Creation of new pichia pastoris strains for recombinant protein production

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Дрожжи P. pastoris широко используются для наработки самых разнообразных белков, начиная от столбнячного токсина и эпидермального фактора роста мыши и заканчивая мембранными белками, включающими ABC транспортеры, аквапорины и тетраспанины (Darby et al., 2012; Cregg et al., 2000). Исходя из опыта применения P. pastoris в биотехнологии известно, что существует приблизительно 50-75%-я вероятность удачного синтеза любого чужеродного белка в P. pastoris. При этом использование дрожжей P. pastoris открывает широкие возможности для оптимизации условий культивирования, что позволяет достигать необычайно высоких уровней продукции целевого белка (Cregg & Cereghino, 2000). Активное использование дрожжей P. pastoris в современных биотехнологических производствах напрямую связано с особенностями их метаболизма. К преимуществам метилотрофных дрожжей можно отнести простоту культивирования, относительную дешевизну среды и возможность применения различных методик генетических манипуляций. Ещё одной особенностью этого вида дрожжей является способность осуществлять посттрансляционные модификации, характерные для белков высших эукариот. В биотехнологии при работе с дрожжами самой сложной задачей является достижение оптимального баланса между уровнем синтеза целевого белка и жизнеспособностью штаммов-продуцентов. Применение P. pastoris открывает широчайшие возможности для оптимизации условий культивирования. Одним из способов увеличения уровня синтеза целевого белка является получение штаммов P. pastoris, несущих множественные копии чужеродного гена. Другим подходом, чаще всего используемым при работе с секреторными белками, является коэкспрессия генов, кодирующих различные вспомогательные факторы. Для успешного применения этих подходов необходимо создание коллекции плазмид, позволяющих осуществлять множественную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris, а также получение множественно-маркированных штаммов-продуцентов. Одной из стратегий усиления экспрессии специфичного гена в P. pastoris является увеличение числа экспрессионных кассет в штамме-хозяине (Scorer et al., 1994). Для этого могут быть использованы векторы с множественными тандемными копиями гена, расположенными последовательно в экспрессионной кассете (Brierley, 1998). Кроме того, существует возможность конструирования кассеты экспрессии на основе вектора, несущего в качестве селективного маркера один из генов устойчивости к действию антибиотиков. К числу этих маркерных генов относятся гены устойчивости к зеоцину (ZeoR) (Higgins et al., 1998), бластицидину (BlaR), генетицину (G418R) (Scorer et al., 1994; Sunga & Cregg, 2004). Другим подходом является конструирование нескольких векторов экспрессии с различными селективными маркерами и последующая их интеграция в геном штаммов P. pastoris. При этом чаще всего применяются плазмидные векторы, которые содержат ген гистидинолдегидрогеназы HIS4 в качестве селективного маркера, и соответствующие им ауксотрофные штаммы. При работе с дрожжами S. cerevisiae широко используются селективные системы на основе генов URA3 и LYS5. Использование этих генов даёт возможность проведения позитивной и негативной селекции (Littlewood, 1972). Ген URA3 кодирует оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу (EC 4.1.1.23), фермент, необходимый для биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов. Позитивная селекция основана на ауксотрофности мутантов ura3, которые не способны расти на среде без урацила. Мутанты ura3 могут быть отобраны на среде, содержащей 5-фтороротовую кислоту (ФОК). Поскольку под действием декарбоксилазы ФОК превращается в токсическое соединение 5-фтороурацил, клетки дикого типа URA3 погибают на среде с ней (Sherman, 1997). Другой ген, широко используемый в селективных системах - LYS5 кодирует фермент фосфопантетилтрансферазу (EC 2.7.8.7). Этот фермент в пути биосинтеза лизина преобразует неактивный апо-фермент альфа-аминодипатредуктазы в активную форму. Мутации в гене LYS5 ведут к ауксотрофности клеток по лизину. Мутантов lys5 можно отобрать на среде с-аминоадипиновой кислотой. В ходе данной работы были созданы экспрессионные системы дрожжей P. pastoris, основанные на ортологах генов URA3 и LYS5 дрожжей S. cerevisiae. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Среды и условия культивирования штаммов При работе с дрожжами использовали стандартные культуральные среды: богатую среду YPD, ПЕП, синтетическую минеральную среду Md (Guthrie & Fink, 1991). Штаммы дрожжей P. pastoris выращивали при 30 ºС. Для культивирования бактериальных штаммов использовали среду LB. Штаммы E. coli выращивали при 37 ºС. Плазмиды ПЦР-продукты клонировали в промежуточный вектор pTZ57R/T (Thermoscientific). В качестве основы для создания векторов для экспрессии чужеродных генов в P. pastoris использовали плазмиду pPIC9 (Invitrogen©). Методы Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью алгоритмов Blast и Clustal. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя реактивов (Thermoscientific). Последовательности праймеров для проведения ПЦР представлены в таблице 1. Выделение ДНК из клеток бактерий и дрожжей, трансформацию дрожжей и бактерий и электрофорез ДНК в агарозном геле проводили в стандартных условиях (Sambrook & Russel, 2001). Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей и лигирование фрагментов ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя использованных реактивов и наборов (Thermoscientific). Секвенирование проводили с использованием реактивов Big Dye v3.1 и Big Dye v1.1 (Applied Biosystems) на генетическом анализаторе 3130 (Applied Biosystems). Полученные хроматограммы анализировали с помощью программ BioEdit и UniGene. РЕЗУЛЬТАТЫ Клонирование генов PpURA3 и PpLYS5 На первом этапе работы был проведен анализ баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и http://www.pichiagenome.org/, содержащих геномные последовательности дрожжей P. pastoris. Были выявлены последовательности гомологичные генам URA3 и LYS5 дрожжей S. cerevisiae: PpURA3 (P. pastoris GS-115, хромосома 3, локус PAS_chr3_0381, gene ID: 8199513), и PpLYS5 (P. pastoris GS-115, хромосома 4, локус PAS_chr4_0793, gene ID: 8200571). К выбранным последовательностям были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать указанные гены и их регуляторные области (табл. 1). 5’-концы праймеров содержат последовательности сайтов рестрикции (PpURA3: SphI и SpeI; PpLYS5: SphI и XbaI), необходимые для проведения последующего клонирования ПЦР-продуктов. В качестве матрицы для амплификации генов PpURA3 и PpLYS5 была использована хромосомная ДНК штамма Х-33 дрожжей P. pastoris (дикий тип, Lifetechnologies). Амплифицированные фрагменты генов URA3 и LYS5 были клонированы в промежуточном векторе pTZ57R/T, при этом использовали технологию ТА-клонирования, реализованную в наборе InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo scientific). Фрагменты встраивали в ген lacZ, что обеспечивало возможность использования метода бело-голубой селекции на среде с субстратом X-gal. В результате были получены генетические конструкции на основе вектора pTZ57R/T, которые содержали последовательности генов PpURA3 и PpLYS5, ограниченные сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Структура плазмид была подтверждена данными рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования. Создание ауксотрофных штаммов P. pastoris В нуклеотидную последовательность генов PpURA3 и PpLYS5 в составе векторов pTZ57R/T-URA3 и pTZ57R/T-LYS5 были внесены делеции. Вектор pTZ57R/T-URA3 был обработан рестриктазой BsrGI (размер удаленного участка составил 1253 п. о.), а вектор pTZ57R/T-LYS5 рестриктазами ClaI и BsrGI (размер удаленного участка составил 418 п. о.). Фрагменты обрабатывали Pfu-полимеразой и проводили их самолигирование. Плазмиды анализировали с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования. Полученные плазмиды pTZ57R/T-∆Ppura3 и pTZ57R/T-∆Pplys5 (рис. 1) были использованы для создания штаммов P. pastoris ауксотрофных по урацилу и лизину соответственно. С помощью ПЦР по матрице данных плазмид были амплифицированы фрагменты генов Ppura3 и Pplys5, содержащие делеции. Данными фрагментами был трансформирован штамм X-33 дрожжей P. pastoris. Для эффективного отбора трансформантов была использована негативная селекция. Штаммы, несущие делецию в гене PpURA3, отбирали по способности к росту на среде с 5-фтороротовой кислотой (ФОК) с добавлением урацила. Были отобраны клоны, характеризующиеся ауксотрофностью по урацилу (рис. 2). Штаммы, несущие делецию в гене PpLYS5, отбирали на среде с альфа-аминоадипиновой кислотой с добавлением лизина. Были отобраны клоны, характеризующиеся ауксотрофностью по лизину (рис. 2). Различий в скорости роста полученных штаммов P. pastoris 1-X-33 ura3∆ и 2-X-33 lys5∆ по сравнению с исходным штаммом X-33 не наблюдали. Создание векторов экспрессии на основе маркеров PpURA3 и PpLYS5 Помимо упомянутых выше ауксотрофных штаммов для экспрессии чужеродных генов в P. pastoris необходимо наличие векторов, позволяющих проводить селекцию трансформантов. В данной работе в качестве основы был выбран вектор pPIC9 (Invitrogen©), несущий ген HIS4 дрожжей P. pastoris, который обеспечивает селекцию трансформантов по восстановлению прототрофности по гистидину. В ходе работы фрагменты, содержащие последовательность гена HIS4, в составе pPIC9 замещали на последовательности генов PpURA3 и PpLYS5. Для этого при замене HIS4 на PpURA3 вектор pPIC9 был обработан рестриктазами XbaI и SphI. При этом был удален участок, содержащий ген HIS4, размером 2751 п. о. Встраиваемый фрагмент, содержащий ген PpURA3, был получен при обработке вектора pTZ57R/T-URA3 рестриктазами SpeI и SphI, а фрагмент PpLYS5 - при обработке вектора pTZ57R/T-LYS5 рестриктазами SphI и XbaI. Далее проводили лигирование фрагментов PpURA3 или PpLYS5 с вектором pPIC9. Полученные плазмиды анализировали с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования. Таким образом, на основе вектора pPIC9 были созданы генетические конструкции, в которых исходная последовательность гена HIS4 заменена на последовательности генов PpURA3 и PpLYS5 (рис.1). Плазмидой pPIC9-his4::URA3 трансформировали созданный ранее штамм P. pastoris 1-X-33 ura3∆, а плазмидой pPIC9-his4:: LYS5 - штамм 2-X-33 lys5∆. У полученных трансформантов восстанавливалась прототрофность по урацилу и лизину соответственно (рис. 2). ОБСУЖДЕНИЕ Использование дрожжей P. pastoris в биотехнологии открывает широкие возможности для оптимизации условий синтеза рекомбинантных белков. Для повышения выхода рекомбинантного белка применяется увеличение числа копий генов, кодирующих исследуемый белок, а также коэкспрессия различных вспомогательных факторов. Одним из существенных ограничений применения данных методов является недостаточная доступность штаммов P. pastoris и соответствующих плазмид. Созданный в ходе данной работы штамм 1-X-33 ura3∆ аналогичен описанным ранее штаммам P. pastoris, несущим ауксотрофность по урацилу (Cereghino et al., 2000). Получение данного штамма является необходимым этапом для создания штаммов P. pastoris, характеризующихся другими ауксотрофностями. Для этого в ходе дальнейшей работы будут использованы методы дисрупции генов, основанные на применении гена PpURA3 в качестве селективного маркера (Scherer & Davis, 1979). В качестве альтернативного подхода возможно применение созданного впервые штамма 2-X-33 lys5∆, поскольку использование гена PpLYS5 так же позволяет проводить позитивную и негативную селекцию. Созданные в ходе работы плазмиды и ауксотрофные штаммы позволяют осуществлять интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris. Дальнейшее их применение позволит ещё больше расширить коллекцию селективных маркеров и ауксотрофных мутантов дрожжей P. pastoris. Полученные результаты имеют важное практическое значение, поскольку дают возможность оптимизировать синтез рекомбинантных белков за счет строгого контроля количества копий чужеродного гена или за счёт коэкспрессии генов, кодирующих различные вспомогательные факторы. Так же использование подобной коллекции открывает широкие перспективы для применения генетического анализа у дрожжей P. pastoris.

About the authors

Dmitriy Mikhaylovich Muzaev

Saint Petersburg State University

Email: dmmuzaev@yandex.ru
master, Dept. Genetics and Biotechnology

Andrey Mikhaylovich Rumyantsev

Saint Petersburg State University

Email: rumyantsev-am@mail.ru
master, Dept. Genetics and Biotechnology

Elena Viktorovna Sambuk

Saint Petersburg State University

Email: esambuk@mail.ru
Dr. Sci. Biol, professor, Dept. Genetics and Biotechnology

Marina Vladimirovna Padkina

Saint Petersburg State University

Email: mpadkina@mail.ru
Dr. Sci. Biol, professor, Dept. Genetics and Biotechnology

References

Supplementary files