Отправить статью по E-mail Эффективность применения мезенхимальных стромальных клеток для лечения рвано-ушибленных ран в условиях гипотермии и гипоксии
- Авторы: Волкова М.В.1, Бояринцев В.В.1, Трофименко А.В.1, Рыбалкин С.П.2, Ковалева Е.В.2, Бирюков С.А.1, Фильков Г.И.1, Дурыманов М.О.1
-
Учреждения:
- Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
- Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России, Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов
- Выпуск: Том 41, № 3 (2022)
- Страницы: 261-268
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journals.eco-vector.com/RMMArep/article/view/109211
- DOI: https://doi.org/10.17816/rmmar109211
- ID: 109211
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Актуальность. Арктические условия осложняют патогенез различных травм кожи и мягких тканей. Для терапии данных заболеваний рассматривается возможность применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, способствующих пролиферации клеток гранулярной ткани, ангиогенезу и сокращению длительности воспалительной фазы при заживлении раны благодаря секреции цитокинов и факторов роста.
Цель — оценка эффективности клеточной терапии на модели рвано-ушибленной раны у крыс, находящихся в условиях гипоксии и гипотермии.
Материалы и методы. Животные содержались в условиях климатической камеры (15 % кислорода, 4 °С) в течение 48 ч. Травму наносили через 24 ч после помещения в контролируемые условия. Введение стволовых клеток осуществляли через 1 сут после нанесения раны. Для инъекции использовали мезенхимальные стромальные клетки, полученные из красного костного мозга крыс Wistar. Используемая клеточная культура имела соответствующий стволовым клеткам иммунофенотип и обладала способностью дифференцировки в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. В ходе исследования у крыс оценивали степень воспалительной реакции в травмированных тканях и наличие возможных патологических выделений из раневого канала, проводили измерения толщины поврежденной лапы.
Результаты. Для описания процесса воспаления проведен гистологический анализ на 6-е и 21-е сут после нанесения раны. На 6-й день исследования отмечена слабая инфильтрация лимфоцитов в мышечной ткани у крыс, которым вводили мезенхимальные стромальные клетки, что может свидетельствовать о более раннем переходе раневого процесса в пролиферативную фазу.
Заключение. Установлено стимулирующее влияние суспензии мезенхимальных стволовых клеток на динамику снижения отека травмированного бедра на 10 % по сравнению с контрольной группой.
Полный текст
АКТУАЛЬНОСТЬ
Одним из самых распространенных видов травм в мире являются механические травмы различного характера. В Российской Федерации каждый год регистрируется несколько миллионов случаев подобных травм [1]. Многостадийный процесс заживления механических повреждений может быть осложнен влиянием внешних факторов. Например, в условиях Арктической зоны Российской Федерации переохлаждение организма препятствует регенеративным процессам [2]. Воздействие низких температур и гипоксии приводит к сужению сосудов и снижению кровоснабжения тканей в целом [3]. В связи с этим актуальной задачей является разработка новых подходов для ускорения заживления механических повреждений [4].
Важную роль в процессе заживления играют так называемые сигнальные молекулы, включая цитокины, хемокины и факторы роста, которые координируют физиологические процессы восстановления тканей [5]. Данные молекулы вырабатываются различными клетками раневого микроокружения, что обеспечивает, с одной стороны, элиминацию попавших в рану патогенов, а с другой — восстановление барьерной функции кожного покрова. В связи с этим перспективной стратегией лечения подобного рода заболеваний является разработка биомедицинских клеточных продуктов. В качестве основной клеточной культуры могут быть выбраны мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), способные оказывать ранозаживляющее действие благодаря паракринной секреции цитокинов и факторов роста [6, 7], которая сохраняется в течение первых дней после введения [8]. Таким образом, ММСК способствуют пролиферации клеток гранулярной ткани, ангиогенезу и сокращению длительности воспалительной фазы при заживлении раны [9, 10].
Цель данной работы — изучение влияния внутримышечной инъекции ММСК на скорость заживления рвано-ушибленной раны на животной модели крыс, содержавшихся в условиях гипоксии и гипотермии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ММСК были получены из красного костного мозга крыс Wistar согласно стандартному протоколу [11]. Клеточную культуру выращивали в среде DMEM (Gibco, США) с 10 % бычьей эмбриональной сыворотки (Gibco, США), заменимыми аминокислотами (Capricorn Scientific, Германия), 100 ед./мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия). Культивирование клеток проводили в атмосфере 5 % углекислого газа при температуре 37 °C и влажности 95 % в инкубаторе Smart Biotherm (Biosan, Латвия).
С целью анализа фенотипа клетки снимали с помощью раствора Версена и окрашивали растворами антител против CD105 (BiOrbyt, orb187245), CD90 (BioLegend, 206105), CD73 (Bioss, bs-4834R-A488), CD44 (BioLegend, 203906), CD29 (BioLegend, 102205), CD45 (BioLegend, 202205), CD34 (Abcam, ab223930), CD31 (Abcam, ab28364), CD14 (Abcam, ab182032), CD11b (Abcam, ab25533), содержащими 0,5 % бычьего сывороточного альбумина. Анализировали с использованием проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США). На основании показателей прямого и бокового светорассеяния выбирали одиночные клетки и регистрировали 10 000 событий.
Для дифференцировки клеточной культуры в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях клетки культивировали с использованием коммерческих наборов StemPro® Differentiation Kit (Gibco, США) в соответствии с протоколами производителя. Затем проводили окраску дифференцированных и недифференцированных (контроль) ММСК красителями Alizarin Red S, Safranin O и Sudan III соответственно. Изображения клеток получали с помощью микроскопа Axio VertA1 (Zeiss, Германия).
Эксперименты на животных проводились на базе НИЦ ТБП — филиала ФГБУ «ГНЦ “Институт иммунологии” ФМБА» в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики, утвержденными приказом № 199н от 01.04.2016 г. МЗ РФ, и требованиями гуманного обращения с животными. В качестве тест-системы были использованы крысы Wistar, приобретенные в питомнике ФГБУН НЦБМТ ФМБА, филиал «Столбовая».
Для эксперимента использовали модель рвано-ушибленной раны бедра у крыс, которых содержали в климатической камере в течение суток до и после нанесения механической травмы в условиях гипотермии (температура 4 °C) и гипоксии (15 % кислорода в атмосфере) [12]. До помещения в климатическую камеру, а также через 24 и 48 ч у животных измеряли температуру тела.
Рану наносили с помощью чистого стерильного металлического стержня круглого сечения с выступом после обработки 70 % спиртом кожи бедра в области нанесения травмы. Стержень опускали путем свободного падения на бедро крысы с высоты 80 см внутри направляющей трубы. Введение суспензии ММСК (2 млн клеток в мл) или физраствора в мягкие ткани проводили путем инфильтрирования вокруг раны через 24 ч после нанесения травмы.
При обследовании области механической травмы у крыс оценивали степень воспалительной реакции в травмированных тканях и наличие возможных патологических выделений из раневого канала. Определение степени отечности проводили путем измерения толщины поврежденной лапы с помощью внешнего микрометра HENGLIANG (Lang Tools, Китай). Измерение толщины бедра проводили до нанесения травмы, а также на 3, 9, 16 и 21-й день после ее нанесения.
Для описания процесса заживления проводили гистологический анализ тканей раны, которые отбирали у трех крыс каждой из групп на 6-е сут после нанесения механической травмы для оценки морфологической картины первого этапа заживления раны, а также у оставшихся в каждой группе 7 крыс на 21-е сут после нанесения травмы. Изучение гистологических препаратов осуществляли под световым микроскопом СХ41 (Olympus, Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделенные из красного костного мозга крысы ММСК обладают способностью адгезии к пластику и экспрессируют на своей поверхности соответствующие маркеры CD105, CD90, CD73, CD44 и CD29 [13]. При этом экспрессия маркеров CD45, CD34, CD31, CD14 и CD11b менее 2 % подтверждает высокую чистоту и однородность полученной первичной линии. Результаты анализа фенотипа представлены на рис. 1.
Рис. 1. Фенотип ММСК крысы: распределение клеток, окрашенных антителами против положительных (верхний ряд) и отрицательных (нижний ряд) маркеров
Полученные линии ММСК способны дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях (рис. 2) [13]. При использовании Alizarin Red S происходит окрашивание минерализованного внеклеточного матрикса остеобластов по сравнению с недифференцированными ММСК. Окрашивание жировых включений Sudan III подтверждает дифференцировку ММСК в адипоциты. Хондроциты идентифицируются путем окрашивания Safranin O глюкозамингликанов во внеклеточном матриксе.
Рис. 2. Дифференцировка ММСК крысы в остеоциты (Alizarin Red S), хондроциты (Safranin O) и адипоциты (Sudan III)
С целью оценки эффективности клеточного продукта для терапии травм в арктических условиях животных помещали в специально разработанную климатическую камеру.
Результаты контроля температуры тела крыс (табл. 1) показали снижение ее среднего значения на 1 °C в течение времени нахождения в климатической камере. Для крыс температура тела ниже 37 °C является пониженной и свидетельствует о гипотермии [14].
Таблица 1. Средняя температура тела крыс в период нахождения в климатической камере
Исходная | Через 24 ч | Через 48 ч |
37,9 ± 0,3 | 37,0 ± 0,5 | 36,3 ± 0,3 |
Для проведения различных исследований используют животных с иссеченной раной, когда с их спины аккуратно вырезается часть кожи определенного размера [15]. Нанесение травмы металлическим стержнем в свободном падении обеспечивает получение рвано-ушибленной травмы. Выступ на стержне обеспечивает проникающий механический разрыв кожи и мышц бедра, а сам стержень вызывает контузию мягких тканей (рис. 3).
Рис. 3. Вид сквозной рвано-ушибленной раны с наружной (a) и внутренней (b) поверхности бедра
На 3-й день после травмы и на 2-й — после введения суспензии ММСК или физраствора отмечено увеличение толщины бедра у контрольных и подопытных животных в проекции раневого канала (табл. 2). Травмированные лапы у животных были отечными и плотными при пальпации, раневой канал был закрыт небольших сухим струпом, выделений из-под него не было.
Таблица 2. Показатели измерения толщины бедра крыс в ходе наблюдений
Препарат | Толщина бедра в день исследования, мм | ||||
0-й день | 3-й день | 9-й день | 16-й день | 21-й день | |
Физраствор | 9,8 ± 0,6 | 11,7 ± 0,6 | 11,3 ± 0,6 | 10,2 ± 0,3 | 9,4 ± 0,5 |
МСК | 9,3 ± 0,4 | 12,4 ± 0,6 | 10,8 ± 0,8 | 9,1 ± 0,3* | 8,1 ± 0,6* |
* различие с показателем группы «Физраствор» статистически значимо по U-критерию Манна–Уитни при p = 0,05. | |||||
На 6-й день морфологическая картина раны у подопытных и контрольных животных была схожей и соответствовала регенеративной фазе раневого процесса. При этом у животных, которым вводили физраствор, отмечали лимфоцитарную инфильтрацию между волокнами сохранившейся мышечной ткани. У крыс, которым вводили ММСК, подобная инфильтрация была слабо заметна, что может свидетельствовать о более раннем переходе воспалительной фазы раневого процесса в пролиферативную.
На 9-й день установлено снижение толщины бедра у крыс. Поверхность раневого канала у всех животных была полностью покрыта эпителием, струпы на поверхности отсутствовали. При пальпации поврежденной конечности отмечено отсутствие отечности тканей.
На 16-й и 21-й дни были установлены статистически значимые различия в толщине бедер крыс подопытной и контрольной групп. Значения толщины в конечный срок исследования у животных, леченных ММСК, оказались меньше исходных, что свидетельствует о высокой степени зрелости рубцовой соединительной ткани и новообразованной мышечной ткани в зоне регенерации.
На 21-й день после нанесения травмы согласно гистологическому анализу отмечена высокая степень регенерации по всей толщине ранее поврежденных тканей у всех подопытных и контрольных животных. Эпителий и дерма в месте травмы имели нормальную гистологическую структуру, под дермой на месте раневого канала имелось разрастание слоя плотной волокнистой соединительной ткани, местами диффузно между волокнами мышечной ткани. На рис. 4 показан толстый слой плотной волокнистой соединительной (рубцовой) ткани между дермой и мышечной тканью. В выноске представлены скопления сидероцитов и соединительной ткани.
Рис. 4. Морфология участка зажившей раны в области травмы бедра у крысы, леченой ММСК. Окраска гематоксилином и эозином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного на модели механической травмы исследования установлено стимулирующее влияние суспензии ММСК на заживление рвано-ушибленной раны у крыс после нахождения в течение 48 ч в условиях гипоксии и гипотермии. Динамика снижения отека травмированного бедра в подопытной группе происходит на 10 % быстрее, чем в контрольной. Таким образом, использование ММСК для лечения механических травм является перспективным терапевтическим подходом, который может ускорить процесс заживления.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта в форме субсидии по соглашению от 28 ноября 2018 г. № 14.575.21.0179 (уникальный идентификатор проекта RFMEFI57518X0179), заключенному между Министерством науки и высшего образования Российской Федерации и Московским физико-техническим институтом.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (ветеринарный протокол № 704 от 14.07.2020 г.).
Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.
Об авторах
Марина Викторовна Волкова
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Автор, ответственный за переписку.
Email: biotech.volkova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5966-3026
SPIN-код: 4104-5195
младший научный сотрудник
Россия, Долгопрудный, Московская областьВалерий Владимирович Бояринцев
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Email: marinarage@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9707-3262
SPIN-код: 2491-7199
докт. мед. наук, профессор, главный научный сотрудник
Россия, Долгопрудный, Московская областьАлександр Викторович Трофименко
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Email: trofimenko.av@mipt.ru
SPIN-код: 5228-7073
канд. мед. наук, доцент, заведующий лабораторией
Россия, Долгопрудный, Московская областьСергей Петрович Рыбалкин
Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России, Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов
Email: rybalkin-sp@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2933-5758
SPIN-код: 1988-4621
канд. биол. наук, директор
Россия, Серпуховский городской округ, Московская областьЕлена Владимировна Ковалева
Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России, Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов
Email: e-kovaleva@yandex.ru
SPIN-код: 2952-1038
старший научный сотрудник
Россия, Серпуховский городской округ, Московская областьСтанислав Анатольевич Бирюков
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Email: biryukov.sa@mipt.ru
докт. физ.-мат. наук, старший научный сотрудник
Россия, Долгопрудный, Московская областьГлеб Игоревич Фильков
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Email: filcom.gl@gmail.com
SPIN-код: 7733-8460
научный сотрудник
Россия, Долгопрудный, Московская областьМихаил Олегович Дурыманов
Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
Email: durymanov.mo@mipt.ru
SPIN-код: 5796-0022
ResearcherId: T-8711-2018
канд. биол. наук, заместитель заведующего лабораторией
Россия, Долгопрудный, Московская областьСписок литературы
- Здравоохранение в России. 2021. Статистический сборник. М.: Росстат, 2021. 171 с.
- Черников О.Г., Кульнев С.В., Куприянов С.А., и др. Особенности организации медицинского обеспечения группировок войск (сил) в арктической зоне // Военно-медицинский журнал. 2020. Т. 341, № 4. С. 4–11.
- Tamama K., Kerpedjieva S.S. Acceleration of wound healing by multiple growth factors and cytokines secreted from multipotential stromal cells/mesenchymal stem cells // Advances in Wound Care. 2012. Vol. 1, No. 4. P. 177–182. doi: 10.1089/wound.2011.0296
- Александров В.Н., Болехан В.Н., Бунтовская А.С., и др. Развитие клеточных технологий, молекулярно-генетических исследований и тканевой инженерии в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и Военном инновационном технополисе «Эра» // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2019. № 3. С. 243–248.
- Dash B.C., Xu Z., Lin L., et al. Stem cells and engineered scaffolds for regenerative wound healing // Bioengineering. 2018. Vol. 5, No. 1. Art. 23. doi: 10.3390/bioengineering5010023
- Slegtenhorst B.R., Dor F.J., Rodriguez H., Voskuil F.J., Tullius S.G. Ischemia/reperfusion injury and its consequences on immunity and inflammation // Curr. Transplant. Rep. 2014. Vol. 1, No. 3. P. 147–154. doi: 10.1007/s40472-014-0017-6
- Han Y., Li X., Zhang Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine // Cells. 2019. Vol. 8, No. 8. Art. 886. doi: 10.3390/cells8080886
- Wu X., Jiang J., Gu Z., et al. Mesenchymal stromal cell therapies: immunomodulatory properties and clinical progress // Stem. Cell Res. Ther. 2020. Vol. 11, No. 1. Art. 345. doi: 10.1186/s13287-020-01855-9
- Li H., Shen S., Fu H., et al. Immunomodulatory functions of mesenchymal stem cells in tissue engineering // Stem Cells Inl. 2019. Vol. 2019. Art. 9671206. doi: 10.1155/2019/9671206
- Fu X., Liu G., Halim A., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair // Cells. 2019. Vol. 8, No. 8. Art. 784. doi: 10.3390/cells8080784
- Soleimani M., Nadri S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4, No. 1. P. 102–106. doi: 10.1038/nprot.2008.221
- Бояринцев В.В., Трофименко А.В., Рыбалкин С.П., и др. Установка для проведения экспериментальных исследований на животных в гипоксических условиях при низких температурах. Пат. 201120. Заявитель и патентообладатель МФТИ — № 2020122211; заявл. 06.07.2020; опубл. 27.11.2020, Бюл. № 33.
- Fitzsimmons R.E.B., Mazurek M.S., Soos A., Simmons C.A. Mesenchymal stromal/stem cells in regenerative medicine and tissue engineering // Stem Cells Int. 2018. Vol. 2018. Art. 8031718. doi: 10.1155/2018/8031718
- Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных: справочник / Под ред. Макарова В.Г., Макаровой М.Н. СПб.: Лема, 2013. 116 с.
- Ring A., Goertz O., Steinstraesser L., et al. Analysis of biodegradation of copolymer dermis substitutes in the dorsal skinfold chamber of balb/c mice // Eur. J. Med. Res. 2006. Vol. 11, No. 11. P. 471–478.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).