Иммунокомпетентные клетки в эндометрии пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом
- Авторы: Кулаков В.И.1, Волков Н.И.1, Беспалова Ж.В.1
-
Учреждения:
- Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
- Выпуск: Том 52, № 4 (2003)
- Страницы: 12-16
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 15.10.2003
- Статья одобрена: 26.11.2021
- Статья опубликована: 15.10.2003
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/89263
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD89263
- ID: 89263
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В статье сообщается о результатах иммуногистохимического исследования эндометрия пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом. Проведен анализ динамики распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии пациенток с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом в сравнении с пациентками, страдающими бесплодием трубно-перитонеального генеза.
Полный текст
Введение
В литературе неоднократно предпринимались попытки объяснить механизмы бесплодия при наружном генитальном эндометриозе [2;5;6;9]. Результаты этих исследований позволяют предполагать, что иммунная система может играть существенную роль в патогенезе бесплодия при этом заболевании [5, 6]. Однако вплоть до настоящего времени роль иммунной системы в патогенезе бесплодия, связанного с эндометриозом, изучена не до конца.
Как показали исследования последних лет, эндометрий играет фундаментальную роль в процессах имплантации [1]. Для успешной имплантации необходимо наличие эндометрия, готового принять функционально полноценный эмбрион на стадии бластоцисты и нормальное взаимодействие антигенов материнской и эмбриональной ткани. Регуляция взаимодействия между клетками эндометрия и трофобласта осуществляется с участием интерлейкина-1, интерлейкина-8, лептина и других звеньев иммунной системы [11].
По мнению ряда авторов, изменение состава и количества иммунокомпетентных клеток может приводить к нарушению процессов имплантации эмбриона в эндометрий [1, 7]. Однако имеющиеся данные неоднозначны, что делает актуальным проведение исследования состояния иммунокомпетентных клеток эндометрия на протяжении менструального цикла у женщин с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом.
Материал и методы исследования
В исследование включено 300 пациенток с регулярным 28-днев- ным овуляторным менструальным циклом, страдающих бесплодием. Всем была выполнена лапароскопия и биопсия эндометрия. В соответствии с задачами исследования, все пациентки были разделены на 2 группы.
Основную группу составили 150 пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом I-IV степени распространения (согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности, r-AFS, 1996) [13] при проходимых маточных трубах.
Во II группу (контрольную) вошли 150 пациенток, страдающих бесплодием, обусловленным спаечным процессом в малом тазу (при непроходимых маточных трубах).
Средний возраст пациенток 31,1±3,2 лет (при колебаниях от 18 до 42 лет). Продолжительность периода бесплодия 4,6±1,9 лет (при колебаниях от 1 до 15 лет).
Таблица.Используемые моноклональные антитела
Название | Предназначено (CD) | Специфичность в отношении антигенов | Распределение маркированных антигенов | Разведение |
Anti-Leu4 | CD3 | Молекулярный вес (МВ) 22-28 кД. Поверхностные антигены | Т-лимфоциты. Пан-Т-маркер | 1:200 |
Anti-Leu3a | CD4 | МВ 55 кД. Поверхностные антигены | Т4-хелперы/индукторы (моноциты, макрофаги) | 1:400 |
Anti-Leu2a | CD8 | МВ 32 кД. МВ 43 кД. Поверхностные антигены | Т8 - цитотоксические/супрес- сорные лимфоциты | 1:400 |
Anti-Leu7 (HNK-1) | — | МВ 110 кД | Натуральные киллеры (НК); Подгруппа Т-лимфоцитов | 1:50 |
Anti-Human B-cell Клон To 15 | CD22 | МВ 130 кД | В-лимфоциты. Пан-В-маркер | 1:100 |
Лапароскопия и биопсия эндометрия была проведена с 5 по 28 день менструального цикла. В каждый из дней указанного периода оперировано 5-7 пациенток. Полученные образцы ткани эндометрия сохраняли при температуре —800°С до микроскопического исследования.
Соответствие каждого образца эндометрия определенному дню менструального цикла устанавливали с помощью вычисления относительно даты первого дня последней менструации и гистологического исследования биоптатов эндометрия по методу Dallenbach-Hellwer (1981) [2].
Для проведения иммунохимического исследования были приготовлены микропрепараты образцов эндометрия. Идентификация CD3-, CD4- и СD8-позитивных лимфоцитов, натуральных киллеров и В-лимфоцитов была проведена с использованием панели из 5 моноклональных антител: Anti-Leu4, Anti-Leu3a, Anti-Leu2a, Anti-Leu7, Anti-Human-B-cell (таблица). Эти антитела, специфически связываясь с лимфоидными клетками, окрашивают их в коричневый цвет, что позволяет отличить их при световой микроскопии.
Анализ и оценка препаратов осуществлялись с помощью световой микроскопии. В каждом срезе проводили подсчет абсолютного числа клеток, меченных соответствующими антителами.
Статистический анализ результатов проводился с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Динамика распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии в течение менструального цикла.
1 Распределение Т-лимфоцитов
1.1 СDЗ-позитивные Т-лимфоциты
СDЗ-антиген содержится на мембранах Т-лимфоцитов и позволяет определить их количество среди всех лимфоцитов. У пациенток с эндометриозом начальный уровень СDЗ-позитивных Т-клеток составлял 240 в 1 мм2 на 5-й день цикла, достигал 290 в 1 мм2 к 7 дню цикла (р>0,05) и снижался до 180 в 1 мм2 к 12 дню цикла, далее варьируясь в пределах 100—150 клеток в 1 мм2 до конца цикла.
В контрольной группе число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов в ранней пролиферативной фазе колебалось с 420 клеток в 1 мм2 на 5-й день менструального цикла до 570 в 1 мм2 на 6-й день (р>0,05). После 6 дня цикла их количество снижалось до 180 в 1 мм2 к 12 дню. Далее число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов варьировалось в пределах 100-150 клеток в 1 мм2.
Сравнение динамики изменения уровня CD3-пoзитивных Т-лимфоцитов у женщин с эндометриозом и в контрольной группе не выявило существенных различий на протяжении менструального цикла (р>0,05).
1.2 Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD 4)
Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD4-no- зитивные Т-лимфоциты), участвуют в начальном этапе иммунного ответа. Они распознают чужеродные антигены и передают информацию о них В-лимфоцитам, которые, в свою очередь, вырабатывают специфические антитела.
У пациенток с эндометриозом число CD4-пoзитивных Т-лимфоцитов было максимальным между 5 и 6 днем менструального цикла и составляло 110-120 в 1 мм2. Далее к 13-му дню менструального цикла их количество стремительно снижалось до 30 клеток в 1 мм2. После незначительного повышения на 16-й день, происходило медленное снижение до 20 клеток в 1 мм2, вплоть до конца менструального цикла.
В контрольной группе на протяжении всего менструального цикла динамика изменения уровня СD4-позитивных лимфоцитов соответствовала изменениям в группе больных эндометриозом (р>0,05).
1.3 Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8)
Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8-позитивные лимфоциты) играют противоположную Т-хелперам функцию в гуморальном иммунитете (угнетают систему гуморального иммунитета). Они принимают участие в формировании естественной или индуцированной антигеном иммунологической толерантности. Важная роль принадлежит этим клеткам в процессах угнетения естественного иммунного ответа на нидацию оплодотворенной яйцеклетки, которая на начальном этапе воспринимается иммунной системой как чужеродный антигенный объект. При нарушении функции Т-супрессорного звена иммунитета в подавляющем большинстве случаев происходит отторжение эмбриона на самых ранних этапах имплантации.
Максимальный уровень CD8-позитивных Т-лимфоцитов у пациенток с эндометриозом был на 5-8-й день менструального цикла и составлял 125 клеток в 1 мм2. Начиная с 9-го дня их число быстро снижалось, достигая уровня 48 клеток в 1 мм2 к 14-му дню менструального цикла. После 14-го дня их количество было относительно постоянным вплоть до конца менструального цикла (р>0,05).
В контрольной группе изменение количества CD8-позитивных лимфоцитов в 1 мм2 соответствовало характеру изменений в группе больных эндометриозом. Различия были статистически недостоверны (р>0,05).
1.4 Натуральные киллеры (Leu7)
Натуральные киллеры (Lеu7-позитивные клетки) — большие гранулярные клетки, содержащие белок перфорин, который, проникая в цитоплазму клетки-мишени, вызывает осмотический взрыв и лизис. Натуральные киллеры осуществляют важную функцию иммунной системы — сохранение генетического гомеостаза организма путем киллинга клеток, несущих генетическую неоднородность.
У пациенток с эндометриозом число Leu7-пoзитивных клеток было постоянным на протяжении всего менструального цикла (около 4 в 1 мм2).
В контрольной группе Lеu7-позитивные клетки на протяжении всего менструального цикла встречались редко, были слабо окрашены и не имели четкой локализации. Эти клетки располагались в строме эндометрия и среди скоплений лимфоцитов, а в некоторых препаратах отсутствовали. Максимальное число этих клеток (20 в 1 мм2 ) зафиксировано на 5-й день менструального цикла. На 8-й день их количество снижалось до 3—4 в 1 мм2, оставаясь стабильным на протяжении всех последующих дней менструального цикла.
Статистически достоверных отличий от контрольной группы не выявлено (р>0,05).
2 Распределение В-лимфоцитов (CD22)
В-лимфоциты отвечают на антигенное раздражение синтезом антител, связывающих эти антигены. Конечной фазой этой реакции является уничтожение чужеродных антигенов.
Этот класс лимфоцитов был обнаружен в скоплениях лимфоцитов. Подобная микроскопическая картина наблюдалась в обеих группах обследованных.
В эндометрии пациенток, страдающих эндометриозом, максимальный уровень СD22-позитивных клеток зарегистрирован на 5-8-й день менструального цикла (40 клеток в 1 мм2). К концу пролиферативной фазы, на 11-й день менструального цикла, количество этих клеток снижалось до 20 в 1 мм2, впоследствии их число колебалось от 10 до 25 клеток в 1 мм2 с пиковым значением на 13-й день менструального цикла.
Количественная динамика СD22-позитивных В-лимфоцитов у пациенток со спаечным процессом в малом тазу: на 6-8-й день менструального цикла достигался максимум со средним числом 50 клеток в мм2. После 9-го дня менструального цикла их число стремительно снижалось и между 11 и 23 днями составляло 12 СD22-позитивных клеток в 1 мм2. Между 23 и 26 днями их число возрастало до 30 в 1 мм2, затем снова снижалось к концу менструального цикла.
В обеих обследованных группах пациенток существенных различий не отмечалось (р>0,05).
3 Распределение макрофагов
Макрофаги выполняют функцию разрушения и переваривания поврежденных, дефектных, состарившихся клеток организма, а также чужеродных клеточных агентов.
Встречаемость и распределение макрофагов в эндометрии на протяжении менструального цикла были одинаковыми у пациенток обеих групп. Количественные изменения клеток были незначительны (р>0,05).
В начале менструального цикла среднее число макрофагов варьировалось в пределах 150-200 клеток в 1 мм2, затем к 11-му дню менструального цикла медленно снижалось до 100±10 клеток. С 11-го по 21-й день количество макрофагов оставалось стабильным, а начиная с 22-го дня менструального цикла, их число возрастало, достигая уровня фазы ранней пролиферации.
4 Агрегации лимфоцитов
Агрегации лимфоцитов встречались на протяжении всего менструального цикла в эндометрии пациенток обеих групп. В группе пациенток с эндометриозом агрегация лимфоцитов наблюдалась в фолликулярную фазу в 27% образцов и в 6% образцов в лютеиновую фазу. В контрольной группе агрегация лимфоцитов наблюдалась в 22% образцов в фолликулярную фазу цикла и в 10% образцов в лютеиновую фазу цикла. Не было различий структуры скоплений лимфоцитов у пациенток обеих обследованных групп. Скопления лимфоцитов состояли из сотен клеток, расположенных в основном в функциональном слое. Небольшие группы лимфоцитов присутствовали вокруг желез.
Центральные поля крупных скоплений состояли преимущественно из В-лимфоцитов. Т-лимфоциты локализовались в основном в краевых зонах этих полей.
Макрофаги были представлены по краям, и лишь изредка — внутри скоплений лимфоцитов.
Обсуждение
- Т-лимфоциты. Различные подгруппы Т-лимфоцитов обнаруживались как в виде отдельных клеток, так и в виде интра- и субэпителиальных клеточных агрегатов в эндометрии в течение всего менструального цикла. Количество и распределение этих клеток в течение менструального цикла не различаются у пациенток с эндометриозом и пациенток контрольной группы.
Наибольшее количество клеток было обнаружено с помощью маркера anti-Leu 4 (CD3). Установлено, что динамика распределения клеток различных подгрупп схожа и имеет 2 максимума: в раннюю пролиферативную фазу и в конце секреторной фазы, без выраженных изменений в промежутке. Среднее количество различных Т-лимфоцитов имело колебания, не превышающее±10 клеток в 1 мм2 во вторую фазу цикла. При этом высокая концентрация Т-лимфоцитов в начале менструального цикла может быть объяснена анатомическими особенностями: толщина функционального слоя эндометрия в эту фазу составляет от 0,5 до 4 мм. Следовательно, в начале пролиферативной фазы менструального цикла биопсия может быть взята из более глубоких слоев эндометрия с наибольшей плотностью клеток. Соотношение CD4:CD8 — «индекс иммунорегуляции» — является показателем гармоничного функционирования иммунной системы и в норме составляет 1:2. В раннюю пролиферативную фазу соотношение CD4:CD8 составило 1:1. В дальнейшем количество СD4-позитивных клеток снижалось, в то время как уровень CD8-позитивных клеток оставался относительно стабильным. К концу менструального цикла мы наблюдали преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов, при этом соотношение CD4:CD8 колебалось от 1:2 до 1:4. Подобная картина наблюдалась в эндометрии больных обеих групп. Полученные данные совпадают с результатами проведенных ранее исследований [5, 14]. Преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов в тканях, чувствительных к эстрогенам, может быть объяснено тем, что эти клетки имеют рецепторы эстрогенов, тогда как у СD4-позитивных лимфоцитов эти рецепторы отсутствуют [12].
- Натуральные киллеры в небольшом количестве присутствовали в эндометрии в течение всего менструального цикла. Мы не обнаружили разницы в количестве и распределении этих клеток у женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой. Lydyard и Grossi в работе по изучению иммунологических возможностей натуральных киллеров доказали присутствие небольшого количества этих клеток в эндометрии. Кроме того, их количество подвергалось циклическим изменениям [8]. Аналогичные результаты относительно эндометрия здоровых женщин были описаны Kamat и Isaacson (1987), King et al. (1988) [5, 6].
- В-лимфоциты. В эндометрии обследованных пациенток найдено небольшое количество В-лимфоцитов. В некоторых скоплениях лимфоцитов обнаружены поля, состоящие исключительно из В-лимфоцитов. Эти находки совпадают с результатами исследований эндометрия здоровых женщин [5, 10].
- Макрофаги. Макрофаги присутствовали в эндометрии женщин с эндометриозом и в контрольной группе в сходных количествах на протяжении всего менструального цикла. Средний уровень макрофагов был высоким в начале и в конце менструального цикла, а в середине цикла имел тенденцию к снижению. Макрофаги были равномерно распределены в строме эндометрия, и лишь изредка встречались интра- и субэпителиально. Однако роль макрофагов эндометрия при эндометриозе и связанном с ним бесплодии остается не ясной. В настоящее время некоторые исследователи сообщают о повышении уровня и активности макрофагов в перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом [3, 4, 9, 15]. Другие авторы указывают на повышение количества макрофагов в секреторную фазу [8].
- Скопления лимфоцитов. В эндометрии пациенток обеих групп обнаруживались скопления лимфоцитов на протяжении всего менструального цикла. Выявлена циклическая зависимость в распределении этих скоплений. В контрольной группе они были обнаружены в 22% образцов материала в пролиферативную фазу и в 10% образцов в секреторную фазу. В группе пациенток с эндометриозом скопления лимфоцитов обнаруживались в 27 и 6% образцов материала соответственно. Скопления лимфоцитов располагались главным образом в нижней части функционального и базальном слое эндометрия и состояли из В-лимфоцитов в центральной зоне и Т-лимфоцитов по периферии скоплений. Подобные данные относительно распределения и состава скоплений лимфоцитов имеются в литературе, однако эти исследования базируются на малом числе наблюдений, и в них отсутствует подбор пациенток по возрасту [5, 10, 14].
Заключение
Анализируя данные, полученные при изучении динамики распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии пациенток с эндометриозом и со спаечным процессом в малом тазу на протяжении менструального цикла, можно сделать следующие выводы:
- Количество и распределение Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, скоплений лимфоцитов подвержены циклическим изменениям, что, по нашему мнению, может свидетельствовать о тесной взаимосвязи функции яичников и локальной функции иммунокомпетентных клеток, и подтверждает характеристику эндометрия как слизисто-лимфатической ткани.
- Отсутствие различий в количественных и качественных показателях динамики распределения иммунокомпетентных клеток эндометрия (различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, макрофагов) в зависимости от фаз менструального цикла у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе в сравнении с контрольной группой (бесплодие при непроходимых маточных трубах вследствие спаечного процесса развившегося после перенесенных воспалительных заболеваний органов малого таза) свидетельствует о сохранении нормальной функции эндометрия у пациенток с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе.
Об авторах
В. И. Кулаков
Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва
Н. И. Волков
Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва
Ж. В. Беспалова
Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва
Список литературы
- Carver H., Martin К., Sryropoulou I., Barlow D., Sargen I., Mardon H. An in-vitro model for stromal invasion during implantation of the human blastocyst // Human Reproduction. - Vol. 18, N 2. - 200,3. - P. 283-290.
- Dallenbach-Hellweg G. Histopatologie des endometriums. - Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 1981.
- Haney A.E., Handwerger S., Weiberg G.B. Peritoneal fluid prolactin in infertile women with endometriosis: lack of evidence of secretory activity by endometric implants // Fertil. Steril. - 1984. - Vol. 42. - P. 932-938.
- Halme J., Hammond M.G., Hulka J.F. et al. Retrograde menstruation in healthy women and patients with endometriosis // Obstetr. Gynecol. - 1984. - 64:151-154.
- Kamat B.R., Isaacson P.G. The immunohistochemical distribution of leukocytic subpopulations in human endometrium // Am. J. Pathol. - 1987. — Vol. 127. - P. 66-73.
- King A., Wellings V., Gardner L., Loke Y.W. Immunocytochemical characterization of the unusual large granular lymphocytes in human endometrium throughout the menstrual cycle // Hum. Immunol. - 1988. - Vol. 24. - P. 195-205.
- Klentzeris L.D. Роль эндометрия в имплантации (обзор литературы). // Проблемы репродукции. - N 2. - 1999.
- Lygyard Р., Grossi С. Cells involved in the immune response. In: Immunology. — Edinburgh, London, Melbourne, 1989. - P. 2.2-2.17.
- Mettler L. Immunphanotypvon Endometrium und Endometriose // Endometriose. - 1989. - N 3. - P. 64-69.
- Morris H., Edwards J., Tiltman A., Emms M. Endometrial lymphoid tissue: an immunhystological study // J. Clin. Pathol. - 1985. - Vol. 38. - P. 644-652.
- Pellicer A., Dominguez F., Simon C. Endometrial factors of implantation failure. In: Joint SIG Embryology and SIG Reproductive Genetics course. ESHRE 2003. - Madrid, 2003. -P. 30-32.
- Press M. F., Mousec-Goebel N.A., Bur M., Green G.L. Estrogen receptor localization in female genital tract // Am. J. Pathol. - 1989. - Vol. 123. - P. 280-292.
- Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. // Fertil. Steril. - 1997. - Vol. 67, N 5. - P. 817-821.
- Tabibzadeh S.S. Proliferative activity of lymphoid cells in human endometrium throughout of menstrual cycle // J. Clin. Endocrin. Metab. -1990. - Vol. 70. - P437-443.
- Weinberg J.B., Haney A.E., Ramakrishnan S. Peritoneal fluid and plasma level of human macrophage colony - stimulation factor in relation to peritoneal fluid macrophage content // Blood. - 1991. - 78. - P. 513-516.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)