Immunocompetent cells in the endometrium of patients with infertility and external genital endometriosis
- 作者: Kulakov V.I.1, Volkov N.I.1, Bespalova J.V.1
-
隶属关系:
- Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences
- 期: 卷 52, 编号 4 (2003)
- 页面: 12-16
- 栏目: Original Research
- ##submission.dateSubmitted##: 15.10.2003
- ##submission.dateAccepted##: 26.11.2021
- ##submission.datePublished##: 15.10.2003
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/89263
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD89263
- ID: 89263
如何引用文章
全文:
详细
The article reports on the results of an immunohistochemical study of the endometrium of patients with infertility and external genital endometriosis. The analysis of the dynamics of the distribution of immunocompetent cells in the endometrium of patients with infertility due to external genital endometriosis in comparison with patients with infertility of tubo-peritoneal genesis was carried out.
全文:
Введение
В литературе неоднократно предпринимались попытки объяснить механизмы бесплодия при наружном генитальном эндометриозе [2;5;6;9]. Результаты этих исследований позволяют предполагать, что иммунная система может играть существенную роль в патогенезе бесплодия при этом заболевании [5, 6]. Однако вплоть до настоящего времени роль иммунной системы в патогенезе бесплодия, связанного с эндометриозом, изучена не до конца.
Как показали исследования последних лет, эндометрий играет фундаментальную роль в процессах имплантации [1]. Для успешной имплантации необходимо наличие эндометрия, готового принять функционально полноценный эмбрион на стадии бластоцисты и нормальное взаимодействие антигенов материнской и эмбриональной ткани. Регуляция взаимодействия между клетками эндометрия и трофобласта осуществляется с участием интерлейкина-1, интерлейкина-8, лептина и других звеньев иммунной системы [11].
По мнению ряда авторов, изменение состава и количества иммунокомпетентных клеток может приводить к нарушению процессов имплантации эмбриона в эндометрий [1, 7]. Однако имеющиеся данные неоднозначны, что делает актуальным проведение исследования состояния иммунокомпетентных клеток эндометрия на протяжении менструального цикла у женщин с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом.
Материал и методы исследования
В исследование включено 300 пациенток с регулярным 28-днев- ным овуляторным менструальным циклом, страдающих бесплодием. Всем была выполнена лапароскопия и биопсия эндометрия. В соответствии с задачами исследования, все пациентки были разделены на 2 группы.
Основную группу составили 150 пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом I-IV степени распространения (согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности, r-AFS, 1996) [13] при проходимых маточных трубах.
Во II группу (контрольную) вошли 150 пациенток, страдающих бесплодием, обусловленным спаечным процессом в малом тазу (при непроходимых маточных трубах).
Средний возраст пациенток 31,1±3,2 лет (при колебаниях от 18 до 42 лет). Продолжительность периода бесплодия 4,6±1,9 лет (при колебаниях от 1 до 15 лет).
Таблица.Используемые моноклональные антитела
Название | Предназначено (CD) | Специфичность в отношении антигенов | Распределение маркированных антигенов | Разведение |
Anti-Leu4 | CD3 | Молекулярный вес (МВ) 22-28 кД. Поверхностные антигены | Т-лимфоциты. Пан-Т-маркер | 1:200 |
Anti-Leu3a | CD4 | МВ 55 кД. Поверхностные антигены | Т4-хелперы/индукторы (моноциты, макрофаги) | 1:400 |
Anti-Leu2a | CD8 | МВ 32 кД. МВ 43 кД. Поверхностные антигены | Т8 - цитотоксические/супрес- сорные лимфоциты | 1:400 |
Anti-Leu7 (HNK-1) | — | МВ 110 кД | Натуральные киллеры (НК); Подгруппа Т-лимфоцитов | 1:50 |
Anti-Human B-cell Клон To 15 | CD22 | МВ 130 кД | В-лимфоциты. Пан-В-маркер | 1:100 |
Лапароскопия и биопсия эндометрия была проведена с 5 по 28 день менструального цикла. В каждый из дней указанного периода оперировано 5-7 пациенток. Полученные образцы ткани эндометрия сохраняли при температуре —800°С до микроскопического исследования.
Соответствие каждого образца эндометрия определенному дню менструального цикла устанавливали с помощью вычисления относительно даты первого дня последней менструации и гистологического исследования биоптатов эндометрия по методу Dallenbach-Hellwer (1981) [2].
Для проведения иммунохимического исследования были приготовлены микропрепараты образцов эндометрия. Идентификация CD3-, CD4- и СD8-позитивных лимфоцитов, натуральных киллеров и В-лимфоцитов была проведена с использованием панели из 5 моноклональных антител: Anti-Leu4, Anti-Leu3a, Anti-Leu2a, Anti-Leu7, Anti-Human-B-cell (таблица). Эти антитела, специфически связываясь с лимфоидными клетками, окрашивают их в коричневый цвет, что позволяет отличить их при световой микроскопии.
Анализ и оценка препаратов осуществлялись с помощью световой микроскопии. В каждом срезе проводили подсчет абсолютного числа клеток, меченных соответствующими антителами.
Статистический анализ результатов проводился с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Динамика распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии в течение менструального цикла.
1 Распределение Т-лимфоцитов
1.1 СDЗ-позитивные Т-лимфоциты
СDЗ-антиген содержится на мембранах Т-лимфоцитов и позволяет определить их количество среди всех лимфоцитов. У пациенток с эндометриозом начальный уровень СDЗ-позитивных Т-клеток составлял 240 в 1 мм2 на 5-й день цикла, достигал 290 в 1 мм2 к 7 дню цикла (р>0,05) и снижался до 180 в 1 мм2 к 12 дню цикла, далее варьируясь в пределах 100—150 клеток в 1 мм2 до конца цикла.
В контрольной группе число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов в ранней пролиферативной фазе колебалось с 420 клеток в 1 мм2 на 5-й день менструального цикла до 570 в 1 мм2 на 6-й день (р>0,05). После 6 дня цикла их количество снижалось до 180 в 1 мм2 к 12 дню. Далее число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов варьировалось в пределах 100-150 клеток в 1 мм2.
Сравнение динамики изменения уровня CD3-пoзитивных Т-лимфоцитов у женщин с эндометриозом и в контрольной группе не выявило существенных различий на протяжении менструального цикла (р>0,05).
1.2 Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD 4)
Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD4-no- зитивные Т-лимфоциты), участвуют в начальном этапе иммунного ответа. Они распознают чужеродные антигены и передают информацию о них В-лимфоцитам, которые, в свою очередь, вырабатывают специфические антитела.
У пациенток с эндометриозом число CD4-пoзитивных Т-лимфоцитов было максимальным между 5 и 6 днем менструального цикла и составляло 110-120 в 1 мм2. Далее к 13-му дню менструального цикла их количество стремительно снижалось до 30 клеток в 1 мм2. После незначительного повышения на 16-й день, происходило медленное снижение до 20 клеток в 1 мм2, вплоть до конца менструального цикла.
В контрольной группе на протяжении всего менструального цикла динамика изменения уровня СD4-позитивных лимфоцитов соответствовала изменениям в группе больных эндометриозом (р>0,05).
1.3 Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8)
Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8-позитивные лимфоциты) играют противоположную Т-хелперам функцию в гуморальном иммунитете (угнетают систему гуморального иммунитета). Они принимают участие в формировании естественной или индуцированной антигеном иммунологической толерантности. Важная роль принадлежит этим клеткам в процессах угнетения естественного иммунного ответа на нидацию оплодотворенной яйцеклетки, которая на начальном этапе воспринимается иммунной системой как чужеродный антигенный объект. При нарушении функции Т-супрессорного звена иммунитета в подавляющем большинстве случаев происходит отторжение эмбриона на самых ранних этапах имплантации.
Максимальный уровень CD8-позитивных Т-лимфоцитов у пациенток с эндометриозом был на 5-8-й день менструального цикла и составлял 125 клеток в 1 мм2. Начиная с 9-го дня их число быстро снижалось, достигая уровня 48 клеток в 1 мм2 к 14-му дню менструального цикла. После 14-го дня их количество было относительно постоянным вплоть до конца менструального цикла (р>0,05).
В контрольной группе изменение количества CD8-позитивных лимфоцитов в 1 мм2 соответствовало характеру изменений в группе больных эндометриозом. Различия были статистически недостоверны (р>0,05).
1.4 Натуральные киллеры (Leu7)
Натуральные киллеры (Lеu7-позитивные клетки) — большие гранулярные клетки, содержащие белок перфорин, который, проникая в цитоплазму клетки-мишени, вызывает осмотический взрыв и лизис. Натуральные киллеры осуществляют важную функцию иммунной системы — сохранение генетического гомеостаза организма путем киллинга клеток, несущих генетическую неоднородность.
У пациенток с эндометриозом число Leu7-пoзитивных клеток было постоянным на протяжении всего менструального цикла (около 4 в 1 мм2).
В контрольной группе Lеu7-позитивные клетки на протяжении всего менструального цикла встречались редко, были слабо окрашены и не имели четкой локализации. Эти клетки располагались в строме эндометрия и среди скоплений лимфоцитов, а в некоторых препаратах отсутствовали. Максимальное число этих клеток (20 в 1 мм2 ) зафиксировано на 5-й день менструального цикла. На 8-й день их количество снижалось до 3—4 в 1 мм2, оставаясь стабильным на протяжении всех последующих дней менструального цикла.
Статистически достоверных отличий от контрольной группы не выявлено (р>0,05).
2 Распределение В-лимфоцитов (CD22)
В-лимфоциты отвечают на антигенное раздражение синтезом антител, связывающих эти антигены. Конечной фазой этой реакции является уничтожение чужеродных антигенов.
Этот класс лимфоцитов был обнаружен в скоплениях лимфоцитов. Подобная микроскопическая картина наблюдалась в обеих группах обследованных.
В эндометрии пациенток, страдающих эндометриозом, максимальный уровень СD22-позитивных клеток зарегистрирован на 5-8-й день менструального цикла (40 клеток в 1 мм2). К концу пролиферативной фазы, на 11-й день менструального цикла, количество этих клеток снижалось до 20 в 1 мм2, впоследствии их число колебалось от 10 до 25 клеток в 1 мм2 с пиковым значением на 13-й день менструального цикла.
Количественная динамика СD22-позитивных В-лимфоцитов у пациенток со спаечным процессом в малом тазу: на 6-8-й день менструального цикла достигался максимум со средним числом 50 клеток в мм2. После 9-го дня менструального цикла их число стремительно снижалось и между 11 и 23 днями составляло 12 СD22-позитивных клеток в 1 мм2. Между 23 и 26 днями их число возрастало до 30 в 1 мм2, затем снова снижалось к концу менструального цикла.
В обеих обследованных группах пациенток существенных различий не отмечалось (р>0,05).
3 Распределение макрофагов
Макрофаги выполняют функцию разрушения и переваривания поврежденных, дефектных, состарившихся клеток организма, а также чужеродных клеточных агентов.
Встречаемость и распределение макрофагов в эндометрии на протяжении менструального цикла были одинаковыми у пациенток обеих групп. Количественные изменения клеток были незначительны (р>0,05).
В начале менструального цикла среднее число макрофагов варьировалось в пределах 150-200 клеток в 1 мм2, затем к 11-му дню менструального цикла медленно снижалось до 100±10 клеток. С 11-го по 21-й день количество макрофагов оставалось стабильным, а начиная с 22-го дня менструального цикла, их число возрастало, достигая уровня фазы ранней пролиферации.
4 Агрегации лимфоцитов
Агрегации лимфоцитов встречались на протяжении всего менструального цикла в эндометрии пациенток обеих групп. В группе пациенток с эндометриозом агрегация лимфоцитов наблюдалась в фолликулярную фазу в 27% образцов и в 6% образцов в лютеиновую фазу. В контрольной группе агрегация лимфоцитов наблюдалась в 22% образцов в фолликулярную фазу цикла и в 10% образцов в лютеиновую фазу цикла. Не было различий структуры скоплений лимфоцитов у пациенток обеих обследованных групп. Скопления лимфоцитов состояли из сотен клеток, расположенных в основном в функциональном слое. Небольшие группы лимфоцитов присутствовали вокруг желез.
Центральные поля крупных скоплений состояли преимущественно из В-лимфоцитов. Т-лимфоциты локализовались в основном в краевых зонах этих полей.
Макрофаги были представлены по краям, и лишь изредка — внутри скоплений лимфоцитов.
Обсуждение
- Т-лимфоциты. Различные подгруппы Т-лимфоцитов обнаруживались как в виде отдельных клеток, так и в виде интра- и субэпителиальных клеточных агрегатов в эндометрии в течение всего менструального цикла. Количество и распределение этих клеток в течение менструального цикла не различаются у пациенток с эндометриозом и пациенток контрольной группы.
Наибольшее количество клеток было обнаружено с помощью маркера anti-Leu 4 (CD3). Установлено, что динамика распределения клеток различных подгрупп схожа и имеет 2 максимума: в раннюю пролиферативную фазу и в конце секреторной фазы, без выраженных изменений в промежутке. Среднее количество различных Т-лимфоцитов имело колебания, не превышающее±10 клеток в 1 мм2 во вторую фазу цикла. При этом высокая концентрация Т-лимфоцитов в начале менструального цикла может быть объяснена анатомическими особенностями: толщина функционального слоя эндометрия в эту фазу составляет от 0,5 до 4 мм. Следовательно, в начале пролиферативной фазы менструального цикла биопсия может быть взята из более глубоких слоев эндометрия с наибольшей плотностью клеток. Соотношение CD4:CD8 — «индекс иммунорегуляции» — является показателем гармоничного функционирования иммунной системы и в норме составляет 1:2. В раннюю пролиферативную фазу соотношение CD4:CD8 составило 1:1. В дальнейшем количество СD4-позитивных клеток снижалось, в то время как уровень CD8-позитивных клеток оставался относительно стабильным. К концу менструального цикла мы наблюдали преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов, при этом соотношение CD4:CD8 колебалось от 1:2 до 1:4. Подобная картина наблюдалась в эндометрии больных обеих групп. Полученные данные совпадают с результатами проведенных ранее исследований [5, 14]. Преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов в тканях, чувствительных к эстрогенам, может быть объяснено тем, что эти клетки имеют рецепторы эстрогенов, тогда как у СD4-позитивных лимфоцитов эти рецепторы отсутствуют [12].
- Натуральные киллеры в небольшом количестве присутствовали в эндометрии в течение всего менструального цикла. Мы не обнаружили разницы в количестве и распределении этих клеток у женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой. Lydyard и Grossi в работе по изучению иммунологических возможностей натуральных киллеров доказали присутствие небольшого количества этих клеток в эндометрии. Кроме того, их количество подвергалось циклическим изменениям [8]. Аналогичные результаты относительно эндометрия здоровых женщин были описаны Kamat и Isaacson (1987), King et al. (1988) [5, 6].
- В-лимфоциты. В эндометрии обследованных пациенток найдено небольшое количество В-лимфоцитов. В некоторых скоплениях лимфоцитов обнаружены поля, состоящие исключительно из В-лимфоцитов. Эти находки совпадают с результатами исследований эндометрия здоровых женщин [5, 10].
- Макрофаги. Макрофаги присутствовали в эндометрии женщин с эндометриозом и в контрольной группе в сходных количествах на протяжении всего менструального цикла. Средний уровень макрофагов был высоким в начале и в конце менструального цикла, а в середине цикла имел тенденцию к снижению. Макрофаги были равномерно распределены в строме эндометрия, и лишь изредка встречались интра- и субэпителиально. Однако роль макрофагов эндометрия при эндометриозе и связанном с ним бесплодии остается не ясной. В настоящее время некоторые исследователи сообщают о повышении уровня и активности макрофагов в перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом [3, 4, 9, 15]. Другие авторы указывают на повышение количества макрофагов в секреторную фазу [8].
- Скопления лимфоцитов. В эндометрии пациенток обеих групп обнаруживались скопления лимфоцитов на протяжении всего менструального цикла. Выявлена циклическая зависимость в распределении этих скоплений. В контрольной группе они были обнаружены в 22% образцов материала в пролиферативную фазу и в 10% образцов в секреторную фазу. В группе пациенток с эндометриозом скопления лимфоцитов обнаруживались в 27 и 6% образцов материала соответственно. Скопления лимфоцитов располагались главным образом в нижней части функционального и базальном слое эндометрия и состояли из В-лимфоцитов в центральной зоне и Т-лимфоцитов по периферии скоплений. Подобные данные относительно распределения и состава скоплений лимфоцитов имеются в литературе, однако эти исследования базируются на малом числе наблюдений, и в них отсутствует подбор пациенток по возрасту [5, 10, 14].
Заключение
Анализируя данные, полученные при изучении динамики распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии пациенток с эндометриозом и со спаечным процессом в малом тазу на протяжении менструального цикла, можно сделать следующие выводы:
- Количество и распределение Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, скоплений лимфоцитов подвержены циклическим изменениям, что, по нашему мнению, может свидетельствовать о тесной взаимосвязи функции яичников и локальной функции иммунокомпетентных клеток, и подтверждает характеристику эндометрия как слизисто-лимфатической ткани.
- Отсутствие различий в количественных и качественных показателях динамики распределения иммунокомпетентных клеток эндометрия (различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, макрофагов) в зависимости от фаз менструального цикла у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе в сравнении с контрольной группой (бесплодие при непроходимых маточных трубах вследствие спаечного процесса развившегося после перенесенных воспалительных заболеваний органов малого таза) свидетельствует о сохранении нормальной функции эндометрия у пациенток с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе.
作者简介
V. Kulakov
Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences
编辑信件的主要联系方式.
Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Moscow
N. Volkov
Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences
Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Moscow
J. Bespalova
Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences
Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Moscow