Cytokine production by peripheral blood lymphocytes in patients with ovarian epithelial tumors

Full Text

В последнее десятилетие от­мечается рост заболеваемости эпителиальных опухолей яичников (ЭОЯ), в связи с чем вопросы про­филактики, ранней диагностики и эффективности лечения данного заболевания являются весьма ак­туальными.

Одним из наиболее перспектив­ных направлений современной он­кологии является изучение роли иммунной системы в патогенезе опухолей и возможности приме­нения иммунологических методов для их диагностики и лечения. Иммунология канцерогенеза ак­тивно изучается на протяжении последних 20 лет. Получены дан­ные, подтверждающие роль иммун­ной системы в противоопухолевой защите организма, изучаются ме­ханизмы, ведущие к деструкции клеток новообразования, а также механизмы феномена иммунологи­ческой толерантности клеток опухоли. Особое значение в реа­лизации противоопухолевого им­мунитета в настоящее время уде­ляется цитокинам-биологичес­ки активным веществам, продуци­руемым иммунокомпетентными клетками и опосредующим все ре­акции иммунитета, в том числе противоопухолевого [2, 4].

Несмотря на активное изуче­ние роли отдельных цитокинов в реализации противоопухолевого иммунитета, а также возможно­сти применения их в диагностике и лечении опухолей разной лока­лизации, особенности цитокинового обмена у больных ЭОЯ изуче­ны недостаточно. Имеющиеся ли­тературные данные относитель­но обмена цитокинов у больных ЭОЯ немногочисленны и противо­речивы, что диктует необходи­мость дальнейшего изучения этой проблемы [3, 5, 7, 8, 9].

Цель исследования

Целью исследования стало изу­чение продукции лимфоцитами пе­риферической крови (ЛИК) боль­ных опухолями яичников отдель­ных цитокинов: интерлейкина-1 р (ИЛ 1/3) и фактора некроза опухоли а (ФИОа) как цитокинов, обладающих цитотоксической ак­тивностью в отношении клеток опухоли; интерлейкина-2 (ИЛ2) и интерлейкина-4 (ИЛ4) как цито­кинов, опосредующих клеточную реакцию Т-лимфоцитов по 1 или 2 типу; интерлейкина-6 (ИЛ6) как цитокина, замыкающего воспали­тельную реакцию и являющегося антагонистом ИЛ1/3 и ФНОа.

Методы исследования

Были изучены особенности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов ЛПК боль­ных ЭОЯ, находившихся на лече­нии в Ставропольском краевом онкологическом диспансере в пе­риод с 1998 по 1999 гг.

Всего было обследовано 80 больных опухолями яичников. Кон­трольную группу составили 30 здоровых женщин.

После клинического обследова­ния, проведения УЗИ, КТГ и гис­тологического исследования образ­цов удаленных опухолей все боль­ные женщины были распределены на 3 группы: 30 больных доброка­чественными эпителиальными опу­холями яичников (ДЭОЯ), 20 боль­ных эпителиальным раком яични­ков I-II стадии (ЭРЯ I-II) и 30 пациенток с эпителиальным раком яичников III-IV стадии (ЭРЯ III-IV).

Выделение ЛПК осуществля­лось на градиенте плотности Ficoll-Paque (р= 1,077 г/мл), про­изводства "Pharmacya Fine" Chemicals» (Швеция), по методу описанному Воуит (1968) [6].

 

Таблица 1. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1/3 и ФНО  ЛПК больных ЭОЯ

Группы	ИЛ 1/3, пкг/мл		ФНОа, пкг/мл
пациенток	Спонтанная, (М+т)	Стимулированная, (М±т)	Спонтанная, (М±т)	Стимулированная, (М±т)
Здоровые, п=30	47,5+4,1	578,4±60,3 #	58,8+2,9	981,8+90,9 #
ДЭОЯ, п=30	617,5±88,0 *	1556,0±205,4 * #	1056,0±72,3 *	2228±203,5 * #
ЭРЯ I-II, п=20	699,3+54,7 *	1500,0+112,5 * #	1114,0+78,2*	2267±157,8*#
ЭРЯ III-IV, п=30	1506,0+174,2 **	2270,0+175,9 ** #	1804,0+170,1**	2872+117,5** #

* -различиямежду больными ЭОЯи здоровыми женщинами (р<0,05);

* * -различия между больными ЭРЯи больными ДЭОЯ (р<0,05);

# -различиямежду спонтанной и стимулированной продукцией цитокинов ЛПК (р<0,05)

 

Культивирование ЛПК с целью моделирования условий in vivo проводили по методике, предложен­ной Н.М. Бережной и соавт. (1993) [ 1] Для этого к клеточ­ной суспензии, содержащей ЛПК в конечной концентрации 2x106 /мл среды 199, добавляли 10% ауто­сыворотки обследованных женщин и 40 мкг/мл гентамицина. Для оценки стимулированной продук­ции цитокинов в полученные кле­точные суспензии добавляли по 20 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) производства «ПанЭко» (Россия). Клеточные суспензии инкубировали в течение 24 часов при 37°С и 100% влажности в атмосфере 5% СО2. После исте­чения срока культивирования су­пернатанты очищали центрифу­гированием при 800 g в течение 30мин, собирали в стерильные пла­стиковые пробирки типа «Эппендорф» и хранили до тестирова­ния при -30 °C не более 6 мес.

Уровень цитокинов в культу­ральных средах определялся мето­дом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на план­шетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Швеция) с помощью наборов реагентов ТОО «Протеиновый контур» (Россия). По данным титрования стандар­тных образцов строились калиб­ровочные графики для каждого из цитокинов, по которым в исследу­емых образцах определялась концентрация ИЛ1Д ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа.

Статистическая обработка данных проводилась на компьюте­ре PENTIUM 300 с использовани­ем программы «Primer Biostatistic 4.03». Для всех показателей, по­лученных у женщин основной и контрольной группы, определялись средние значения (М), а также стандартная ошибка среднего (т). Для оценки достоверности разли­чий между значениями использо­вался простой критерий Стьюден­та. Различия между показателями считались достоверными при р<0,05.  

Результаты исследования

По нашим данным (табл. 1), спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1/3 и ФНОа лимфо­цитами всех больных опухолями яичников вне зависимости от сте­пени их злокачественности и рас­пространения опухолевого процес­са выше, чем у здоровых женщин. Увеличение продукции этих цито­кинов прогрессирует с распрост­ранением рака яичников, вслед­ствие чего лимфоциты больных ЭРЯ III-IV стадии продуцируют большее количество ИЛ1Д и ФНОа, чем лимфоциты больных доброкачественными опухолями.

В ответ на стимуляцию ФГА мононуклеарные клетки здоровых женщин увеличивают продукцию ИЛ1Д 12,3 раза и ФНОа в 17 раз, у больных опухолями яичников продукция этих цитокинов в от­вет на стимуляцию возрастает всего в 1,5-2 раза.

Полученные данные относи­тельно продукции ИЛ 1/3 и ФНОа ЛПК больных ЭОЯ соответству­ют данным литературы и убеди­тельно подтверждают факт по­вышенной исходной цитотоксичес­кой активности мононуклеарных клеток у этих больных. Сниже­ние способности мононуклеаров отвечать повышением продукции ИЛ1/3 и ФНОа связано с дости­жением максимальной активнос­ти этих клеток, при которой их дальнейшая активация невозмож­на.

При изучении продукции выде­ленными из периферической крови лимфоцитами интерлейкина-2 и интерлейкина-4 (табл. 2) нами установлено достоверное сниже­ние спонтанной и стимулирован­ной продукции ИЛ2 только у боль­ных раком яичников по сравнению со здоровыми женщинами и боль­ными доброкачественными опухо­лями. Лимфоциты больных ДЭОЯ продуцируют такое же количество ИЛ2, что и лимфоциты здо­ровых женщин.

 

Таблица 2. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ2 и ИЛ4 ЛПК больных ЭОЯ

Группы пациенток	ИЛ2, МЕ/мл		ИЛ4	пкг/мл
	Спонтанная, (М+т)	Стимулированная, (М+т)	Спонтанная, (М+т)	Стимулированная, (М+т)
Здоровые, (п=30)	110,2+0,9	116,1 ±0,7#	25,7+1,0	33,7+1,9#
ДЭОЯ, (п=30)	110,6+1,0	115,6+0,4#	37,9+3,6 *	53,7+5,4 * #
ЭРЯ1-П, (п=20)	105,5+1,3 **	113,2+0,5 ** #	42,4+4,5 *	52,5+5,2 * #
ЭРЯШ-IV, (п=30)	104,2 ±1,4 **	113,1+0,3**#	62,4+5,2 **	85,9+8,8**#

* -различия между больными ЭОЯ и здоровыми женщинами (р<0,05);

* * -различия между больными ЭРЯи больными ДЭОЯ (р<0,05);

# -различия между спонтанной и стимулированной продукцией цитокинов ЛПК (р<0,05)

 

Таблица 3. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ6 ЛПК больных ЭОЯ

Группы пациенток	ИЛ6, пкг/мл
	Спонтанная (М+т)	Стимулированная (М+т)
Здоровые, (п=30)	5409+534	14880+142#
ДЭОЯ, (п=30)	14030+233 *	15070+149
ЭРЯ1-П, (п=20)	15360+209 *	14600+172#
ЭРЯШ-IV, (п=30)	15630+152 *	14700+147#

* -различия между больными ЭОЯ и здоровыми женщинами (р<0,05);

* * -различия между больными ЭРЯи больными ДЭОЯ (р<0,05);

# -различия между спонтанной и стимулированной продукцией цитокинов ЛПК (р<0,05)

 

В отличие от ИЛ2, продукция ИЛ4 возрастает с прогрессирова­нием опухолевого процесса. При этом ЛПК всех больных опухоля­ми яичников вне зависимости от их злокачественности и степени распространения продуцируют больше ИЛ4, чем ЛПК здоровых женщин, а лимфоциты больных ра­ком продуцируют больше ИЛ4, чем лимфоциты больных доброкаче­ственными опухолями яичников.

Лимфоциты больных ЭОЯ со­храняют способность отвечать увеличением продукции ИЛ2 и ИЛ4 на стимуляцию ФГА, что свидетельствует о сохраненных резервных возможностях проти­воопухолевой активности Т-лим­фоцитов у этих больных.

Снижение продукции ИЛ2 и повышение концентрации ИЛ4 у больных опухолями яичников в процессе прогрессирования опухо­ли позволяет предположить нали­чие иммунной перестройки, кото­рая проявляется в преимуще­ственной активации Т-хелперов 2 типа, за дифференцировку кото­рых отвечает ИЛ4 [2, 4].

По нашим данным (табл. 3), спонтанная продукция ИЛ6 лим­фоцитами больных ЭОЯ выше, чем у здоровых женщин, вне зависимо­сти от степени злокачественнос­ти и распространенности опухо­ли. В отличие от базальной, сти­мулированная продукция ИЛ6 больных опухолями яичников не отличается от таковой у здоро­вых женщин.

При сравнении спонтанной и стимулированной продукции ИЛ6 ЛПК больных ЭОЯ нами установ­лено, что, в отличие от лимфоци­тов здоровых женщин, которые отвечают повышением продукции ИЛ6 на стимуляцию ФГА, лимфо­циты больных ДЭОЯ не реагиру­ют на неспецифическую иммуностимуляцию повышением продук­ции ИЛ6, а лимфоциты больных ЭРЯ в ответ на стимуляцию ФГА снижают продукцию этого интерлейкина.

Подобная парадоксальная реак­ция лимфоцитов больных опухо­лями яичников в отношении продукции ИЛ6 может быть объяс­нена достижением максимальной активности клеток, продуцирую­щих ИЛ6, и истощением их ком­пенсаторных возможностей.

Выводы

1. Мононуклеарные клетки пе­риферической крови больных ЭОЯ находятся в состоянии повышен­ной активации, которая прогрес­сирует с распространением опу­холевого процесса

2. Снижение интенсивности иммунного ответа мононуклеаров периферической крови больных ЭОЯ в ответ на неспецифичес­кую иммуностимуляцию свиде­тельствует об истощении потен­циала активации этих клеток.

3. На фоне повышенной продук­ции ИЛ 1/3 и ФНОа резко выра­женная декомпенсация резервных возможностей ЛПК больных ЭОЯ, продуцирующих ИЛ6, указывает на гиперпродукцию цитокинов, обла­дающих противоопухолевой цито­токсичностью, и на нарушение механизмов, регулирующих их син­тез.

4. Снижение у больных ЭОЯ иммунного ответа мононуклеаров периферической крови в ответ на стимуляцию и нарушение защит­ных механизмов, контролирующих продукцию ИЛ 1/3 и ФНОа, дела­ет сомнительной эффективность неспецифической иммунотерапии этих больных.

5. Снижение продукции ИЛ2 и повышение продукции ИЛ4 ЛПК больных ЭОЯ свидетельствует о нарушении активности Т-клеточных реакций 1 типа у этих боль­ных и делает применение реком­бинантных препаратов ИЛ2 ме­тодом выбора в противоопухоле­вой терапии ЭОЯ.

About the authors

R. V. Pavlov

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

V. A. Aksenenko

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

A. Yu. Krivoruchko

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

N. A. Pavlenko

Stavropol State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files