьи для публикации. А.С. Саушкина — написание текста и критический пересмотр его содержания, утверждение окончательного варианта статьи для публикации. А.Ю. Айрапетова — сбор, анализ просмотренных научных статей, доработка текста окончательного варианта статьи для публикации. Английский перевод.

About the authors

Eugenia V. Kompantseva

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, branch of the Volgograd State Medical University

Email: dskompanceva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0534-1651

MD, Dr. Sci. (Pharmaceuticals), Professor

Russian Federation, Pyatigorsk

Anna S. Saushkina

Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vmeda-nio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8238-5092

MD, Cand. Sci. (Pharmaceuticals), Associate Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Asya Yu. Ayrapetova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, branch of the Volgograd State Medical University

Email: asyapgfa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4959-5677

MD, Cand. Sci. (Pharmaceuticals), Associate Professor

Russian Federation, Pyatigorsk

References

Supplementary files