Immunocompetent cells in the endometrium of patients with infertility and external genital endometriosis

Full Text

Введение

В литературе неоднократно предпринимались попытки объяснить механизмы бесплодия при наружном генитальном эндометриозе [2;5;6;9]. Результаты этих исследований позволяют предполагать, что иммунная система может играть существенную роль в патогенезе бесплодия при этом заболевании [5, 6]. Однако вплоть до настоящего времени роль иммунной системы в патогенезе бесплодия, связанного с эндометриозом, изучена не до конца.

Как показали исследования последних лет, эндометрий играет фундаментальную роль в процессах имплантации [1]. Для успешной имплантации необходимо наличие эндометрия, готового принять функционально полноценный эмбрион на стадии бластоцисты и нормальное взаимодействие антигенов материнской и эмбриональной ткани. Регуляция взаимодействия между клетками эндометрия и трофобласта осуществляется с участием интерлейкина-1, интерлейкина-8, лептина и других звеньев иммунной системы [11].

По мнению ряда авторов, изменение состава и количества иммунокомпетентных клеток может приводить к нарушению процессов имплантации эмбриона в эндометрий [1, 7]. Однако имеющиеся данные неоднозначны, что делает актуальным проведение исследования состояния иммунокомпетентных клеток эндометрия на протяжении менструального цикла у женщин с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом.

Материал и методы исследования

В исследование включено 300 пациенток с регулярным 28-днев- ным овуляторным менструальным циклом, страдающих бесплодием. Всем была выполнена лапароскопия и биопсия эндометрия. В соответствии с задачами исследования, все пациентки были разделены на 2 группы.

Основную группу составили 150 пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом I-IV степени распространения (согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности, r-AFS, 1996) [13] при проходимых маточных трубах.

Во II группу (контрольную) вошли 150 пациенток, страдающих бесплодием, обусловленным спаечным процессом в малом тазу (при непроходимых маточных трубах).

Средний возраст пациенток 31,1±3,2 лет (при колебаниях от 18 до 42 лет). Продолжительность периода бесплодия 4,6±1,9 лет (при колебаниях от 1 до 15 лет).

 

Таблица.Используемые моноклональные антитела

Название	Предназначено (CD)	Специфичность в отношении антигенов	Распределение маркированных антигенов	Разведение
Anti-Leu4	CD3	Молекулярный вес (МВ) 22-28 кД. Поверхностные антигены	Т-лимфоциты. Пан-Т-маркер	1:200
Anti-Leu3a	CD4	МВ 55 кД. Поверхностные антигены	Т4-хелперы/индукторы (моноциты, макрофаги)	1:400
Anti-Leu2a	CD8	МВ 32 кД. МВ 43 кД. Поверхностные антигены	Т8 - цитотоксические/супрес- сорные лимфоциты	1:400
Anti-Leu7 (HNK-1)	—	МВ 110 кД	Натуральные киллеры (НК); Подгруппа Т-лимфоцитов	1:50
Anti-Human B-cell Клон To 15	CD22	МВ 130 кД	В-лимфоциты. Пан-В-маркер	1:100

 

Лапароскопия и биопсия эндометрия была проведена с 5 по 28 день менструального цикла. В каждый из дней указанного периода оперировано 5-7 пациенток. Полученные образцы ткани эндометрия сохраняли при температуре —800°С до микроскопического исследования.

Соответствие каждого образца эндометрия определенному дню менструального цикла устанавливали с помощью вычисления относительно даты первого дня последней менструации и гистологического исследования биоптатов эндометрия по методу Dallenbach-Hellwer (1981) [2].

Для проведения иммунохимического исследования были приготовлены микропрепараты образцов эндометрия. Идентификация CD3-, CD4- и СD8-позитивных лимфоцитов, натуральных киллеров и В-лимфоцитов была проведена с использованием панели из 5 моноклональных антител: Anti-Leu4, Anti-Leu3a, Anti-Leu2a, Anti-Leu7, Anti-Human-B-cell (таблица). Эти антитела, специфически связываясь с лимфоидными клетками, окрашивают их в коричневый цвет, что позволяет отличить их при световой микроскопии.

Анализ и оценка препаратов осуществлялись с помощью световой микроскопии. В каждом срезе проводили подсчет абсолютного числа клеток, меченных соответствующими антителами.

Статистический анализ результатов проводился с применением критерия Стьюдента.

Результаты исследования

Динамика распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии в течение менструального цикла.

1   Распределение Т-лимфоцитов

1.1  СDЗ-позитивные Т-лимфоциты

СDЗ-антиген содержится на мембранах Т-лимфоцитов и позволяет определить их количество среди всех лимфоцитов. У пациенток с эндометриозом начальный уровень СDЗ-позитивных Т-клеток составлял 240 в 1 мм² на 5-й день цикла, достигал 290 в 1 мм² к 7 дню цикла (р>0,05) и снижался до 180 в 1 мм² к 12 дню цикла, далее варьируясь в пределах 100—150 клеток в 1 мм² до конца цикла.

В контрольной группе число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов в ранней пролиферативной фазе колебалось с 420 клеток в 1 мм² на 5-й день менструального цикла до 570 в 1 мм² на 6-й день (р>0,05). После 6 дня цикла их количество снижалось до 180 в 1 мм² к 12 дню. Далее число СDЗ-позитивных Т-лимфоцитов варьировалось в пределах 100-150 клеток в 1 мм².

Сравнение динамики изменения уровня CD3-пoзитивных Т-лимфоцитов у женщин с эндометриозом и в контрольной группе не выявило существенных различий на протяжении менструального цикла (р>0,05).

1.2  Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD 4)

Т-лимфоциты хелперы/индукторы (CD4-no- зитивные Т-лимфоциты), участвуют в начальном этапе иммунного ответа. Они распознают чужеродные антигены и передают информацию о них В-лимфоцитам, которые, в свою очередь, вырабатывают специфические антитела.

У пациенток с эндометриозом число CD4-пoзитивных Т-лимфоцитов было максимальным между 5 и 6 днем менструального цикла и составляло 110-120 в 1 мм². Далее к 13-му дню менструального цикла их количество стремительно снижалось до 30 клеток в 1 мм². После незначительного повышения на 16-й день, происходило медленное снижение до 20 клеток в 1 мм², вплоть до конца менструального цикла.

В контрольной группе на протяжении всего менструального цикла динамика изменения уровня СD4-позитивных лимфоцитов соответствовала изменениям в группе больных эндометриозом (р>0,05).

1.3  Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8)

Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8-позитивные лимфоциты) играют противоположную Т-хелперам функцию в гуморальном иммунитете (угнетают систему гуморального иммунитета). Они принимают участие в формировании естественной или индуцированной антигеном иммунологической толерантности. Важная роль принадлежит этим клеткам в процессах угнетения естественного иммунного ответа на нидацию оплодотворенной яйцеклетки, которая на начальном этапе воспринимается иммунной системой как чужеродный антигенный объект. При нарушении функции Т-супрессорного звена иммунитета в подавляющем большинстве случаев происходит отторжение эмбриона на самых ранних этапах имплантации.

Максимальный уровень CD8-позитивных Т-лимфоцитов у пациенток с эндометриозом был на 5-8-й день менструального цикла и составлял 125 клеток в 1 мм². Начиная с 9-го дня их число быстро снижалось, достигая уровня 48 клеток в 1 мм² к 14-му дню менструального цикла. После 14-го дня их количество было относительно постоянным вплоть до конца менструального цикла (р>0,05).

В контрольной группе изменение количества CD8-позитивных лимфоцитов в 1 мм² соответствовало характеру изменений в группе больных эндометриозом. Различия были статистически недостоверны (р>0,05).

1.4  Натуральные киллеры (Leu7)

Натуральные киллеры (Lеu7-позитивные клетки) — большие гранулярные клетки, содержащие белок перфорин, который, проникая в цитоплазму клетки-мишени, вызывает осмотический взрыв и лизис. Натуральные киллеры осуществляют важную функцию иммунной системы — сохранение генетического гомеостаза организма путем киллинга клеток, несущих генетическую неоднородность.

У пациенток с эндометриозом число Leu7-пoзитивных клеток было постоянным на протяжении всего менструального цикла (около 4 в 1 мм²).

В контрольной группе Lеu7-позитивные клетки на протяжении всего менструального цикла встречались редко, были слабо окрашены и не имели четкой локализации. Эти клетки располагались в строме эндометрия и среди скоплений лимфоцитов, а в некоторых препаратах отсутствовали. Максимальное число этих клеток (20 в 1 мм² ) зафиксировано на 5-й день менструального цикла. На 8-й день их количество снижалось до 3—4 в 1 мм², оставаясь стабильным на протяжении всех последующих дней менструального цикла.

Статистически достоверных отличий от контрольной группы не выявлено (р>0,05).

2    Распределение В-лимфоцитов (CD22)

В-лимфоциты отвечают на антигенное раздражение синтезом антител, связывающих эти антигены. Конечной фазой этой реакции является уничтожение чужеродных антигенов.

Этот класс лимфоцитов был обнаружен в скоплениях лимфоцитов. Подобная микроскопическая картина наблюдалась в обеих группах обследованных.

В эндометрии пациенток, страдающих эндометриозом, максимальный уровень СD22-позитивных клеток зарегистрирован на 5-8-й день менструального цикла (40 клеток в 1 мм²). К концу пролиферативной фазы, на 11-й день менструального цикла, количество этих клеток снижалось до 20 в 1 мм², впоследствии их число колебалось от 10 до 25 клеток в 1 мм² с пиковым значением на 13-й день менструального цикла.

Количественная динамика СD22-позитивных В-лимфоцитов у пациенток со спаечным процессом в малом тазу: на 6-8-й день менструального цикла достигался максимум со средним числом 50 клеток в мм². После 9-го дня менструального цикла их число стремительно снижалось и между 11 и 23 днями составляло 12 СD22-позитивных клеток в 1 мм². Между 23 и 26 днями их число возрастало до 30 в 1 мм², затем снова снижалось к концу менструального цикла.

В обеих обследованных группах пациенток существенных различий не отмечалось (р>0,05).

3   Распределение макрофагов

Макрофаги выполняют функцию разрушения и переваривания поврежденных, дефектных, состарившихся клеток организма, а также чужеродных клеточных агентов.

Встречаемость и распределение макрофагов в эндометрии на протяжении менструального цикла были одинаковыми у пациенток обеих групп. Количественные изменения клеток были незначительны (р>0,05).

В начале менструального цикла среднее число макрофагов варьировалось в пределах 150-200 клеток в 1 мм², затем к 11-му дню менструального цикла медленно снижалось до 100±10 клеток. С 11-го по 21-й день количество макрофагов оставалось стабильным, а начиная с 22-го дня менструального цикла, их число возрастало, достигая уровня фазы ранней пролиферации.

4   Агрегации лимфоцитов

Агрегации лимфоцитов встречались на протяжении всего менструального цикла в эндометрии пациенток обеих групп. В группе пациенток с эндометриозом агрегация лимфоцитов наблюдалась в фолликулярную фазу в 27% образцов и в 6% образцов в лютеиновую фазу. В контрольной группе агрегация лимфоцитов наблюдалась в 22% образцов в фолликулярную фазу цикла и в 10% образцов в лютеиновую фазу цикла. Не было различий структуры скоплений лимфоцитов у пациенток обеих обследованных групп. Скопления лимфоцитов состояли из сотен клеток, расположенных в основном в функциональном слое. Небольшие группы лимфоцитов присутствовали вокруг желез.

Центральные поля крупных скоплений состояли преимущественно из В-лимфоцитов. Т-лимфоциты локализовались в основном в краевых зонах этих полей.

Макрофаги были представлены по краям, и лишь изредка — внутри скоплений лимфоцитов.

Обсуждение

1. Т-лимфоциты. Различные подгруппы Т-лимфоцитов обнаруживались как в виде отдельных клеток, так и в виде интра- и субэпителиальных клеточных агрегатов в эндометрии в течение всего менструального цикла. Количество и распределение этих клеток в течение менструального цикла не различаются у пациенток с эндометриозом и пациенток контрольной группы.

Наибольшее количество клеток было обнаружено с помощью маркера anti-Leu 4 (CD3). Установлено, что динамика распределения клеток различных подгрупп схожа и имеет 2 максимума: в раннюю пролиферативную фазу и в конце секреторной фазы, без выраженных изменений в промежутке. Среднее количество различных Т-лимфоцитов имело колебания, не превышающее±10 клеток в 1 мм² во вторую фазу цикла. При этом высокая концентрация Т-лимфоцитов в начале менструального цикла может быть объяснена анатомическими особенностями: толщина функционального слоя эндометрия в эту фазу составляет от 0,5 до 4 мм. Следовательно, в начале пролиферативной фазы менструального цикла биопсия может быть взята из более глубоких слоев эндометрия с наибольшей плотностью клеток. Соотношение CD4:CD8 — «индекс иммунорегуляции» — является показателем гармоничного функционирования иммунной системы и в норме составляет 1:2. В раннюю пролиферативную фазу соотношение CD4:CD8 составило 1:1. В дальнейшем количество СD4-позитивных клеток снижалось, в то время как уровень CD8-позитивных клеток оставался относительно стабильным. К концу менструального цикла мы наблюдали преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов, при этом соотношение CD4:CD8 колебалось от 1:2 до 1:4. Подобная картина наблюдалась в эндометрии больных обеих групп. Полученные данные совпадают с результатами проведенных ранее исследований [5, 14]. Преобладание CD8-позитивных Т-лимфоцитов в тканях, чувствительных к эстрогенам, может быть объяснено тем, что эти клетки имеют рецепторы эстрогенов, тогда как у СD4-позитивных лимфоцитов эти рецепторы отсутствуют [12].

2. Натуральные киллеры в небольшом количестве присутствовали в эндометрии в течение всего менструального цикла. Мы не обнаружили разницы в количестве и распределении этих клеток у женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой. Lydyard и Grossi в работе по изучению иммунологических возможностей натуральных киллеров доказали присутствие небольшого количества этих клеток в эндометрии. Кроме того, их количество подвергалось циклическим изменениям [8]. Аналогичные результаты относительно эндометрия здоровых женщин были описаны Kamat и Isaacson (1987), King et al. (1988) [5, 6].
3. В-лимфоциты. В эндометрии обследованных пациенток найдено небольшое количество В-лимфоцитов. В некоторых скоплениях лимфоцитов обнаружены поля, состоящие исключительно из В-лимфоцитов. Эти находки совпадают с результатами исследований эндометрия здоровых женщин [5, 10].
4. Макрофаги. Макрофаги присутствовали в эндометрии женщин с эндометриозом и в контрольной группе в сходных количествах на протяжении всего менструального цикла. Средний уровень макрофагов был высоким в начале и в конце менструального цикла, а в середине цикла имел тенденцию к снижению. Макрофаги были равномерно распределены в строме эндометрия, и лишь изредка встречались интра- и субэпителиально. Однако роль макрофагов эндометрия при эндометриозе и связанном с ним бесплодии остается не ясной. В настоящее время некоторые исследователи сообщают о повышении уровня и активности макрофагов в перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом [3, 4, 9, 15]. Другие авторы указывают на повышение количества макрофагов в секреторную фазу [8].
5. Скопления лимфоцитов. В эндометрии пациенток обеих групп обнаруживались скопления лимфоцитов на протяжении всего менструального цикла. Выявлена циклическая зависимость в распределении этих скоплений. В контрольной группе они были обнаружены в 22% образцов материала в пролиферативную фазу и в 10% образцов в секреторную фазу. В группе пациенток с эндометриозом скопления лимфоцитов обнаруживались в 27 и 6% образцов материала соответственно. Скопления лимфоцитов располагались главным образом в нижней части функционального и базальном слое эндометрия и состояли из В-лимфоцитов в центральной зоне и Т-лимфоцитов по периферии скоплений. Подобные данные относительно распределения и состава скоплений лимфоцитов имеются в литературе, однако эти исследования базируются на малом числе наблюдений, и в них отсутствует подбор пациенток по возрасту [5, 10, 14].

Заключение

Анализируя данные, полученные при изучении динамики распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии пациенток с эндометриозом и со спаечным процессом в малом тазу на протяжении менструального цикла, можно сделать следующие выводы:

1. Количество и распределение Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, скоплений лимфоцитов подвержены циклическим изменениям, что, по нашему мнению, может свидетельствовать о тесной взаимосвязи функции яичников и локальной функции иммунокомпетентных клеток, и подтверждает характеристику эндометрия как слизисто-лимфатической ткани.
2. Отсутствие различий в количественных и качественных показателях динамики распределения иммунокомпетентных клеток эндометрия (различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, макрофагов) в зависимости от фаз менструального цикла у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе в сравнении с контрольной группой (бесплодие при непроходимых маточных трубах вследствие спаечного процесса развившегося после перенесенных воспалительных заболеваний органов малого таза) свидетельствует о сохранении нормальной функции эндометрия у пациенток с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе.

About the authors

V. I. Kulakov

Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

N. I. Volkov

Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

J. V. Bespalova

Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files