Email this article The СYP24A gene expression the placental tissue during pregnancy
- Authors: Shelepova E.S1, Freylikhman O.A1, Riabokon N.R1, Zhebrun D.A1, Kostareva A.A1, Zazerskaya I.E1
-
Affiliations:
- Almazov Federal Centre
- Issue: Vol 65, No 6 (2016)
- Pages: 61-67
- Section: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/5881
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD65661-67
- ID: 5881
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. To study the nature of CYP24A1 gene expression in the placental tissue in women with different saturation of the body with vitamin D during normal pregnancy and preeclampsia.
Materials and methods. Cohort retrospective and prospective study. There were examined 110 pregnant women in Saint Petersburg and Leningrad region, who took multivitamin complex containing 400 IU of vitamin D from 12 weeks of pregnancy. Time of inclusion is from September to June. All pregnant women were taken blood samples with the following determination of the level of 25-hydroxycalciferol, fragments of placental tissue with the following study of mRNA expression of CYP24A1 gene.
Results. There were analyzed two groups of pregnant women. During the analysis of the saturation level of the body with vitamin D there were revealed the following things: the frequency of vitamin D deficiency in the main group was 69.6% in the group of comparison vitamin D deficiency was not found. The frequency of vitamin D insufficiency in the main group was 21.5% in the group of comparison – 18.5%. The frequency of the normal level of vitamin D in the main group was 8.9% in the group of comparison – 81.5%. Differences between the main group and the group of comparison are reliable (p < 0,0001). There revealed a statistically significant increase of the relative expression of mRNA of CYP24A1 gene in the placental tissue in women with preeclampsia (31,8 ± 20,6), in comparison with women with physiological pregnancy (11,2 ± 17,9) (p = 0.03)
Conclusion. In women with preeclampsia low level of vitamin D in blood serum (less than 30 ng/ml) is 5 times more common, that is why insufficiency and deficiency of vitamin D in pregnant women can be attributed to risk factors for the development of preeclampsia. Expression of mRNA of CYP24A1 gene in placental tissue in patients with preeclampsia is three times higher in comparison with patients with a normal pregnancy. Thus, the increased expression of CYP24A1 gene in the placental tissue can be considered as one of the risk factors for the development of preeclampsia.
Keywords
Full Text
Введение
Актуальность изучения проблем развития преэклампсии при беременности объясняется высоким уровнем материнской и младенческой заболеваемости и смертности. В структуре материнской смертности преэклампсия стабильно занимает третье место, составляя от 11,8 до 14,8 %, и остается основной причиной заболеваемости и смертности новорожденных [1]. В России преэклампсия встречается с частотой 13–16 % от общего числа родов [2, 3].
Несмотря на то что механизмы действия витамина D во время беременности до конца не изучены, витамин D играет важную роль в имплантации, плацентации и поддержании здоровой беременности. Возможно, локальная активация витамина D влияет на имплантацию — частично через иммуномодулирующие эффекты кальцитриола, а отчасти путем регуляции генов-мишеней, связанных с имплантацией. В плаценте присутствует витамин D и его рецепторы [4], таким образом, дефицит витамина D может быть включен в патофизиологические процессы преэклампсии.
Установлено, что во многих странах мира имеется высокая распространенность дефицита витамина D среди беременных и кормящих матерей. Дефицит витамина D увеличивает частоту преэклампсии, гипертонической болезни во время беременности, преждевременных родов, кесарева сечения, снижения веса при рождении, развития бактериального вагиноза на ранних сроках беременности и гестационного сахарного диабета [5–9].
Таким образом, исследования, посвященные роли витамина D в патогенезе преэклампсии, чрезвычайно важны с практической точки зрения. На современном этапе проблема требует дальнейшего изучения. Значимым является изучение течения беременности у женщин с недостаточностью витамина D, развития осложнений у беременной, роженицы, родильницы, плода и новорожденного, что позволит проводить профилактику осложнений.
Цель исследования — изучить характер экспрессии гена CYP24A1 в плацентарной ткани у женщин с различной насыщенностью организма витамином D при физиологической беременности и преэклампсии.
Материалы и методы
Когортное ретроспективное и проспективное исследование выполнено в родильном отделении Института перинатологии и педиатрии в Институте молекулярной биологии и генетики ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
В исследование включено 110 беременных. Всем беременным произведен забор биообразцов крови с последующим определением уровня 25-гидроксикальциферола и фрагментов ткани плаценты объемом 1 см3 с последующим анализом уровня относительной экспрессии информационной РНК (иРНК) гена CYP24A1.
Пациентки проживают в Санкт-Петербурге и Ленинградской области, возраст от 20 до 40 лет, срок беременности 30–38 недель, с 12-й недели беременности принимают поливитаминный комплекс, содержащий 400 МЕ витамина D, все беременные подписали информированное согласие.
Обследованные женщины составили две группы: основную группу (1-ю) (n = 56) составили беременные с умеренной и тяжелой преэклампсией. Группу сравнения (2-ю) (n = 54) составили беременные женщины с физиологически протекающей беременностью.
В качестве критерия достаточного обеспечения витамина D принято считать уровень 25(ОН)D в сыворотке крови более 30 нг/мл. Значения от 21 до 29 нг/мл расценивают как недостаточность витамина D, а значения менее 20 нг/мл считают его дефицитом [10, 11].
Для определения 25-гидроксикальциферола 25(OH)D в сыворотке крови использован метод иммуноферментного анализа с использованием наборов и калибраторов фирмы Roche Diagnostics (Германия) для анализатора Cobas E411 Roche (Швейцария) на базе ЦКДЛ ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А Алмазова» Минздрава России.
Изучение экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) c использованием флюоресцирующих зондов (TaqMan), входящих в состав коммерческого набора для определения экспрессии гена CYP24A1 Hs 00989020_m1 (ABI, USA).
Анализ результатов ПЦР-РВ проводился на основании полученных значений пороговых циклов флюоресценции, которые позволили определить показатель относительного количества копий гена CYP24A1 (разницу экспрессии) с использованием предварительно рассчитанных значений ΔCt и 2ΔΔCT в образцах основной группы по сравнению с группой сравнения. В качестве референс-гена использовался ген B2M, кодирующий белок бета-2-микроглобулин, исследования проводились на базе Института молекулярной биологии и генетики ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
Данные обрабатывались с помощью программного пакета STATISTICA 10 En (StatSoft, Inc.).
Результаты
В группах проанализирована степень насыщения организма витамином D. При анализе установлено следующее: частота дефицита витамина D в основной группе составила 69,6 % (39 беременных), в группе сравнения дефицит витамина D не выявлен. Частота недостаточности витамина D в основной группе составила 21,5 % (12 беременных), в группе сравнения — 18,5 % (10 беременных). Частота нормального уровня витамина D в основной группе составила 8,9 % (5 беременных), в группе сравнения — 81,5 % (44 беременные). Различия между основной группой и группой сравнения достоверны (p < 0,0001) (табл. 1).
Таблица 1.Частота насыщения организма витамином D в исследованных группах
Table 1.Frequency of body saturation with vitamin D in the examined groups
Уровень 25-гидроксикальциферола | Основная группа (n = 56) | Группа сравнения (n = 54) | Достоверность различий (p) |
Дефицит (< 20 нг/мл) | 69,6 % (n = 39) | 0 % (n = 0) | – |
Недостаточность (21–30 нг/мл) | 21,5 % (n = 12) | 18,5 % (n = 10) | < 0,0001 |
Норма (≥ 30 нг/мл) | 8,9 % (n = 5) | 81,5 % (n = 44) | < 0,0001 |
Данные об уровне насыщения организма витамином D беременных исследованных групп приведены в табл. 2. Средний уровень 25-гидроксикальциферола 25(OH)D в сыворотке крови у женщин с неосложненной преэклампсией беременностью соответствует норме — 42,56 [56, 3; 25, 50] нг/мл, и достоверно выше, чем у женщин с преэклампсией, — 17,34 [36, 60; 4, 70] нг/мл, что соответствует значению дефицита (p < 0,0001).
Таблица 2. Средние значения 25-гидроксикальциферола в сыворотке крови у беременных исследованных групп
Table 2. Mean levels of blood serum 25-hydroxycalciferol in pregnant women of the examined groups
Уровень 25-гидроксикальциферола в сыворотке крови, нг/мл | Основная группа (n = 56) M ± m | Группа сравнения (n = 54) M ± m | Достоверность различий (p) |
Дефицит | 13,10 ± 4,31 (n = 39) | 0 (n = 0) | – |
Недостаточность | 23,76 ± 2,77 (n = 12) | 28,50 ± 1,64 (n = 10) | < 0,0001 |
Норма | 35,10 ± 1,31 (n = 5) | 45,76 ± 13,30 (n = 44) | < 0,0001 |
У беременных основной группы наблюдались различия в значениях 25(OH)D, коррелирующие с насыщением организма витамином D. У беременных основной группы с достаточным насыщением организма витамином D средние значения 25(OH)D в сыворотке крови были достоверно ниже — 35,10 ± 1,31 нг/мл, чем в группе сравнения, — 45,76 ± 13,30 нг/мл (р < 0,0001); у беременных с недостаточным насыщением организма витамином D основной группы средние значения 25(OH)D составили 23,76 ± 2,77 нг/мл, у беременных с дефицитом витамина D основной группы — 13,10 ± 4,31нг/мл, тогда как в группе сравнения значения 25(OH)D были 28,50 ± 1,64 нг/мл (р < 0,0001).
Результаты анализа экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани основной группы по сравнению с группой сравнения представлены в табл. 3.
Таблица 3. Уровень экспрессии иРНК гена CYP24A1 в исследованных группах
Table 3. Level of mRNA expression of CYP24A1 gene in the examined groups
Группа | Величина относительной экспрессии иРНК гена CYP24A1 |
Основная группа (n = 56) | 31,8 ± 20,6 |
Группа сравнения (n = 54) | 11,2 ± 17,9 |
Достоверность различий р = 0,03 | |
Выявлено статистически достоверное увеличение относительной экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани у женщин с преэклампсией по сравнению с женщинами с физиологически протекающей беременностью (р = 0,03) (рис. 1). Экспрессия иРНК гена CYP24A1 в основной группе в 3 раза превышала таковую в группе сравнения.
Также наблюдались достоверные различия экспрессии иРНК гена CYP24A1 у беременных основной группы и группы сравнения в подгруппах, характеризующихся различным уровнем насыщения организма витамином D (табл. 4). Так, уровень экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани у беременных основной группы в подгруппе с нормальным уровнем насыщения организма витамином D составил 10,71 ± 13,4, с недостаточным насыщением — 23,88 ± 31,2, с дефицитом витамина D — 38,02 ± 15,17, а в группе сравнения уровень экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани у беременных в подгруппе с нормальным уровнем насыщения организма витамином D составил 8,25 ± 15,6, с недостаточным уровнем насыщения организма витамином D — 19,93 ± 22,16.
Таблица 4. Уровень экспрессии иРНК гена CYP24A1 в зависимости от насыщенности организма витамином D в исследованных группах
Table 4. Frequency of body saturation with vitamin D in the examined groups
Показатель | Подгруппа по уровню 25-гидроксикальциферола в сыворотке крови | Основная группа (n = 56) | Группа сравнения (n = 54) | Достоверность различий (p) |
Величина относительной экспрессии иРНК гена CYP24A1 | Норма | 10,71 ± 13,4 (n = 5) | 8,25 ± 15,6 (n = 44) | < 0,05 |
Недостаточность | 23,88 ± 31,2 (n = 12) | 19,93 ± 22,16 (n = 10) | < 0,05 | |
Дефицит | 38,02 ± 15,17 (n = 39) | 0 ± 0 (n = 0) | – |
Обсуждение
Несмотря на значимость данной патологии, комплексная структурированная картина патогенеза отсутствует, а патогенетические механизмы преэклампсии далеки от понимания, в том числе из-за многофакторности и сложности отдельных компонентов, которые зависят как от устраняемых, так и от генетических факторов.
Изучение роли дефицита и недостаточности витамина D имеет значение для предотвращения связанных с ним осложнений беременности. Данные литературы свидетельствуют о том, что дефицит витамина D увеличивает частоту преэклампсии, гипертонической болезни во время беременности, преждевременных родов, кесарева сечения, снижения веса при рождении, развития бактериального вагиноза на ранних сроках беременности, гестационного сахарного диабета [5–9].
В исследовании Parlak (2015) доказано, что уровень витамина D, оцененный на ранних сроках беременности, был ниже у женщин, у которых впоследствии развилась преэклампсия. При уровне витамина D в сыворотке крови менее 20 нг/мл риск развития преэклампсии в два раза выше [5]. Исследование, проведенное M. Haugen et al. среди 23 423 первородящих женщин в Норвегии, показало снижение риска развития преэклампсии на 27 % у женщин, которые получали 400–600 МЕ витамина D в день по сравнению с женщинами, не получавшими добавок [6].
Наши данные подтверждают взаимосвязь между дефицитом витамина D и развитием преэклампсии. Обращает на себя внимание прямая зависимость средних значений 25(OH)D в сыворотке крови от насыщения организма витамином D. Так, у беременных с достаточным насыщением организма витамином D основной группы средние значения 25(OH) D в сыворотке крови были достоверно ниже (35,10 ± 1,31 нг/мл), чем в группе сравнения (45,76 ± 13,30 нг/мл) (р < 0,0001), у беременных с недостаточным насыщением организма витамином D основной группы средние значения 25(OH)D составили 23,76 ± 2,77 нг/мл, у беременных с дефицитом витамина D основной группы — 13,10 ± 4,31 нг/мл, а в группе сравнения — 28,50 ± 1,64 нг/мл (р < 0,0001).
Клеточные эффекты витамина D и его метаболитов осуществляются главным образом через внутриядерные рецепторы витамина D — VDR, при посредничестве лигандактивированного фактора транскрипции, который принадлежит к ядерным гормон-рецепторам. Регуляция экспрессии VDR является одним из основных механизмов, посредством которых клетки-мишени реагируют на кальцитриол и меняют свой режим функционирования [11, 12].
Вместе с тем сигналинг с помощью VDR также связан с экспрессией гена CYP19 (ароматазы), функционально объединяющего витамин D с семьей репродуктивных стероидных гормонов [12, 13]. Важную роль в биологическом действии витамина D играют также ферменты CYP27B1 и CYP24A1, осуществляющие регуляцию синтеза и катаболизма витамина в печени и почках.
Остается дискуссионным вопрос о значении дифференциальной экспрессии гена CYP24A1 в развитии преэклампсии. Метаболизм витамина D увеличивается в периоды беременности и лактации. После формирования плаценты метаболит витамина D 25(OH)D передается через нее [14]. Большое количество генов регулируется с помощью кальцитриола [11, 15]. VDR отвечают на воздействие кальцитриола увеличением генной экспрессии 25(OH)D — 24-гидроксилазы (CYP24А1), чтобы метаболизировать 25(OH)D и 1,25(OH)2D в биологически инертные водорастворимые неактивные формы (в том числе кальцитроевую кислоту, она растворяется в воде и выводится из организма в составе желчи и мочи) [16–18]. Кальцитриол по механизму отрицательной обратной связи подавляет свой собственный синтез и стимулирует собственное разрушение за счет индукции почечного фермента 25-гидроксивитамин D-24-гидроксилазы (CYP24A1).
Ген CYP24A1 кодирует фермент 24-гидроксилазу, который конвертирует активный витамин D1,25(ОН)2D в неактивный метаболит 1,24,25(ОН)3D. При повышении экспрессии гена CYP24А1 происходит увеличение синтеза фермента. Участие большего количества фермента 24-гидроксилазы способствует синтезу большего количества неактивного метаболита витамина D [16–18].
Существуют данные о том, что увеличение экспрессии гена CYP24А1 может служить фактором риска развития преэклампсии [16–18]. Экспериментальные исследования содержат данные о прерванном метаболическом гомеостазе витамина D в плаценте в период преэклампсии и показывают, что в нормальной плаценте экспрессия связывающего витамин D белка (белка CYP24А1) и рецепторов витамина D (VDR) локализована в основном в трофобластах, в то время как экспрессия белков CYP2R1 и CYP27B1 — в ворсистой основе сосудов эпителия плода [19]. Экспрессия белка CYP2R1 и рецепторов витамина D (VDR) была снижена, но экспрессия CYP27B1 и CYP24А1 увеличивалась в период преэклампсии по сравнению с плацентой при нормальном давлении [19].
В работе D. Fischer (2011) показано увеличение экспрессии гена CYP24А1 в плацентарной ткани у пациенток с преэклампсией по сравнению с пациентками, имеющими физиологически протекающую беременность, тогда как 25(OH)D в сыворотке крови был значительно снижен [16].
Нами было выявлено статистически достоверное увеличение относительной экспрессии и РНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани у женщин с преэклампсией по сравнению с женщинами с физиологически протекающей беременностью (р = 0,03) (см. рис. 1). Экспрессия иРНК гена CYP24A1 в основной группе в 3 раза превышала таковую в группе сравнения.
Рис. 1. Различия экспрессии иРНК гена CYP24A1 в исследованных группах
Fig. 1. Differences of mRNA expression of CYP24A1 gene in the examined groups
Выводы
Данное исследование показало, что у женщин с преэклампсией в 5 раз чаще встречается низкий уровень витамина D в сыворотке крови (менее 30 нг/мл), поэтому низкий уровень витамина D у беременных женщин (недостаточность и дефицит) можно отнести к факторам риска развития преэклампсии.
Также в ходе исследования выявлено повышение в три раза экспрессии иРНК гена CYP24A1 в плацентарной ткани у пациенток с преэклампсией по сравнению с пациентками с физиологически протекающей беременностью. Таким образом, ген CYP24A1 может служить одним из маркерных генов преэклампсии, несмотря на большое количество факторов, влияющих на его экспрессию. Повышение экспрессии гена CYP24A1 в плацентарной ткани может быть рассмотрено как один из факторов риска развития преэклампсии.
Информация о конфликте интересов
Статья прочитана и одобрена всеми авторами; все авторы уверены, что рукопись отражает действительно проделанную работу. Данная рукопись, а также никакая часть данной работы ранее нигде не публиковалась. Конфликт интересов авторов отсутствует.
Информация о финансировании
Источник финансирования — ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
About the authors
Ekaterina S Shelepova
Almazov Federal Centre
Author for correspondence.
Email: shelepowa@gmail.com
research worker of Department of Reproduction and Women Health, Institute of perinatology and pediatrics Russian Federation
Olga A Freylikhman
Almazov Federal Centre
Email: olga1-7@mail.ru
candidate of biological sciences, researcher of SRL of molecular cardilogy, Institute of molecular biology and genetics Russian Federation
Nikita R Riabokon
Almazov Federal Centre
Email: n-i-k-o-n@mail.ru
assistant of the department of Obstetrics and Gynecology Russian Federation
Daria A Zhebrun
Almazov Federal Centre
Email: shunya@inbox.ru
candidate of biological sciences, junior researcher of SRL of molecular cardilogy, Institute of molecular biology and genetics Russian Federation
Anna A Kostareva
Almazov Federal Centre
Email: akostareva@hotmail.com
candidate of medical sciences, chief of the Institute of molecular biology and genetics Russian Federation
Irina E Zazerskaya
Almazov Federal Centre
Email: zazera@mail.ru
head of department of Obstetrics and Gynecology, Institute of perinatology and pediatrics Russian Federation
References
- Kintiraki E, Papakatsika S, Kotronis G, et al. Pregnancy-Induced hypertension. Hormones (Athens). 2015;14(2):211-223. doi: 10.14310/horm.2002.1582.
- Сидорова И.С., Никитина Н.А. Современный взгляд на проблему преэклампсии: аргументы и факты // Акушерство и гинекология. – 2013. – № 5. – С. 10–16. [Sidorova IS, Nikitina NA. Modern view on the problem of preeclampsia: arguments and facts. Akusherstvo i ginekologija. 2013;(5):10-6. (In Russ.)]
- WHO recommendations for prevention and treatment of pre-eclampsia and eclampsia // World Health Organization, Geneva 27, Switzerland. 2011.
- Bodnar LM, Catov JM, Simhan HN. Maternal vitamin D deficiency increases the risk of preeclampsia. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92(9):3517-3522. doi: 10.1210/jc.2007-0718.
- Parlak M, Kalay S, Kalay Z, et al. Severe vitamin D deficiency among pregnant women and their newborns in Turkey. J Matern Fetal Neonatal Med. 2015;28(5):548-551. doi: 10.3109/14767058.2014.924103.
- Haugen M, Brantsaeter AL, Trogstad L, et al. Vitamin D supplementation and reduced risk of preeclampsia in nulliparous women. Epidemiology. 2009;20(5):720-726. doi: 10.1097/EDE.0b013e3181a70f08.
- Hensel KJ, Randis TM, Gelber SE, et al. Pregnancy-specific association of vitamin D deficiency and bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol. 2011;204(1):41. doi: 10.1016/j.ajog.2010.08.013.
- Zhang C, Qiu C, Hu FB, et al. Maternal plasma 25-hydroxyvitamin D concentrations and the risk for gestational diabetes mellitus. PLoS One. 2008;3(11):e3753. doi: 10.1371/journal.pone.0003753.
- Shand AW, Nassar N, Von Dadelszen P, et al. Maternal vitamin D status in pregnancy and adverse pregnancy outcomes in a group at high risk for pre-eclampsia. BJOG. 2010;117(13):1593-1598. doi: 10.1111/j.1471-0528.2010.02742.x.
- Gómez de Tejada Romero MJ, Sosa Henríquez M, Del Pino Montes J, et al. Position document on the requirements and optimum levels of vitamin D. Rev Osteoporos Metab Miner. 2011;1:53-64.
- Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med. 2007;357(3):266-281. doi: 10.1056/NEJMra070553.
- Christakos S, Barletta F, Huening M, et al. Vitamin D target proteins: function and regulation. J Cell Biochem. 2003;88(2):238-44. doi: 10.1002/jcb.10349.
- Kinuta K, Tanaka H, Moriwake T, et al. Vitamin D is an important factor in estrogen biosynthesis of both female and male gonads. Endocrinology. 2000;141(4):1317-1324. doi: 10.1210/endo.141.4.7403.
- Hossein-nezhad A, Holick MF. Optimize dietary intake of vitamin D: an epigenetic perspective. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2012;15(6):567-579. doi: 10.1097/MCO.0b013e3283594978.
- Hossein-nezhad A, Spira A, Holick MF. Influence of vitamin D status and vitamin D3 supplementation on genome wide expression of white blood cells: a randomized double-blind clinical trial. PLoSOne. 2013;8(3): e58725. doi: 10.1371/journal.pone.0058725.
- Fischer D, Schroer A, Lüdders D, et al. Metabolism of vitamin D3 in the placental tissue of normal and preeclampsia complicated pregnancies and premature births. Clin Exp Obstet Gynecol. 2007;34(2):80-84.
- Konno Y, Kodama S, Moore R, et al. Nuclear xenobiotic receptor pregnane X receptor locks corepressor silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors (SMRT) onto the CYP24A1 promoter to attenuate Vitamin D3 aсtivation. Mol Pharmacol. 2009;75(2):265-271. doi: doi.org/10.1124/mol.108.051904.
- Lechtermann C, Hauffa BP, Herrmann R, et al. Maternal vitamin D status in preeclampsia: seasonal changes are not influenced by placental gene expression of vitamin D metabolizing enzymes. PLoS One. 2014Aug22;9(8):e105558. doi: 10.1371/journal.pone.0105558.
- Ma R, Gu Y, Zhao S, et al. Expressions of vitamin D metabolic components VDBP, CYP2R1, CYP27B1, CYP24A1, and VDR in placentas from normal and preeclamptic pregnancies. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012;303(7):E928-935. doi: 10.1152/ajpendo.00279.2012.
Supplementary files
