Molecular genetic study of geographic forms of ladybird beetles Adalia bipunctata and A. frigida

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вид Adalia bipunctata Linneaus, 1758 (Coccinellidae, Colleoptera) и близкие к нему формы с не вполне ясным таксономическим статусом занимают огромный ареал - приполярные, умеренного климата и субтропические зоны Старого и Нового Света. Adalia bipunctata sensu stricto в Евразии встречается, по нашим наблюдениям, от Испании до Камчатки и от Кольского полуострова до Крыма и юга Италии. Этот вид полиморфен, во всех его популяциях обнаруживаются формы с красной и черной окраской надкрылий, на красном фоне обычно два округлых черных пятна, на черном 2-4-6 красных пятен. На севере и на юге появляются особи со многими темными пятнами на красном или розовом фоне. Такие формы систематиками обычно описываются не как A. bipunctata, а причисляются (ошибочно) к близкому, но самостоятельному виду A. decempunctata Linneaus, 1758, который встречается только в Европе, либо получают самостоятельный видовой статус: A. revelierei Mulsant, 1866 (малая и Передняя Азия, Закавказье), A. turanica Lusis, 1947 (Средняя Азия), A. fasciatopunctata Mader, 1931 (Монголия, Тува, Забайкалье и прилегающая часть Сибири), A. frigida Schneider, 1792 (приполярные районы). Я. Я. Лусис, проводивший генетические эксперименты, пришел к выводу, что южные формы с многими пятнами не принадлежат к самостоятельным видам, а входят в состав полиморфных популяций A. bipunctata. Результаты гибридологического анализа формы fasciatopunctata Я. Я. Лусис не опубликовал, а A. frigida была им признана самостоятельным видом (Лусис, 1976). Задача настоящей работы - уточнить статус форм Adalia, обитающих на юге и на севере (в пределах бывшего СССР) с использованием молекулярно-генетических методов. Сравнительный анализ ДНК полиморфных форм адалий практически не проводился, отсутствие полиморфизма в 3' последовательности гена цитохромоксидазы I (COI) между A. b. bipunctata и A. b. fasciatopunctata было обнаружено в работе Паленко и cоавторов (2004). Нами ранее была исследована структура ДНК у A. b. bipunctata, A. b. fasciatopunctata, A. decempunctata, A. tetraspilota, и одной особи A. frigida из популяции Архангельска (Zakharov, Shaikevich, 2013). В данной работе мы исследовали ДНК A. frigida из нескольких удаленных популяций, A. b. revelierei и A. b. turanica и сравнили с исследованными нами ранее A. b. bipunctata и A. b. fasciatopunctata. Материалы и методы Для настоящей работы были использованы жуки из следующих мест сбора: район озера Иссык-Куль, Киргизия (1997); Чита (2012); Хангалас, республика Саха Якутия (2011); Ереван, Армения (2013). Из сборов Киргизии была изучена одна особь, которая по морфологии относилась к подвиду A. b. turanica. В сборе из Еревана присутствовали как типичные по окраске жуки A. bipunctata, так и жуки, окраска которых соответствовала A. revelierei. В сборах из Якутии жуки соответствовали A. frigida. В сборах из Читы были типичные особи A. bipunctata, соответствующие A. frigida и жуки с промежуточным рисунком. Для выделения ДНК из жуков использовали набор DIAtom™ DNA Prep (Изоген, Москва). В реакции амплификации использовали по 0,1 мкг выделенной ДНК. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на термоциклере GeneAmpR PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA), применяя наборы для амплификации GenePak™ PCR Core (Изоген, Москва) и Evrogen Encyclo PCR kit (Evrogen JSC, Москва), придерживаясь инструкции производителя. Для амплификации наиболее изменчивого района - средней области гена СОI - в ПЦР были использованы праймеры C1-j-1951 и C1-N-2618 (Schulenburg et al., 2002). Были получены амплифицированные продукты размером 700 п. н. Условия ПЦР: первичная денатурация - 5 мин при 94 °C; 35 циклов: денатурация при 94 °C - 30 с, отжиг при 55 °C - 40 с, синтез при 72 °C - 40 с; завершающий синтез при 72 °C - 10 мин. Для амплификации области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера генов рРНК были использованы праймеры, комплементарные к районам 5,8S и 28S рPНК (Proft et al., 1999) и получены характерные для адалий ПЦР продукты, размером около 900 п. н. Условия ПЦР те же, что и для гена COI. Ампликоны выявляли путем электрофореза в 1%-м агарозном геле (Sigma, США). Амплифицированные фрагменты ДНК выделяли из геля с использованием набора JetQuiCk Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Germany) для последующего секвенирования. Секвенирование проводили на приборе ABI PRISM 310 с использованием реагентов фирмы «Applera», США, по инструкции производителя. Сопоставление нуклеотидных последовательностей выполняли с использованием программ ChromasPro и MEGA version 4.0 (Tamura et al., 2007). Результаты Среди собранных жуков были определены нуклеотидные последовательности гена COI и области ITS2 кластера рибосомных генов. Полученные результаты мы сравнили с исследованными нами ранее A. b. bipunctata и A. b. fasciatopunctata из Бурятии. Подвиды A. bipunctata Изменчивость митохондриальной ДНК Полиморфизм мтДНК мы исследовали, определяя нуклеотидные последовательности средней области гена СОI, одного из наиболее изменчивых районов в митохондриальном геноме адалий. Ранее были обнаружены 18 вариабельных мт-гаплотипов по данному участку генома (Шайкевич с соавт., 2012). Различия между мт-гаплотипами, как правило, составляют от одного до четырех нуклеотидных замен, два мт-гаплотипа Н9 и Н10 значительно отличаются от остальных (Zakharov, Shaikevich, 2013) (рис. 1). Среди ереванской популяции адалий были исследованы последовательности гена COI у 8 жуков с фенотипом A. b. revelierei и 12 жуков с фенотипом A. b. bipunctata typica. Идентичные мт-гаплотипы были обнаружены у особей обеих форм: у 20 жуков были обнаружены 5 уже известных митотипа и два новых, которые отличаются от ранее обнаруженных одной нуклеотидной заменой. Мы обозначили их Н19 и Н20, продолжая имеющиеся обозначения (Schulenburg et al., 2002; Захаров, Шайкевич, 2011). У особей с фенотипом A. b. revelierei преобладающим митотипом оказался Н1 (табл. 1), также как и у особей из других популяций комплекса A. bipunctata. У одной особи был обнаружен митотип Н3 и одна особь обладала новым митотипом, который мы назвали Н20. Среди типичных A. b. bipunctata из Еревана 8 особей имели Н1, по одной особи - Н4 и Н19. Две особи A. b. bipunctata из Ереванской популяции обладали мт- гаплотипом Н9. Имеющаяся в нашем распоряжении A. b. turanica обладала мт-гаплотипом Н1 гена COI. Среди A. b. fasciatopunctata ранее нами были обнаружены мт-гаплотипы Н1 и Н10, оба гаплотипа характерны для особей номинальной формы A. b. bipunctata (табл. 1). Средне число нуклеотидных замен на сайт у 29 особей разных форм комплекса A. bipunctata с мт-гаплотипами Н1, Н3, Н4, Н19 и Н20 составляет 0,001 (табл. 2). Различия Н9 и Н10 от других мт-гаплотипов достигают уровня межвидовых различий (табл. 2). Полиморфизм ядерной ДНК Мы изучили полиморфизм области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера генов рРНК у A. b. bipunctata, A. b. turanica, A. b. revelierei и A. b. fasciatopunctata из географически удаленных мест сбора. Сравнение нуклеотидных последовательностей 26 особей всех исследуемых форм A. bipunctata, обладающих различающимися мт-гаплотипами, не выявило значимых различий - различающиеся по морфологии божьи коровки обладают практически идентичными последовательностями ITS2 и образуют монофилетический кластер на дендрограмме (рис. 2). Средне число нуклеотидных замен на сайт у 25 особей A. bipunctata составляет 0,001. A. bipunctata и A. frigida A. frigida обитает на севере Евразии, от Скандинавии до Якутии. По нашим наблюдениям, в Архангельске A. bipunctata и A. frigida обитают совместно. Для исследования в нашем распоряжении были одна особь A. frigida и ее потомки из Архангельска, 6 особей из Читы и 3 из Якутии (табл. 3). В сборе из Читы среди особей были типичные по рисунку A. frigida, т. е. с несколькими пятнами, расположенными в два ряда в задней части надкрылий и особи с промежуточным рисунком. Особи из Якутии фенотипически соответствовали A. frigida. ДНК гена COI у особей A. frigida отличается от ДНК A. bipunctata на 4,3 % (табл. 2). Такие последовательности были обнаружены нами у особей из Архангельска, одной из Читы и двух из Якутии. Остальные исследованные особи, несмотря на морфологическое сходство с A. frigida обладали мтДНК, соответствующей A.bipunctata (табл. 3). Мы сравнили обнаруженные нами у A. frigida гаплотипы гена COI. Последовательности гена COI двух особей из Якутии и одной из Читы идентичны между собой. Нуклеотидные последовательности гена COI у жука из Архангельска отличаются шестью заменами от таковых у жуков из Якутии и Читы, что составляет 0,7 % (рис. 3). Замены нуклеотидов не приводят к смене аминокислотных последовательностей. ДНК области ITS2 у A. frigida из Архангельска и Якутии идентичны между собой и отличаются от ДНК A. bipunctata, различия составляют 1,8 % (рис. 2). Для двух особей из Якутии нам не удалось получить качественных последовательностей ДНК области ITS2, выделение ДНК проводилось из коллекционного материала (сухих жуков). ITS2 всех исследованных особей из Читы, несмотря на фенотипическое сходство с A. frigida, соответствует ДНК A. bipunctata (табл. 3). Обсуждение Выполненные нами исследования позволили впервые определить последовательности генов мтДНК и рРНК для A. frigida, A. b. turanica и A. b. revelierei и провести сравнение этих видов и подвидов с A. b. bipunctata и A. b. fasciatopunctata. Проведенный анализ ДНК A. b. turanica, A. b. revelierei и A. b. fasciatopunctata, отличающихся от европейской формы A. b. bipunctata узором на надкрыльях и распространенных в краевых областях ареала, не обнаружил отличий последовательности ITS2 от номинальной формы A. bipunctata и разницы в гаплотипическом разнообразии по гену COI митохондриальной ДНК. Среди A. b. bipunctata, A. b. fasciatopunctata, A. b. revelierei и A. b. turanica были обнаружены 20 вариабельных мт-гаплотипов по гену COI, но ни один из них не был уникальным для какой-либо из форм. Различия 18 из обнаруженных 20 мт-гаплотипов между собой составляют от 1 до 4 нуклеотидов. Мт-гаплотип Н1 является самым распространенным гаплотипом во всех выборках и на медианной сети видно, что он является корневым, предковым гаплотипом по отношению к остальным семнадцати. Два мт-гаплотипа, Н9 и Н10, значительно отличаются от остальных. Гаплотип Н9, встречающийся в популяциях A. bipunctata северных районов Европы (Schulenburg et al., 2002; Jiggins, Tinsley, 2005), в Санкт-Петербурге и Архангельске (Захаров, Шайкевич, 2011; Zakharov, Shaikevich, 2013) обнаружен нами и у особей A. b. revelierei из популяции Еревана. Мт-гаплотип Н10 был обнаружен нами в популяциях A. b. bipunctata на севере Европейской части России в Санкт-Петербурге, Архангельске, Кеми, а также и у особей A. b. fasciatopunctata на востоке страны в Забайкалье, Улан-Уде, Бурятия (Zakharov, Shaikevich, 2013). В отличие от мтДНК область ITS2 оказалась абсолютно консервативной. Все изученные особи A. bipunctata, вне зависимости от митохондриального гаплотипа, обладали практически идентичными последовательностями ITS2. Проведенный анализ структуры ДНК A. b. fasciatopunctata, A. b. revelierei и A. b. turanica, не обнаружил разницы в нуклеотидном составе ДНК изученных генов. На основании анализа ДНК нельзя считать морфологически различающиеся формы A. b. bipunctata, A. b. fasciatopunctata, A. b. revelierei и A. b. turanica отдельными самостоятельными видами. Можно утверждать, что A. b. fasciatopunctata, A. b. revelierei и A. b. turanica, иногда описываемые как отдельные виды, являются лишь географическими формами политипического вида Adalia bipunctata. Из других видов жуков рода Adalia, к A. bipunctata наиболее эволюционно близким видом является A. frigida (Zakharov, Shaikevich, 2013). Отношение коровок данного вида к комплексу Adalia bipunctata остается до конца не выясненным. Я. Я. Лусис отмечал репродуктивную изолированность жуков A. bipunctata и A. frigida, хотя и наблюдал появление гибридов первого поколения, а нарушение процессов размножения проявлялись только со второго поколения (Лусис, 1976). Смешанные популяции и копулирующие особи A. frigida с типичными A. bipunctata наблюдались в Забайкалье, где были обнаружены также и существенные экологические и поведенческие различия между ними. В работе Бутько Е. В. были выявлены различные предпочтения мест зимовок и питания особей двух видов и предполагается существование частичной пространственной (биотопической), временной и поведенческой изоляции особей A. frigida в пределах забайкальских популяций А. bipunctata (Бутько, 2005). На основании анализа ДНК виды A. bipunctata и A. frigida различаются по нуклеотидному составу области ITS2 на 1,8 %, гена COI на 4,3 % (табл. 2, рис. 2), при этом различия по двум исследованным нами участкам генома сохраняются в удаленных друг от друга популяциях. Изменчивость ДНК гена COI между особями A. frigida из Архангельска и Сибири составляет 0,7 %, что свидетельствует о возрасте расхождения данных популяций в 0-130 тысяч лет, если считать скорость возникновения мутаций в мтДНК равной 6 × 10-8, принятую для Drosophila (Haag-Liautard et al., 2008) и среднее число генераций в год - 1,5. Анализ нуклеотидных последовательностей COI и ITS2 у божьих коровок, морфологически схожих с A. frigida из Читы и Якутии, выявил случаи, когда особи с фенотипом одного вида имели ДНК другого вида. Одним из объяснений может быть то, что это гибриды первого поколения, как те, что наблюдал Я. Я. Лусис (1976), другим - митохондриальная интрогрессия среди A. bipunctata и A. frigida, но тогда следует признать фертильность гибридов и возможность возвратных скрещиваний с родительскими видами в природе. Итак, выше изложенные результаты подтвердили существование в роде Adalia двух, вероятно, скрещивающихся в зонах симпатрии, близких, но самостоятельных видов Adalia bipunctata Linnaeus, 1758 и Adalia frigida Schneider, 1792. Ранее мы, с использованием тех же молекулярно-генетических методов, подтвердили видовой статус Adalia decempunctata и Adalia tetraspilota (Zakharov, Shaikevich, 2013). Данные настоящего исследования позволяют «закрыть» виды A. revelierei, A. turanica и A. fasciatopunctata, которые оказываются географическими разновидностями (или подвидами) A. bipunctata, как и считал в свое время Я. Я. Лусис (1973). Изученные в настоящей работе формы A.bipunctata со многими пятнами на красных или розовых надкрылиях, которые входят в состав полиморфных популяций подвидов A. b. revelierei, A. b. turanica, A. b. fasciatopunctata, являются проявлением аллелей гена S. Другие аллели этого гена определяют «европейские» варианты окраски и рисунка надкрылий - красную с двумя точками, либо черную с красными пятнами (Лус, 1928; Лусис 1973; Захаров, 1996). Обращает на себя внимание тот факт, что формы A. bipunctata со многими пятнами никогда не встречаются в Европе. Они характерны только для регионов с резко-континентальным климатом и со степной или полупустынной растительностью: Армении, Киргизии, Узбекистана, Монголии, Тувы, Бурятии, Забайкалья. Можно предположить, что либо соответствующие такому рисунку аллели сами имеют плейотропный физиологический эффект, либо они тесно сцеплены (образуют устойчивые гаплотипы) с генами, благоприятствующими выживанию в условиях резко континентального и засушливого климата. В более влажных регионах - Европе, Сибири, эти генотипические варианты оказываются неадаптивными и не поддерживаются в популяциях.

About the authors

Ilya Artemyevich Zakharov

Vavilov Institute of General Genetics RAS

Email: iaz@mail.ru
Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences. Laboratory of insects genetics

Yelena Vladimirovna Shaikevich

Vavilov Institute of General Genetics RAS

Email: elenashaikevich@mail.ru
Senior researcher, PhD. Laboratory of insects genetics

References

Supplementary files