MOLECULAR-GENETIC FOUNDATIONS OF RICE DOMESTICATION: CONTROL OF SEED SHATTERING, GRAIN SIZE, AND PERICARP COLOR

Full Text

Доместикация ‒ самая ранняя форма селекции растений и одна из самых важных технологических инноваций в истории человечества. В процессе одомашнивания у культурных растений сформировался общий набор признаков, известный как «синдром доместикации».

Основные признаки синдрома доместикации сельскохозяйственных культур можно свести к следующим шести характеристикам: 1. утрата или снижение способности к естественному рассеиванию семян; 2. снижение способности к саморазмножению; 3. увеличение размера семян и плодов; 4. отсутствие периода покоя семян; 5. переход от многолетнего к однолетнему жизненному циклу; 6. компактный габитус [1]. 

Пять основных зерновых культур, таких как пшеница, рис, кукуруза, ячмень и сорго, были одними из первых растений, возделываемых в эпоху неолита, что способствовало становлению ранних сельскохозяйственных обществ. С тех пор они остаются основным источником калорий для большинства людей [2]. Богатые археологические и молекулярные данные позволили получить важные сведения об истории одомашнивания зерновых культур и проследить закономерности в приобретении ими признаков синдрома доместикации.

Рис является одной из важнейших культур в мире, более 90% мирового производства и потребления риса приходится на Азию [3]. Согласно археологическим исследованиям в средних и нижних течениях реки Янцзы современный культивируемый рис (Oryza sativa L.) был одомашнен из дикого риса (Oryza rufipogon G.) около 10 000 лет назад [4]. В процессе одомашнивания произошли изменения формы и цвета семян, потеря периода покоя, увеличение числа семян, снижение осыпаемости и увеличение урожайности.

У риса, как и других зерновых культур, снижение осыпаемости семян является одним из наиболее значительных изменений в процессе одомашнивания. Степень осыпания является не только одной из основных причин снижения урожайности риса, но и влияет на пригодность к современным механическим методам уборки [5]. Осыпание также является препятствием для включения в селекционные программы диких видов, поскольку данный признак наследуется сцепленно с желаемыми хозяйственно-ценными признаками [6].

Размер зерна является основным фактором, определяющим массу зерна, и одним из основных компонентов структуры урожая (количество метелок на растение, количество зерен на метелку и масса зерна). В селекции размер зерна обычно оценивается по массе зерна, которая положительно коррелирует с несколькими признаками, включая длину, ширину и толщину зерна [7]. Однако, существует обратная корреляция с показателями качества урожая.

Доместикация белого риса вместо красного или черного обусловлена рядом факторов, связанных с агрономическими, пищевыми и культурными аспектами. Белый рис (особенно сорта Oryza sativa subsp. japonica и Oryza sativa subsp. indica) оказался более урожайным и приспособленным к различным климатическим условиям. Он легко адаптировался к различным технологиям возделывания на заливных полях и сухих террасах, что позволило ему распространиться на большие территории [8].

Белый рис легче очищать и обрабатывать. Удаление отрубей и шелухи делает белый рис более усвояемым и универсальным для приготовления различных блюд. Полированный белый рис лучше хранится, что важно для создания продовольственных запасов и торговли​ [9]. Нейтральный вкус и мягкость сделали его предпочтительным в кулинарии многих народов, что способствовало его широкому распространению​ [11]. 

Широкому распространению риса способствовали значительные изменения ряда признаков в ходе одомашнивания: изменение осыпания зерна, размер и окраска зерновок. Геномное секвенирование большого количества сортов и линий риса способствовало глубокому изучению молекулярно-биологических основ этих изменений. В обзоре рассматриваются последние данные о генах, вовлеченных в контроль признаков риса, подвергшихся наиболее интенсивному одомашниванию.

 

Осыпание семян риса

Осыпание семян ‒ важный механизм адаптации, выражающийся в способности к естественному опадению семян после их созревания, и наблюдаемый у диких и сорных видов растений. Его эволюционное значение заключается в обеспечении эффективного рассеивания семян и формирования почвенного банка семян, что в будущем будет способствовать образованию устойчивых популяций, тем самым повышая приспособленность вида к условиям окружающей среды [12].

Однако этот признак является нежелательным у одомашненных культур, в процессе доместикации которых предпринимались последовательные усилия по его минимизации с помощью традиционных и молекулярных методов селекции, так как осыпание семян может приводить к значительным потерям урожая в коммерческом сельском хозяйстве [5].

Неосыпаемость семян у культурного риса является одним из основных изменений и важным признаком перехода от дикого риса к культурному. Это также обеспечивает пригодность к современным методам механизированной уборки, значительно повышает урожайность и вносит существенный вклад в обеспечение продовольственной безопасности [5].

Осыпание семян риса ‒ сложный хозяйственно-ценный признак, который регулируется физиологическими и генетическими механизмами в сочетании с факторами окружающей среды. К осыпанию семян у риса приводит развитие отделительного слоя между колоском и цветочной осью, и его последующее разрушение. Изучение оснований колосков одомашненного риса и диких осыпающихся видов показало, что основания колосков одомашненных видов характеризуются наличием ямочек и менее симметричными рубцами, в то время как у диких видов основания колосков имеют гладкий рубец с прямым профилем [13, 14]Кроме того, у дикого риса отделительный слой формируется до цветения и начинает разрушаться во время цветения, в то время как у культурного риса отделительный слой остается нетронутым и не проявляет признаков деградации даже после цветения [15].

Осыпание семян сильно зависит от взаимодействия генотипа и окружающей среды. Хотя признак контролируется генетически, на степень осыпания влияют и условия окружающей среды, в которых растение находится во время роста. В частности, на осыпание семян влияют температура, влажность воздуха и увлажненность. Показано, что высокая температура увеличивает осыпание семян у риса [12].

В настоящее время распространено мнение, что осыпание семян является количественным признаком, который может контролироваться несколькими генами или несколькими основными и множеством второстепенных генов. До 2020 года с использованием различных генетических популяций и карт сцепления на 12 хромосомах риса было обнаружено не менее 60 QTL/генов, связанных с осыпанием семян. Большинство QTL были идентифицированы путем скрещивания между двумя подвидами риса посевного japonica (O. sativa L. subsp. japonica Kato) и indica (O. sativa L. subsp. indica Kato), диким рисом (O. rufipogon G.) и сорным рисом (Oryza spp.). Очень немногие QTL были идентифицированы путем скрещивания между подвидами риса посевного japonica и indica, что отражает разнообразие генотипов, склонных к осыпанию семян, как внутри вида, так и между видами.

К настоящему времени клонировано 12 генов, связанных с осыпанием семян, среди которых qSH1, SH4, Sh1/ObSH3, SHAT1, SH5, CPL1, SNB и ObSH11 являются основными генами, контролирующими образование отделительного слоя. OSH15, GRF4/PT2, NPC1 и LG1 – гены с плейотропным действием, оказывающие значительное влияние на другие агрономические признаки. Большинство этих генов кодируют транскрипционные факторы, такими как транскрипционные факторы семейства MYB ‒ SH4 и OgSH11, транскрипционный фактор гомеобокс-типа BEL-1 ‒ qSH1, KNOX белок SH5, транскрипционные факторы семейства AP2 ‒ SNB и SHAT1, транскрипционный фактор YABBY ‒ Sh1/ObSH3. Кроме того, некоторые из них кодируют киназы, такие как CPL1 и NPC1 [5].

Мутации транскрипционного фактора MYB SH4 приводят к неосыпающемуся фенотипу, как у азиатского (O. sativa), так и у африканского (O. glaberrima) культурного риса, которые были одомашнены из двух видов дикого риса O. rufipogon и O. barthii, соответственно. Мутация (G/T) в 237 положении в первом экзоне аллели SH4 в культурном азиатском рисе обуславливает замену аспарагиновой кислоты на серин, что приводит к неполному развитию отделительного слоя [14]. Исследователи локализовали и клонировали ген SHA1 (Shattering 1), используя серию возвратных скрещиваний между культурным рисом сорта Teqing и интродукционной линией IL105 с осыпающимися семенами, происходящей от линии многолетнего дикого риса YJCWR. Аминокислотные последовательности белков SHA1 и SH4 на 98% совпадают, и мутация G/T также обнаружена в положении 237 в кодирующей последовательности. Однако гистологический анализ  развития отделительного слоя у осыпающегося и неосыпающегося риса и анализ уровня накопления транскрипта в цветоносе показали, что ген SHA1 не участвует в формировании отделительного слоя, но связан с деградацией его клеток. По сравнению с геном SH4, последовательность гена SHA1 имеет дополнительную вставку 6 п.н. в положении 158–163, что может приводить к различным функциям этих двух генов. Хотя ген-мишень SH4 неизвестен, он может участвовать в программируемой гибели клеток или высвобождении гидролитических ферментов [16].

SNP (однонуклеотидный полиморфизм) в регуляторной 5’-области гена qSH1, который является ортологом гена RPL (REPLUMLESS) у Arabidopsis thaliana (контролирует развитие перегородки в стручке) [17], вызывает потерю осыпания семян из-за отсутствия формирования отделительного слоя. Этот SNP объясняет 68,6% разницы в осыпании между подвидами риса indica и japonica []. Другой ген типа BEL1-homeobox SH5 имеет высокое сходство с геном qSH1. Чтобы выяснить его функциональную роль были созданы трансгенные растения с конструкцией для РНК-интерференции гена SH5 на основе легко осыпающегося сорта Kasalath. Развитие отделительного слоя и потеря семян уменьшаются, когда экспрессия гена SH5 подавляется. Кроме того, сверхэкспрессия гена SH5 в умеренно осыпающемся сорте Dongjin и неосыпающемся сорте Ilpum приводит к увеличению осыпания семян, так как снижается уровень лигнина в базальной области колоса [19].

Сорт риса подвида indica GLA4 и линия дикого риса W1943 были использованы для создания интродукционной линии SL4, содержащей клонированные гены SH4 и qSH1. С применением радиационного мутагенеза из линии SL4 были выделены и идентифицированы два мутанта с неосыпающимися семенами, shat1 и shat2, даже когда гены SH4 и qSH1 присутствовали вместе. Потеря осыпания у shat1 контролируется геном SHAT1 (shattering abortion1), который кодирует транскрипционный фактор AP2. У shat2 неосыпаемость вызвана мутацией в известном гене осыпания SH4. Делеция 1 п.н. в первом экзоне между нуклеотидами +41 и +42 у мутанта shat1 привела к сдвигу рамки считывания, что вызвало формирование фенотипа, не подверженного осыпанию [20]. Интродукционная линия дикого риса YIL100, характеризующаяся сильным осыпанием, использовалась для создания EMS мутантной библиотеки и отбора мутанта ssh1 (suppression of shattering1) с уменьшенной степенью осыпания. В сочетании с картированием MutMap и экспериментом по генетической трансформации был идентифицировАнализ консервативного домена показал, что локус GW2 гомологиченана аллель SSH1, гена SNB (SUPERNUMERARY BRACT), кодирующий специфический для растений транскрипционный фактор AP2, который контролирует осыпание. Точечная мутация с заменой C на A в девятом интроне SNB изменяет сплайсинг его мРНК, вызывая уменьшение осыпания за счет изменения развития отделительного слоя. Введение мутантной аллели ssh1 в сорт риса подвида indica 93-11 также увеличивает длину зерна на 9,5% и массу 1000 зерен на 7,7%, что указывает на то, что аллель ssh1 может улучшить урожайность риса [21].

Ген OsSh1 (Shattering1) кодирует транскрипционный фактор YABBY и является гомологом гена sh1, который контролирует осыпание семян у сорго. Используя мутантную линию неосыпающегося риса (SR-5) и селекционную линию дикого риса (Nanjing 11), был проведен геномный сравнительный анализ и анализ экспрессии на уровне транскрипции, и идентифицирована вставка фрагмента больше 4 т.п.н. в третьем интроне гена OsSh1, что привело к снижению уровня его транскрипции и фенотипу, устойчивому к осыпанию [22]. Ген ObSH3 (O. barthii seed shattering 3), выявленный у дикого африканского риса, расположен на хромосоме 3 и кодирует транскрипционный фактор YABBY. Делеция сегмента генома, содержащего ген ObSH3 в африканском культурном рисе, приводит к асимметричному и неполному развитию отделительного слоя и, как следствие, к потере осыпания [23]. 

Исследователи охарактеризовали линию риса Hsh, которая происходит от неосыпающегося сорта подвида japonica Hwacheong. Было выявлено, что осыпание Hsh контролируется рецессивной аллелью sh-h, которая кодирует белок, содержащий консервативный домен фосфатазы (carboxy-terminal domain, CTD), под названием OsCPL1 (Oryza sativa CTD phosphatase-like1). OsCPL1 подавляет дифференциацию отделительного слоя во время развития метелки [6]. 

Показано, что ген NPC1 (non-specific phospholipase C1) модулирует распределение кремния и отложение вторичной клеточной стенки в узлах и зернах, влияя на механическую прочность и осыпание семян. Линии со сверхэкспрессией гена NPC1 имеют хрупкие стебли и узлы метелок, которые легко ломаются при сгибании, что приводит к легкому осыпанию зрелых семян [24].

Ген OSH15 (O. sativa homeobox 15) кодирует белок с гомеодоменом типа knotted. Предыдущие исследования показали, что OSH15 экспрессируется в области, где позже развивается апикальная меристема побега на ранних стадиях эмбриогенеза, также мРНК гена OSH15 обнаруживаются в отделительном слое во время развития колосков. Кроме того, гены OSH15 и SH5 взаимодействуют напрямую с геном фенилпропаноидного пути биосинтеза CAD2 (cinnamyl alcohol dehydrogenase 2), ингибируя содержание лигнина, что приводит к снижению осыпания семян [25]. 

Ген GRF4 (Growth-Regulating Factor 4) кодирует транскрипционный фактор, регулирующий высоту растения, который положительно влияет на форму зерна и длину метелки и отрицательно влияет на осыпание семян. Более высокая экспрессия гена GRF4 коррелирует с более крупным зерном, более длинной метелкой и меньшим осыпанием семян. Экспрессия негативно регулируется миРНК (ген OsmiRNA396), которая связывается с мРНК гена GRF4. Доминантная мутация GRF4 в сайте связывания с миРНК396 приводит к более высокой экспрессии гена и соответствующим фенотипическим различиям. Кроме того, ген OsGRF4 негативно регулирует экспрессию генов цитокининдегидрогеназ CKX5 и CKX1, участвующих в разрушении цитокининов, что приводит к повышению их уровня у мутанта GRF4 и может влиять на признаки метелки [9].

Локус SPR3 (Spreading Panicle 3) идентифицирован как геномная область размером 9.3 т.п.н., и результаты тестов по комплементации позволяют предполагать, что эта область регулирует экспрессию гена OsLG1 (liguleless gene 1), который контролирует развитие лигулы и ушков листа. Мутация в локусе SPR3 у O. rufipogon изменяет структуру метелки с открытой на закрытую, что приводит к снижению осыпаемости семян [10]. Также продемонстрировано, что у африканского культурного риса O. glaberrima происходит значительное снижение осыпания семян при нокауте гена SH11, так как OgSH11 подавляет экспрессию генов биосинтеза лигнина и отложение лигнина, связываясь с промотором гена GH2 (gold hulland internode-2)/CAD2. Однако этот ген, называемый JAMyb/MYb21 у O. sativa, связан с реакцией на биотические и абиотические стрессы, и ранее не было сообщений об исследованиях, связанных с осыпанием семян риса [9].

 

Размер зерна риса

Размер и качество зерна ‒ неразрывно связанные важные агрономические признаки большинства зерновых культур. Размер зерен или плодов ‒ важный признак, который стал объектом многочисленных исследований, направленных на изучение лежащих в его основе консервативных регуляторных механизмов. В отличие от других зерновых, в том числе кукурузы и пшеницы, где искусственный отбор связан с почти равномерным увеличением размера семян и зерен, одомашненный рис характеризуется значительным фенотипическим разнообразием размеров и формы зерен [27, 28]. 

Одним из ключевых элементов урожайности риса является масса тысячи зерен. Размер зерна - сложный количественный признак, включающий в себя длину, ширину, толщину и соотношение длины и ширины зерна, - является одним из определяющих факторов массы зерна, который влияет не только на урожайность, но и на внешний вид риса. Понимание генетической и молекулярной основы размера зерна чрезвычайно важно для селекции риса [29, 30].

В последнее десятилетие было выявлено множество QTL, связанных с размером зерна риса. В большинстве случаев молекулярная характеристика генов, влияющих на размер зерна (таких как GS3, GW2 и ТGW6), показывает, что многие из них являются негативными регуляторами размера зерна, так что аллели дикого типа связаны с мелким зерном, в то время как мутации связаны с крупным зерном [31]. При этом, некоторые изученные локусы не участвовали в процессе доместикации, но на фоне современных селекционных достижений могут внести свой вклад в улучшение сортов [32].

Так, был изучен локус GW2. Исследователи подобрали сорта, значительно отличавшиеся по изучаемому признаку – размеру зерна. Был скрещен японский сорт WY3 с очень крупным зерном (масса 1000 зерен 41,9 г ± 1,3 г) и высококачественный элитный сорт подвида indica Fengaizhan-1 (FAZ1) с мелким зерном (масса 1000 зерен 17,9 ± 0,7 г) для получения популяции F2. На основе этой популяции на хромосоме 2 был картирован крупный QTL, контролирующий ширину зерновки - GW2, причем аллель WY3 в локусе GW2 способствовала увеличению ширины зерновки [33].

В аллели FAZ1 локуса GW2 исследователи выявили 8 экзонов и 7 интронов, он кодирует полипептид длиной 425 аминокислотных остатков. Сравнение нуклеотидных последовательностей аллелей FAZ1 и WY3 в локусе GW2 выявило три нуклеотидных изменения, включая две нуклеотидные замены в экзонах 1 и 8, которые не привели к каким-либо аминокислотным изменениям, и делецию 1 п.н., приведшую к образованию преждевременного стоп-кодона в экзоне 4 аллеля WY3. Преждевременный стоп-кодон привел к укорочению белка на 310 аминокислотных остатков [33].

Анализ консервативного домена показал, что локус GW2 гомологичен последовательности белка RING-типа. В ряде исследований было показано, что in vitro белки RING-типа функционируют как E3 убиквитин-лигазы, помечая белки для последующей деградации [48]. Кроме того, вариант WY3 локуса GW2 имеет интактный RING домен, тем самым сохраняя E3-убиквитин-лигазную активность, но усечен на 310 аминокислот, которые могут содержать субстрат-связывающий домен. (т.е. не взаимодействует с субстратом(ами), участвующим(и) в делении клеток, и не направляет их на убиквитинирование и последующую деградацию). Отсутствие субстрат-связывающего домена позволяет предположить, что WY3 GW2 является нулевым аллелем [33].

Чтобы изучить влияние GW2 на зерно риса, исследователи вывели почти изогенную линию NIL (near isogenic line) GW2 на генетическом фоне FAZ1, содержащую очень небольшой участок локуса GW2 из сорта WY3. Наблюдалось значительное увеличение ширины зерна (+26,2%) и увеличение (+49,8%) массы 1000 зерен у изогенной линии  NIL(GW2). Из этого можно сделать вывод, что увеличение массы зерна у линии NIL(GW2) было обусловлено в первую очередь увеличением ширины зерна. Было обнаружено, что урожайность зерна с одного растения у NIL(GW2) также увеличилась (+19,7%), хотя количество зерен на основной метелке было меньше [33].

Учитывая, что колосок у линии NIL(GW2) был шире, чем у сорта FAZ1, сравнили поперечные срезы центральной части колоса у этих форм, чтобы выяснить происхождение наблюдаемых различий в размерах. Наружный слой клеток паренхимы у линии NIL(GW2) был длиннее (на 29,6%) и содержал значительно больше клеток (на 22,4%), чем у сорта FAZ1, при этом длина клеток увеличилась всего на 5,8%. Эти данные свидетельствуют о том, что увеличение ширины зерна происходит за счёт увеличения количества клеток, а не за счет их растяжения [33]. 

При исследовании локуса GS3 были подобраны две родительских линии - Minghui 63 и Chuan 7, значительно различающиеся по изучаемым признакам массы зерна и его длины. Аллель локуса GS3 линии Minghui 63 способствовала увеличению массы, длины и толщины зерна, но уменьшению его ширины. Соответственно, аллель линии Chuan 7 имела обратный эффект – уменьшал массу зерна, его длину и толщину [34].

На основе данных, полученных при изучении изогенных линий, QTL GS3 был картирован на 3 хромосоме в области между индель-маркером GS09 и SSR-маркером MRG5881, его длина составила 7,9 т.п.н. Ген GS3 имеет пять экзонов с длиной транскрипта 956 п.н., кодирует 232 аминокислоты [34].

Анализ предсказанной последовательности белка GS3 выявил несколько известных областей и доменов. Предположительно, он состоит из PEBP-подобного домена, трансмембранной области, цистеин-богатого домена семейства TNFR/NGFR и домена VWFC. Интересно, что что домен VWFC также обнаружен в белке гена, контролирующего форму плода у томата и у других видов растений, из чего можно сделать вывод, что домен VWFC может играть роль в регуляции формы плода/зерна путем негативного влияния на рост [35]. Предполагается, что общая функция домена VWFC заключается в регулировании роста путем разрушения сайтов связывания рецепторов суперсемейства TGF-beta во внеклеточном матриксе [36].

Для выявления мутации, вызвавшей вариации длины зерна, был проведен анализ последовательности гомологичного фрагмента ДНК в области 7,9 т.п.н. Была обнаружена однонуклеотидная мутация во втором экзоне гена GS3, которая изменила цистеиновый кодон (TGC) в мелкозерновом генотипе на терминирующий кодон (TGA) в генотипе с крупным зерном. Эта преждевременная терминация - причина усечения С-конца белка в группе с длинным зерном на 178 аминокислот, что привело к удалению части PEBP-подобного домена и всех трех других консервативных доменов. Такая мутация четко согласуется с рецессивным характером наследования длинного зерна, указывая на то, что длинное зерно возникло в результате потери функции белка [34].

Используя популяцию удвоенных гаплоидов, полученную от скрещивания линий Zhenshan 97 и H94 подвида Oryza sativa L. ssp. indica, был обнаружен QTL GS5 (область размером 11,6 т.п.н.) в интервале между двумя молекулярными маркерами RM574 и S2 на коротком плече хромосомы 5, причем аллель из линии Zhenshan 97 способствовала повышению урожайности [31].

При исследовании влияния гена GS5 на размер и наполняемость зерна выяснилось, что увеличение массы зерна и урожайности с одного растения произошло в результате увеличения как ширины зерна, так и скорости его наполнения [31].

Ген GS5 состоит из десяти экзонов, кодирующих сериновую карбоксипептидазу, принадлежащую к семейству пептидаз S10. Было проведено сравнение геномных последовательностей, соответствующих кодирующим и промоторным областям GS5, между сортами с узким и широким зерном [37]. Две узкозерных линии (H94 и Minghui 63) имели идентичные последовательности, которые сильно отличались от последовательностей широкозерной линии Zhenshan 97. Кодирующие последовательности гена GS5 у линий H94 и Minghui 63 имеют длину 1440 п.н. и кодируют полипептид из 480 аминокислот, в то время как кодирующая последовательность у линии Zhenshan 97 состоит из 1446 п.н. и кодирует полипептид из 482 аминокислот. Шесть оснований встроены на 10-15 п.н. ниже сайта начала трансляции в Zhenshan 97, по сравнению с H94 и Minghui 63, что привело к увеличению белка на 2 аминокислоты в районе предсказанного сигнального пептида. Кроме того,  между двумя группами линий имелось четыре нуклеотидных различия в последовательностях, которые привели к заменам трех аминокислот. Сравнение промоторных последовательностей выявило 18 полиморфизмов в области 2 т.п.н. перед сайтом начала трансляции, включая замены, делеции и инсерции, в одной группе по сравнению с другой [37]. 

Для изучения механизмов, лежащих в основе различий между узко- и широкозерными линиями, провели секвенирование области, содержащей ген GS5, а также была проведена генетическая трансформация конструкциями с промотором вируса мозаики цветной капусты 35S и промоторной области гена GS5 длиной 2 т.п.н. из линии Zhenshan 97, слитыми с кДНК гена GS5 линии H94 (узкое зерно). Из результатов экспериментов исследователи сделали вывод, что влияние гена GS5 на размер зерна обусловлено вариациями в промоторной области, а не в кодирующей [37]. 

Анализ расщепления в потомстве вышеупомянутых генетически-трансформированных линий показал, что ширина зерна значительно (P < 0,01) коррелирует с уровнем экспрессии гена GS5: растения с более высоким уровнем экспрессии дают более широкие зерна [37].

Эти результаты позволяют предположить, что ген GS5 положительно регулирует размер зерна, увеличивая число клеток и, в некоторой степени, их размер, что приводит к усилению роста зерна в ширину. Деление клеток в эукариотических организмах контролируется высококонсервативным основным механизмом клеточного цикла. Чтобы изучить связь GS5 с генами, регулирующими клеточный цикл растений, провели поиск в базе данных Rice Genome Browser. В результате поиска было выявлено 25 генов, в том числе 14, предположительно участвующих в фазахG1/S и 11 - в фазе G2/M. Была проанализирована экспрессия этих 25 генов в растениях, несущих мутацию gs5, и в растениях, сверхэкспрессирующих GS5, по сравнению с диким типом. Уровни транскриптов пяти предполагаемых генов, контролирующих G1/S-фазы, - CDKA1, CAK1, CAK1A, CYCT1 и H1 - были значительно повышены в растениях, сверхэкспрессирующих GS5, по сравнению с растениями, не несущими трансген. Напротив, экспрессия этих пяти генов была значительно снижена у мутанта gs5 по сравнению с диким типом [38, 39, 40, 41, 42, 43]. Таким образом, GS5 функционирует, предположительно, как положительный модулятор генов клеточного цикла, и его сверхэкспрессия может приводить к увеличению числа клеток за счет стимулирования митотического деления [31].

Ген TGW6 (THOUSAND-GRAIN WEIGHT 6), вероятно, не имел приоритета для отбора при одомашнивании, однако у современных сортов TGW6 может повышать урожайность, поскольку он оказывает плейотропное влияние на продуктивность и размер запасающих органов [44, 45, 46].

Ishimaru и др. [32]  картировали локус TGW6 из бекроссированных инбредных линий (NIL), полученных от японского высокоурожайного сорта Nipponbare и индийского местного сорта Kasalath на участке 4,9 т.п.н. между маркерами G214 и G232 на 6 хромосоме. Аллель TGW6 у сорта Kasalath, в отличии от Nipponbare, содержал шесть нуклеотидных замен и делецию 1 п.н. в положении 313. Эта делеция вызвала сдвиг рамки считывания и остановила образование полноценного белка из-за появления преждевременного стоп-кодона, тогда как шесть нуклеотидных замен не имели никакого влияния на биосинтез белка. Таким образом, сдвиг рамки считывания мог привести к формированию нефункционального белка TGW6 у сорта Nipponbare.

В тесте на комплементацию растения Nipponbare и NIL(TGW6) были трансформированы генетической конструкцией для РНК-интерференции (RNAi) изучаемого локуса. У трансформантов Nipponbare длина зерна и масса тысячи зёрен была значительно выше, чем в контроле. При этом экспрессия tgw6 была ниже, чем в контроле, а относительный уровень экспрессии отрицательно коррелировал с длиной зерна. У NIL(TGW6), напротив, ведение конструкции RNAi не повлияло на длину зерна у трансформантов. Из этого следует, что делеция 313 нуклеотида является функциональным нуклеотидным полиморфизмом (FNP) для TGW6 [32].

С помощью ПЦР-РВ было показано, что ген TGW6 экспрессируется в зернах риса и запасающих органах, в частности, особенно высок уровень экспрессии в метелках. При этом транскрипты TGW6 накапливались вокруг эндосперма в перикарпе [47]. При сравнении продольных срезов зрелых зерен Nipponbare и NIL(TGW6) количество клеток эндосперма у NIL(TGW6) было значительно больше (на 24 %), чем у Nipponbare, в то время как длина клеток эндосперма была одинаковой [32].

Исследователи на основании структуры белка TGW6 сравнили последовательности и трехмерные структуры белков TGW6 из Nipponbare, стриксозидинсинтазы (STR1) и диизопропилфторфосфатазы (DFPase) [48, 40]. Они показали их значительное сходство между собой, что позволяет предположить гидролизующую активностью белка TGW6. Так, при помощи молекулярного докинга было показано, что коньюгаты индол-3-уксусной кислоты (ИУК), в частности ИУК-глюкоза, могут быть субстратом для TGW6 [32]. Таким образом, белок TGW6 из сорта Nipponbare, видимо, гидролизовал ИУК-глюкозу с образованием ИУК и глюкозы, а TGW6 сорта Kasalath  – нет.

В целом, аллель tgw6 Nipponbare, по-видимому, влияет на время перехода от синцитиальной к клеточной фазе, контролируя поступление гормонов, и, следовательно, ограничивает число клеток и длину зерна. Поэтому потеря функции в аллеле Kasalath оказала желательное влияние на размер зерна [49, 50].

 

Окраска зерна риса

Накопление антоцианов у риса ‒ признак, связанный с одомашниванием, который может использоваться для отслеживания эволюционной истории риса [51]. Цвет зерна злаков определяется пигментацией определенных фитохимических веществ. У риса (O. sativa L.) большинство сортов имеют белые зерна, но некоторые сорта имеют коричневые, красные или черные зерна. Красный цвет зерен обусловлен отложением и окислительной полимеризацией проантоцианидинов в перикарпе, в то время как черный цвет зерен обусловлен накоплением антоцианов [52].

Антоцианы являются водорастворимыми вторичными метаболитами, наиболее часто встречающимися агликонами у растений являются цианидин, пеонидин, пеларгонидин  и дельфинидин. Биосинтез антоцианов начинается с соединений малонил-KoA и п-кумароил-KoA. Халконсинтаза (CHS) катализирует синтез тетрагидроксихалкона  из п-кумароил-KoA и трех молекул малонил-KoA. Тетрагидроксихалкон превращается в нарингинин под действием халконизомеразы (CHI), а затем в дигидрокемпферол (DHK) с помощью флаванон-3-гидроксилазы (F3H). Из DHK может образовываться дигидрокверцетин (DHQ) с помощью флавоноид-3'-гидроксилазы (F3'H) и дигидромирицетин (DHM) за счет флавоноид-3',5'-гидроксилазы (F3'5'H) [47].

Дигидрофлавонолы (DHK, DHQ, DHM) превращаются в антоцианы в три этапа: восстановление дигидрофлавонолов дигидрофлавонолредуктазой (DFR) до лейкоантоцианидинов, далее происходит окисление лейкоантоцианидинов до антоцианидинов лейкоантоцианидиноксидазой (LDOX), после чего происходит гликозилирование антоцианидинов 3-глюкозилтрансферазой (3GT) с образованием антоцианидин-3-O-глюкозидов (антоцианов).

Антоцианидин-3-O-глюкозиды могут подвергаться дальнейшим модификациям (гликозилирование, метилирование, ацетилирование), образуя различные декорированные антоцианы. В окрашенном рисе наиболее распространен цианидин-3-O-глюкозид, а красный цвет семян обусловлен проантоцианидинами - полимеризованными катехинами и эпикатехинами, синтез которых начинается с восстановления лейкоантоцианидинов цианидиналейкоантоцианидинредуктазой (LAR) или  антоцианидинов антоцианидинредуктазой (ANR) [53, 54]. Антоцианы и проантоцианидины играют важную роль не только в пигментации семян, но и в защите растений от различных биотических и абиотических стрессов. Эти соединения имеют сильные антиоксидантные свойства, что делает их полезными для здоровья человека [55]. 

Окраска риса контролируется двумя ключевыми механизмами: структурными генами и регуляторными факторами транскрипции (TF).

Структурные гены кодируют ферменты, необходимые для синтеза антоцианов. Важным примером является ген, кодирующий фермент DFR, который участвует в преобразовании дигидрофлавонолов в лейкоантоцианидины, критический этап в пути биосинтеза антоцианов​ [56]​.

У риса известны гены/локусы Rd, Rc и A, которые  играют ключевую роль в синтезе проантоцианидинов и ответственны за пигментацию перикарпа риса. Генетический анализ с использованием SSR и QTL-маркеров показал, что ген Rd расположен на первой хромосоме риса между маркерами R2374 и C808, а локус А на расстоянии 0,3 сМ от него. Вероятно, локусы Rd и A идентичны, и оба кодируют дигидрофлавонол-4-редуктазу (DFR). Введение функциональной копии гена DFR в коричневозерную линию риса с генотипом Rcrd привело к получению растений риса с красным зерном за счет накопления проантоцианидинов, что подтверждает, что локус Rd кодирует белок DFR. Анализ белков у трансформированных линий риса, проведенный методом вестерн-блотинга, показал наличие трех белков с массами 46, 32 и 22 кДа, которые взаимодействуют с анти-DFR антителами. Это свидетельствует о возможной инициации трансляции мРНК гена DFR с разных старт-кодонов, что приводит к образованию нескольких белков. Белки с массами 32 и 22 кДа были также выявлены в семенах линий с генотипом rcrd, несмотря на наличие стоп-кодона в их последовательностях, что указывает на использование альтернативных старт-кодонов трансляции [57].

Работу структурных генов синтеза регулируют комплексы, состоящие из основных транскрипционных факторов типа R2R3-MYB, bHLH, и WD40. Эти факторы работают совместно, чтобы активировать или подавлять синтез антоцианов в ответ на различные стимулы.​ [58]​. Один из таких TF кодирует ген Rc. 

Для изучения природы гена Rc, контролирующего красную окраску перикарпа риса, была проведена серия экспериментов.  Построение генетической карты на основе морфологических и молекулярных маркеров позволило сделать вывод, что накопление красной окраски зерна контролируется аллелями гена, расположенного в 7-й хромосоме. Эти карты сцепления стали основой для дальнейших исследований и более точного определения генов, ответственных за окраску перикарпа [59].

Красный цвет зерна широко распространен среди диких предков O. sativa, у которых он тесно связан с осыпаемостью семян и состоянием покоя [60, 61], о чём говорит тесное сцепление локуса qSD7-1, ответственного за покой семян, с геном Rc, контролирующим красную окраску перикарпа, на 7 хромосоме [62, 63],   Помимо сцепления, гены окраски зерна у риса могут иметь плейотропный эффект, так, например, ген Rc влияет не только на окраску перикарпа, но и на период покоя семян, за счет своего воздействия на биосинтез абсцизовой кислоты (ABA) и флавоноидов [64]. 

Для поиска изменений в последовательности, которые могли бы объяснить наблюдаемое изменение цвета перикарпа, было проведено секвенирование аллелей гена Rc родительских форм сорта Jefferson O. sativa и линии O. rufipogon, использованных для картирования. В геномной последовательности были обнаружены шесть инделов и 22 однонуклеотидных различия. Секвенированные последовательности также сравнили с общедоступной последовательностью ДНК сорта Nipponbare  (сорт риса подвида japonica с белой окраской перикарпа).  Аллель сорта Jefferson был идентичен последовательности Nipponbare. Учитывая возможность того, что аннотация последовательности Nipponbare может привести к созданию генной модели, отличающейся от доминантной аллели, была проведена аннотация аллели, полученной от Oryza rufipogon. В аннотации Nipponbare были укорочены 3'-конец пятого экзона и 5'-конец шестого экзона по сравнению с генной моделью для O. rufipogon. Это привело к предсказанию более короткой мРНК у Nipponbare, которая оказалась на 513 п.н. короче, чем мРНК O. rufipogon. При сравнении сорта Jefferson и O. rufipogon с учетом этой новой модели гена был выявлен полиморфизм - 10 различий в пределах кодирующей последовательности. Пять из нпи могли повлиять на аминокислотную последовательность белка. Чтобы определить, какое из этих различий в родительских последовательностях может быть ответственен за измененную функцию гена, был отсеквенирован ген Rc (кодирующий транскрипционный фактор с мотивом bHLH) у линии H75 подвида japonica, характеризующегося окрашенным перикарпом и мутантным аллелем Rc.

Результаты показали, что линия H75, так же как и O. rufipogon, несет функциональный аллель Rc, однако генетически он ближе к сорту Jefferson, чем к O. rufipogon. Поэтому сравнение последовательностей гена Rc между линией H75 и сортом Jefferson позволило бы исключить вариации на нуклеотидном уровне между родителями. В результате этого сравнения было выявлено, что кодирующая последовательность аллеля Rc у линии H75 идентична последовательности сорта Jefferson за исключением 14-нуклеотидного инделя в экзоне 6. Эта 14-нуклеотидная вставка присутствовала как у H75, так и у O. rufipogon, но отсутствовала у сортов Jefferson и Nipponbare. Делеция вызывает сдвиг рамки считывания, что приводит к появлению двух преждевременных стоп-кодонов перед концом экзона 6, вызывая образование укороченного белка перед доменом bHLH.

 Учитывая, что эта делеция 14 п.н. была единственным отличием между аллелями в линии H75 и сортах Jefferson и Nipponbare, а её расположение в экзоне 6 согласуется с данными рекомбинации, можно заключить, что она является единственной очевидной причиной отсутствия пигмента в перикарпе зерна сортов Jefferson и Nipponbare [60].

Таким образом, Rc – ген, непосредственно связанный с доместикацией риса, необходим для формирования красного перикарпа у риса (Oryza sativa L.).  Rc кодирует транскрипционный фактор с доменом basic helix-loop-helix (bHLH), картированный на хромосоме 7. Кроме того, этот  транскрипционный фактор, может связываться с промоторными регионами генов, участвующих в биосинтезе ABA, таких как NCED (9-цис-эпокси-каротиноид-диоксигеназы). Это связывание активирует транскрипцию этих генов, что приводит к увеличению синтеза ABA [65]. 

Данные описанных выше исследований позволили отечественным ученым создать тест-систему для определения примеси красного риса в промышленных посевах. Был разработан кодоминантный маркер, позволяющий, начиная с ранних стадий развития растения, выявлять его генотип в отношении аллелей гена Rc. Созданная в данной работе маркерная система может работать при использовании как обеих пар праймеров, так и при использовании каждой пары в отдельности. Опыты со смешиванием ДНК краснозерных и белозерных форм риса в различных пропорциях показали, что разработанная методика выявления краснозерных форм в посевах риса до выметывания метелок способна обнаружить одно краснозерное растение, несущее доминантную аллель гена краснозерности Rc, среди двухсот белозерных, что соответствует краснозерной примеси равной 0,5 %.  Также, у сорта Wells была выявлена точечная мутация (SNP) в гене Rc, которая восстановила рамку считывания, превращая аллель rc, обычно дающую белый перикарп, в доминантную аллель Rc-g. Эта мутация позволила синтезировать нормальный фермент, что привело к красной окраске семян, характерной для дикого типа риса [66].  Тест-система для детекции этой мутации была адаптирована для использования ПЦР-РВ: были подобраны оптимальные условия и проведена оценка чувствительности метода с использованием двух зондов в одной реакционной смеси ПЦР. Показано, что в подобранных условиях ПЦР можно определить признак красного  или белого перикарпа у отдельных растений на стадии проростков. Также система позволяет детектировать наличие 10% примеси краснозерного риса [67].

Исследования, связанные с этим признаком, идут по сей день, и используются все новые методы и технологии изучения. Так, был разработан новый метод, основанный на технологии редактирования CRISPR/Cas9, который позволяет функционально восстанавливать рецессивный аллель rc. Была исправлена делеция 14 п.н., вызывающая сдвиг рамки считывания, путем замены ее на делеции, кратные трём, что позволяет сохранить рамку считывания. Этот подход успешно преобразовал три элитных сорта белого риса в краснозерные. В зерне риса из отредактированных линий T1 - Rc было проанализировано содержание проантоцианидинов и антоцианидинов, высокие уровни накопления проантоцианидинов и антоцианидинов были обнаружены в краснозёрных линиях. Более того, между исходными краснозерными сортами и отредактированными  не было обнаружено значительных различий в основных агрономических характеристиках, что указывает на то, что восстановление функции Rc не оказало отрицательного влияния на важные агрономические характеристики риса. Учитывая, что у большинства белых сортов риса белый перикарп обусловлен 14-нуклеотидной делецией в гене Rc, можно предположить, что этот метод можно применить к большинству белых сортов риса, что значительно ускорит разведение новых сортов красного риса с хозяйственно-ценными признаками [68].

Исследование генов Rc и Rd открывает новые возможности для генетического улучшения сортов риса, направленных на повышение их пищевой ценности и устойчивости к неблагоприятным условиям окружающей среды.

Черная окраска зерна риса, связанная с накоплением антоцианов в перикарпе, не является типичным признаком для большинства культивируемых сортов риса, что свидетельствует о ее уникальности и потенциальном эволюционном значении [69].

Для выявления генов, ответственных за черную окраску перикарпа, исследователи использовали методы классического генетического анализа. Растения сорта Koshihikari с белыми зернами  и сорта HongXieNuo с черными зернами были скрещены между собой для создания поколения F1, от которых путём возвратных скрещиваний с растениями сорта Koshihikari была получена изогенная линия с черным зерном. Для определения участков генома, ассоциированных с черной окраской зерен, был проведен полногеномный анализ с использованием маркеров SSR, сцепленных со всеми 12 хромосомами риса. Это позволило идентифицировать хромосомные регионы, связанные с черной окраской перикарпа. В результате картирования были выявлены три ключевых региона на хромосомах 1, 3 и 4, которые влияли на черную окраску перикарпия. Эти регионы были названы локусами Kala1, Kala3 и Kala4 (от Key gene for black coloration by anthocyanin accumulation on chromosome 1, 3, 4) [70].

Для подтверждения роли выявленных локусов в черной окраске перикарпа и уточнения их расположения был создан гибрид F2 путем скрещивания изогенной линии чернозёрного риса с растениями сорта Koshihikari. В F2 популяции было проанализировано 542 растения, что позволило провести более точное картирование.

 Растения популяции F2 были разделены на группы по цвету зерен: черные, коричневые и белые. Это позволило определить наследование признака черной окраски. Анализ показал, что только растения, гомозиготные по аллелям HongXieNuo всех трех локусов имели черные зерна. В результате этого анализа локус Kala3 был детально картирован, и его локализация была уточнена до района в 516 т.п.н. на хромосоме 3. Используя SSR-маркеры для генотипирования растений F2 также от скрещивания сортов Koshihikari и HongXieNuo, были идентифицированы два маркера, RM3092 и RM2441, между которыми находился целевой ген Kala4 на хромосоме 4..  Более точное картирование провели с использованием трех тысяч растений поколения F2, которые затем генотипировали с использованием двух ПЦР-маркеров (200a/800a и 800bc), расположенных вблизи предполагаемой области расположения гена. После предварительного генотипирования были отобраны 30 растений-рекомбинантов для дальнейшего генотипирования. Для этого использовали семь дополнительных маркеров, расположенных в области гена Os04g0557500. Эти маркеры позволили сузить зону поиска до участка размером 25,6 т.п.н. [52]. 

В между маркерами RM3092 и RM2441 были выявлены три гена, кодирующие bHLH-транскрипционные факторы. Эти гены стали основными кандидатами на роль целевого гена. Для изучения структурных особенностей гена Os04g0557500 были использованы методы секвенирования и гель-блот анализа.  Анализ ДНК показал наличие структурных изменений в области промотора у черных сортов риса. Эти изменения включали вставку 11,0 т.п.н. и частичное дублирование этой вставки. Эти структурные перестройки привели к активации гена Kala4, что в свою очередь вызвало накопление антоцианов и черный цвет перикарпа. Это доказывает, что черный цвет зерен обусловлен эктопической экспрессией гена bHLH-транскрипционного фактора Kala4, вызванной структурными изменениями в его промоторной области [52].

В пределах каждого из локусов, в которых были картированы гены Kala1, Kala3, Kala4, были идентифицированы гены, которые потенциально могут быть ответственны за черную пигментацию. Ген Kala1 соответствует известному структурному гену DFR, который участвует в синтезе антоцианинов. Kala4 соответствует гену, кодирующему bHLH-белок, который также вовлечен в контроль синтеза антоцианинов. Kala3 - регуляторный MYB-ген, который регулирует тканеспецифичную окраску. Анализ генотипов и фенотипов показал, что аллели чернозерного сорта HongXieNuo в локусах Kala1 и Kala3 играют второстепенную роль в окраске риса. Об этом свидетельствует коричневый цвет зерен изогенной линии, которая имеет аллели Koshihikari в локусах Kala1 и Kala3 и аллель HongXieNuo в локусе Kala4. Было определено, что основную роль в наследовании черной окраски играет локус Kala4. Это подтверждается тем, что зерна изогенной линии с аллелями HongXieNuo в локусах Kala1 и Kala3 и аллелью Koshihikari в локусе Kala4 полностью белые. Черную окраску имеют только растения, содержащие аллели HongXieNuo всех трех генов в гомозиготном состоянии [70].

Признак черной окраски зерна риса, скорее всего, является новоприобретенным, появившимся либо во время, либо после одомашнивания риса. По сравнению с широким распространением сортов белого риса, сорта черного риса единично распространены по всей Азии.

 

 Заключение

Эволюционная история риса сложна, но большое количество исследований детально описывает генетику перехода от дикого (O. rufipogon и O. nivara) к одомашненному (O. sativa) рису. Типы задействованных генов, а также молекулярные механизмы их работы (табл. 1) позволят лучше понять пути доместикации и в дальнейшем вывести улучшенные сорта риса [9].

 

Таблица 1. Гены, контролирующие осыпаемость, размер зерна и окраску перикарпа у риса 

Ген	Локус	Предполагаемая функция	Ссылки
Осыпаемость
SH4	Хромосома 4	Кодирует транскрипционный фактор MYB	[14]
SHA1	Хромосома 4	Кодирует транскрипционный фактор семейства Trihelix	[16]
qSH1	Хромосома 1	Кодирует транскрипционный фактор гомеобокс-типа BEL-1	[18]
SH5	Хромосома 5	Кодирует транскрипционный фактор гомеобокс-типа BEL-1	[19]
SHAT1	Хромосома 4	Кодирует транскрипционный фактор AP2	[20]
SNB	Хромосома 7	Кодирует транскрипционный фактор AP2	[21]
OsSh1	Хромосома 1	Кодирует транскрипционный фактор YABBY	[22]
ObSH3	Хромосома 3	Кодирует транскрипционный фактор YABBY	[23]
OsCPL1	Хромосома 7	Кодирует белок, содержащий консервативный домен фосфатазы (carboxy-terminaldomain, CTD)	[6]
NPC1	Хромосома 3	Кодирует неспецифическую фосфолипазу C1	[24]
OSH15	Хромосома 7	Кодирует белок с гомеодоменом типа knotted	[25]
GRF4	Хромосома 2	Кодирует транскрипционный фактор, регулирующий рост, который положительно влияет на форму зерна и длину метелки и отрицательно влияет на осыпание семян	[9]
OsLG1	Хромосома 4	Контролирует развитие лигулы и ушков листа	[10]
OgSH11	Хромосома 11	Кодирует транскрипционный фактор MYB	[9]
Размер зерна
GW2	Хромосома 2	Белки RING-типа, функционируют как E3 убиквитин-лигазы	[33]
GS3	Хромосома 3	Регуляция формы зерна путем негативного влияния на рост	[34]
GS5	Хромосома 5	Положительный модулятор генов клеточного цикла	[31]
TGW6	Хромосома 6	Влияет на время перехода от синцитиальной к клеточной фазе	[32]
Окраска перикарпа
Rc	Хромосома 7	Кодирует транскрипционный фактор bHLH	[57]
Rd	Хромосома 1	Кодирует белок DFR - восстановление дигидрофлавонолов до образования лейкоантоцианидинов	[57]
Kala 1	Хромосома 1	Кодирует белок DFR - восстановление дигидрофлавонолов до образования лейкоантоцианидинов	[70]
Kala 3	Хромосома 3	Кодирует транскрипционный фактор  MYB	[70]
Kala 4	Хромосома 4	Кодирует транскрипционный фактор bHLH	[70]

 

Понимание генетического контроля признаков, ответственных за синдром доместикации может помочь облегчить работу при выведении новых высокоурожайных и устойчивых сортов путём доместикации de novo.

About the authors

Nikita A. Mirgorodskii

Sirius University of Science and Technology

Author for correspondence.
Email: i@nmirgorodskij.ru
ORCID iD: 0009-0005-6662-0741
SPIN-code: 1057-6260
Russian Federation, Russian Federation, Krasnodar Territory, federal territory "Sirius", Olympic ave., 1.

Sofya A. Slezova

Sirius University of Science and Technology

Email: slezovas@mail.ru
Russian Federation, Krasnodar Territory, federal territory "Sirius", Olympic ave., 1.

Nadezhda A. Dobarkina

Sirius University of Science and Technology

Email: n.dobarkina@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-4283-519X
Russian Federation, Krasnodar Territory, federal territory "Sirius", Olympic ave., 1.

Tatiana V. Matveeva

Saint Petersburg State University; All-Russian Research Institute of Plant Protection

Email: radishlet@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8569-6665
SPIN-code: 3877-6598
Scopus Author ID: 7006494611

Dr. Sci. (Biology), Professor, department of genetics and biotechnology

Russian Federation, 7–9 Universitetskaya emb., Saint Petersburg, 199034; Saint Petersburg

Elena A. Andreeva

Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg, RF

Email: a.andreeva@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9326-3170
SPIN-code: 7269-8240

Кандидат биологических наук

7–9 Universitetskaya emb., Saint Petersburg, 199034; Saint Petersburg

References

Supplementary files