Hemostasis system and immunomorphologic state of placenta under presence of antiphospholipid antibodies in plasma with consideration of their class and pregnancy outcome

Full Text

В последнее время все большее внимание ученых привлекает антифосфолипидный синдром (АФС), который в значительной степени увеличивает как материнскую, так и перинатальную смертность [2—4]. Однако исследованию гемостаза при циркуляции антифосфолипидных антител (АФА) у беременных женщин уделяется недостаточное внимание. Вместе с тем изучение тромбоцитарного звена гемостаза при беременности представляет особый интерес, так как тромбоциты осуществляют регуляцию кровотока в микроциркуляторном русле [1, 5].

Для прогнозирования осложнений беременности и ее возможных исходов должно быть четкое представление о функционировании системы гемостаза при наличии АФА разных классов в сопоставлении с морфологическими изменениями в плаценте.

Целью работы явилось изучение системы гемостаза и иммуноморфологического состояния плаценты при наличии в плазме крови АФА с учетом их класса и исхода беременности.

Материалы и методы исследования: были обследованы 197 женщин с привычным невынашиванием беременности. Иммуноморфологическое исследование биоптатов плаценты проведено у 20 здоровых беременных женщин и у 41 женщины с учетом класса АФА (аКЛ/BA). У 52 женщин изучалось наличие аутоантител к β₂-ГП-1. Возраст обследуемых женщин находился в пределах от 20 до 42 лет.

Анализ соматической патологии показал, что у женщин с наличием АФА детские инфекции встречались в 3 раза чаще и в 10 раз чаще наблюдались аллергические реакции по сравнению с женщинами без аутоантител. У женщин с наличием волчаночного антикоагулянта (ВА) в 1,5 раза чаще, чем при антикардиолипиновых антителах (аКЛ) диагностировалась тиреоидная патология, в 3 раза чаще ожирение и ВСД по гипертоническому типу. Варикозная болезнь при циркуляции ВА встречалась в 7 раз чаще по сравнению с аналогичным показателем при аКЛ (18,5±7,5 и 2,4±2,3 % соответственно).

У ²/з женщин с АФА выявлена высокая частота хронических воспалительных заболеваний половых органов. При циркуляции ВА они встречались в 74,1 ±8,4% случаев, что в 1,3 раза чаще, чем при наличии аКЛ (59,5±7,6%).

Процент самопроизвольных абортов в анамнезе у женщин с АФА достоверно превышал в 1,6 раза аналогичный показатель у женщин без АФА и составил 23,6±3,3%. При этом частота спонтанных абортов при аКЛ была 28,9±4,9%, при ВА — 18,3±4,9%. Отмечен также значительный процент неразвивающейся беременности, составляющий 40,0±6,3% при наличии ВА, что в 2 раза чаще по сравнению с аналогичным показателем при аКЛ (20,5±4,4%).

Выявление аКЛ осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием Anti-Phospholipid Screen with human В2-Glycoprotein I as cofactor (OR GenTec Diagnostica GmbH — Германия).

Биохимическая активность BA определялась по фосфолипидзависимым тестам коагуляции (АПТВ 1:20 и ПВ 1:500).

Для иммуноморфологического и гистологического исследования последов брали образцы тканей центральной и периферической частей плаценты. Криостатные срезы плаценты обрабатывались специфическими иммунными сыворотками с использованием методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Параллельно проводили гистологическое исследование плаценты по общепринятой методике.

 β₂-ГП-1 определяли методом флюоресцирующих антител в непрямой модификации с использованием сывороток крови обследуемых женщин, тестированных на наличие антител к кардиолипину на бычьем сердце.

Комплексное изучение свертывающей системы крови включало: исследование сосудистотромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза. Кроме того, исследовалась активность фактора VIII и общая фибринолитическая активность плазмы, а также ингибиторов фибринолиза.

Статистическая обработка данных проводилась по программе Excel 5,0.

Результаты исследования

Для оценки степени риска тромботических осложнений при беременности было проведено комплексное исследование системы гемостаза у небеременных женщин. Выявлено достоверное увеличение в крови числа активных форм тромбоцитов от 16,9±0,4 (р< 0,001) при аКЛ до 19,6±0,4% (р<0,001) при ВА. Факт инициации тромбоцитарного звена подтверждался достоверным увеличением числа тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты до 7,9±0,1 (р<0,01) при аКЛ и до 8,4±0,2 % (р< 0,01) при ВА. Изучение плазменно-коагуляционного звена у этих женщин выявило отсутствие достоверных изменений показателей общих скрининговых тестов при аКЛ. Циркуляция ВА сопровождалась достоверным удлинением времени свертывания крови до 9,6±0,6 мин (р< 0,05) и индекса АПТВ до 1,05±0,03 % (р< 0,01). Одновременно отмечалось и укорочение ПТИ до 91,5±0,5 % (р< 0,05). При этом концентрация фибриногена в плазме достоверно превышала нормальные показатели в 1,2 раза.

Исследование фибринолитической активности крови выявило достоверное угнетение фибринолиза у всех женщин с АФА.

Изучение сосудисто-тромбоцитарного звена во время гестации обнаружило у всех женщин с АФА и неблагоприятным исходом беременности уже в 1 триместре значительное повышение адгезивно-агрегационных свойств тромбоцитов в 2 и более раз при аКЛ и почти в 3 раза при ВА на фоне достоверного снижения их числа в венозной крови (табл.1, 2).

 

Таблица 1. Показатели гемостаза в I триместре при различных исходах беременности у женщин с аКЛ

Показатели	Здоровые беременные	Неразвивающаяся беременность	Самопроизвольный аборт	Преждевременные роды	Срочные роды
Тr в венозной крови, 109/л	244,0±13,2	198,3±4,5**	197,5±12,6**	203,2±9,1*	220,0±7,1
Сумма активных форм тромбоцитов, %	12,8±0,5	28,6±2,5***	27,1 ±1,4**	23,3±1,О***	17,2±0,8***
Число тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты, %	6,8±0,4	11,04±1,1**	11,2±0,5***	10,3±0,1***	8,1±0,4**
Агрегация тромбоцитов с ристомицином, %	94,1±2,6	137,3±5,9***	134,7±1,9***	126,4±6,0***	119,5±1,7
Время свертывания крови, мин	7,4±0,4	6,93±0,07	6,97±0,5	7,0±0,1	6,9±0,1
ПТИ, %	102,5±1,6	106,7±0,9*	105,3±0,04	104,3±1,3	102,6±0,6
АПТВ-индекс, %	1,0±0,01	0,95±0,02*	0,93±0,04	0,96±0,03	0,97±0,05
Фибриноген, г/л	3,4±0,1	3,8±0,2*	3,6±О,3	3,9±0,2*	3,5±0,1
Фибринолитическая активность, %	7,0±0,5	5,1±0,5**	5,9±0,1	5,8±0,3*	5,9±0,4
* — р<0,05, ** - р< 0,01, *** -р<0,001 между контрольной и каждой из сравниваемых групп.

 

Исследование индуцированной агрегационной активности кровяных пластинок подтвердило гиперактивацию тромбоцитарного компонента гемостаза у всех женщин с наличием АФА. При этом степень агрегационной активности была максимальной при циркуляции ВА и неразвивающейся беременности. Значимое увеличение ристомицин-агрегации еще раз подтверждает наличие выраженных нарушений в микроциркуляторном русле при наличии в кровотоке АФА, с большей степенью нарушений при циркуляции ВА (табл. 2).

 

Таблица 2. Показатели системы гемостаза в I триместре различных исходов беременности при наличии ВА

Показатели	Здоровые беременные	Неразвивающаяся беременность	Самопроизвольный аборт	Преждевременные роды	Срочные роды
Тr в венозной крови, 109/л	244,0±13,2	186,7±6,8**	185,0±8,9**	181,0±12,3***	193,8±10,8**
Сумма активных форм тромбоцитов, %	12,8±0,5	36,1±0,2***	29,8±2,5***	24,7±0,5***	18,1±О,5**
Число тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты, %	6,8±0,4	14,7±0,3***	12,1±0,7***	1О,8±О,3***	8,7±0,1***
Агрегация тромбоцитов с ристомицином, %	94,1±2,6	155,3±5,8***	143,3±8,2***	121,2±0,7***	125,2±3,4***
Время свертывания крови, мин	7,4±0,4	9,3±О,3**	9,1±0,6*	8,8±0,5*	8,9±0,2**
ПТИ, %	102,5±1,6	96,5±0,6*	98,7±0,9	100,5±1,3	101,8±0,8
АПТВ-индекс, %	1,0±0,01	1,15±0,07*	1,2±0,01***	1,1±0,01***	1,14±0,01*
Фибриноген, г/л	3,4±0,1	4,1±0,3*	3,9±0,2*	3,8±0,Г*	3,6±0,1
Фибринолитическая активность, %	7,0±0,5	4,4±0,7**	4,6±0,5**	5,6±0,4*	6,2±0,2
* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р< 0,001 между контрольной и каждой из сравниваемых групп.

 

Повышение гемостатической активности тромбоцитов приводит к запуску коагуляционного каскада и, как следствие, развитию гиперкоагуляционного синдрома.

Циркуляция аКЛ при неразвивающейся беременности сопровождалась достоверным увеличением — ПТИ и укорочением индекса АПТВ, что свидетельствует о повышении активности прокоагулянтного звена системы гемостаза. О склонности к гиперкоагуляции в этой группе беременных свидетельствовало и достоверное нарастание фибриногена в плазме (р<0,05), которое имело место и при преждевременных родах (табл. 1).

При анализе коагулометрических показателей у беременных с наличием ВА отмечалось достоверное удлинение времени свертывания венозной крови в среднем на 24,0% и индекса АПТВ в среднем на 20% во всех исследуемых группах. Достоверным было увеличение концентрации фибриногена, достигая 4,5±0,1 г/л при неразвивающейся беременности.

Исследование общей фибринолитической активности крови установило статистически значимое угнетение фибринолиза во всех исследованных группах. При исходе беременности в срочные роды и наличии АФА независимо от их класса достоверных отличий от здоровых беременных не было.

Сравнительная оценка состояния сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза в I и последующих триместрах беременности показала, что выявленные нарушения во всех звеньях системы гемостаза в I триместре беременности прогрессировали с ростом гестации, усиливая тем самым тромботическую тенденцию. При этом более выраженные нарушения были отмечены при циркуляции ВА и исходе беременности в преждевременные роды.

Иммуноморфологическое исследование плаценты показало, что при наличии в плазме крови АФА фиксированные иммунные комплексы, включающие СЗ-фракцию комплемента, указывающего на патогенность иммунного комплекса (ПИК), выявлялись в большом проценте наблюдений как в центральной, так и в периферической областях плаценты, особенно при исходе беременности в преждевременные роды и достигало 100% при самопроизвольном аборте и неразвивающейся беременности (табл. 3). и IgA при срочных и преждевременных родах существенно не различался.

При циркуляции ВА максимальные цифры IgM в плаценте имели место при преждевременных родах в центральной ее части (80%), а IgA — в периферической части плаценты (40%).

Среди классов иммуноглобулинов при наличии аКЛ и исходе беременности в срочные роды IgM выявлялся в наименьшем числе наблюдений (14,3%) в периферической части плаценты. Частота обнаружения IgM при преждевременных родах составила 37,5% в обеих частях плаценты. Процент обнаружения IgG

IgG при преждевременных родах обнаруживался в большей половине случаев как в центральной, так и в периферической части плаценты (77,8 и 66,7% соответственно). При исходе беременности в срочные роды процент выявления данного компонента иммунного комплекса в обеих частях плаценты составил 60%.

 

Таблица 3. Состав ПИК при разных классах антифосфолипидных антител с учетом исхода беременности

Класс аутоантител		Содержание ПИК
		Фибриноген	СЗ-фракция	IgA	IgM	IgG
норма		6,06±4,15	13,04±7,02	5,0±4,87	15,0±7,98	75,0±9,68
Срочные роды
АКЛ	Ц	64,3±12,8	57,1±13,2	42,9±13,2	28,6±12,1	35,7±12,8
	П	64,3±12,8	50,0± 13,4	35,7±12,8	14,3±9,4	42,9±13,2
ВА	Ц	88,9±10,5	77,8±13,9	22,2±13,9	55,6±16,6	60,0±21,9
	П	88,9±10,5	77,8±13,9	22,2±13,9	33,3±15,7	60,0±21,9
Преждевременные роды
АКЛ	Ц	87,5±11,7	100	37,5±17,1	37,5±17,1	50,0±17,7
	П	87,5±11,7	87,5±11,7	37,5±17,1	37,5±17,1	37,5±17,1
ВА	Ц	80,0±17,9	80,0± 17,9	20,0± 17,9	80,0±17,9	77,8±13,9
	П	100	80,0±17,9	40,0±21,9	60,0±21,9	66,7±15,7
Самопроизвольный аборт + неразвиваюшаяся беременность
АКЛ	Ц	100	100	80,0±17,9	60,0±21,9	100
	П	100	100	60,0±21,9	80,0±17,9	100
Ц — центральная часть плаценты; П — периферическая часть плаценты.

 

При исходе беременности в самопроизвольный аборт и неразвивающуюся беременность процент выявления иммунологических депозитов был максимальным во всех областях плаценты по сравнению со срочными и преждевременными родами.

Процент обнаружения фибриногена в плаценте был наибольшим при самопроизвольном аборте и неразвивающейся беременности и наличии аКЛ (100%), минимальное его количество отмечалось в плацентах женщин с аКЛ и исходом беременности в срочные роды (64,3%).

Кроме того, в последах женщин с АФА при неблагоприятных исходах беременности наблюдалась наибольшая интенсивность специфического свечения в области отложения патогенных ИК, что указывало на большую степень повреждения тканей.

Специальное изучение наличия кофактора β₂-ГП-1 в плацентах 72 женщин обнаружило его в составе ИК в 78% случаев. Кроме того, выявлена прямая зависимость между интенсивностью специфического свечения аКЛ в плаценте и титром β₂^-ГП-1, связанного с аКЛ (β₂-ГП-1 с аКЛ) в плазме крови беременных.

Таким образом, проведенное комплексное исследование состояния системы гемостаза у небеременных женщин с наличием АФА позволило установить выраженные изменения в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза, особенно при ВА, характеризующиеся несвойственной сроку беременности гиперагрегацией кровяных пластинок, ведущей к блокаде микроциркуляторного русла. С наступлением беременности активность тромбоцитарного компонента гемостаза значительно усиливается, достигая максимальных значений при циркуляции ВА и исходе настоящей беременности в неразвивающуюся. Указанные изменения в тромбоцитарном звене при циркуляции АФА были статистически достоверны и объясняются активирующим действием АФА на кровяные пластинки [1—3]. Приведенные результаты подтверждают прямой проагрегантный эффект АФА. Повышение морфофункциональной активности тромбоцитов с ранних сроков беременности можно рассматривать как маркер возможных осложнений беременности и/или неблагоприятного ее исхода и требует их профилактики до беременности.

Анализ коагулометрических показателей у небеременных женщин обнаружил отсутствие влияния аКЛ на плазменно-коагуляционное звено гемостаза, в то время как циркуляция ВА сопровождалась признаками гиперкоагуляции. В результате полученных данных у небеременных женщин изменение показателей общих скрининговых тестов (ПТИ, индекс-АПТВ) у беременных при аКЛ следует рассматривать как следствие повышения гемостатической активности тромбоцитов. Гиперкоагуляция при ВА обусловлена не только прямым проагрегантным эффектом аутоантител, но и функциональным нарушением эндотелия сосудов.

Высокая частота обнаружения β₂-ГП-1 с аКЛ на мембранах трофобласта и эндотелия сосудов плаценты у женщин с неблагоприятными исходами беременности в местах локализации иммунных комплексов свидетельствует о роли этого белка в развитии патологических процессов в плацентарной ткани, способствующих развитию плацентарной недостаточности [6—8].

Длительная гиперактивация иммунной системы у женщин с АФА приводит к дисфункции составляющих ее компонентов, образованию ПИК с нарушением их клиренса и активации системы комплемента на ограниченном участке кровяного русла. Кроме того, активные иммунные комплексы способствуют активации тромбоцитарного звена гемостаза и секреции кровяными пластинками мощного вазоконстриктора тромбоксана. Начавшиеся патологические процессы, в свою очередь, потенциируют повреждения сосудистой стенки и снижение ее тромборезистентности.

About the authors

N. G. Kosheleva

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

L. В. Zubzhitskaia

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

О. N. Arzhanova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

О. V. Tyshkevich

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

Y. Gromyko

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

Т. N. Shlyakhtenko

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

Т. A. Pluzhnikova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

Е. А. Shapovalova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files