The role of metastin in pathogenesis of genital endometriosis

Full Text

Генитальный эндометриоз является широко распространенным заболеванием, особенно у пациенток репродуктивного возраста. Известно, что наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) имеет много сходных черт с опухолевым процессом, характеризуется избыточной пролиферацией, неоангиогенезом, сниженным апоптозом, обладает способностью к инфильтрирующему росту с проникновением в окружающие ткани, деструкцией последних и даже возможностью метастазирования [1].

О кисспептине (метастине) стало известно в 1996 г. как о гене, супрессирующем метастазирование меланомы [2]. Экспрессия кисспептина отсутствует или незначительна при метастазирующей меланоме в сравнении с неметастазирующими вариантами. Подобное действие объясняется индукцией апоптоза в опухолевых клетках [3]. Также экспрессия гена KISS1 подавляет активность матриксных металлопротеиназ [4–6], что может рассматриваться как один из механизмов подавления метастазов опухолей. Определение кисспептина и его рецептора GPR-54 при проведении иммуногистохимических (ИГХ) исследований биопсийных образцов опухолей помогает прогнозировать положительный исход заболевания раком яичников у женщин [7]. L. Yu et al. (2017) при ИГХ-исследовании образцов ткани эпителиального рака яичников установили, что уровень экспрессии KISS1 был значительно ниже, чем при доброкачественных заболеваниях яичников [8]. Однако в другой работе оценивались ИГХ-методом экспрессия и корреляция белка KISS1 в первичных эпителиальных опухолях яичников [9]. Экспрессия белка метастина при первичных эпителиальных опухолях яичников была значительно выше, чем при аденоме яичника и в нормальных тканях [9]. Экспрессия метастина в пограничных опухолях яичников также была значительно выше, чем в неизмененных тканях [9]. Отмечено, что экспрессия метастина при раке яичников достоверно коррелировала с метастазами в соседние органы, однако экспрессия метастина (кисспептина) не коррелировала с различными гистологическими вариантами опухоли и степенью дифференцировки и стадией распространенности по FIGO [9]. При карциноме эндометрия была обнаружена более низкая экспрессия мРНК KISS1. Была отмечена корреляции экспрессии мРНК KISS1 у больных с карциномой эндометрия с клинической стадией, метастазированием в миометрий и метастазами в лимфатические узлы. При изучении экспрессии мРНК рецептора KISS1 (KISS1R) данные корреляционные зависимости установлены не были [10].

Цель исследования — изучить роль метастина (кисспептина) в патогенезе наружного генитального эндометриоза.

Материалы и методы

В исследование вошли 28 больных с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) I–II степеней распространенности по пересмотренной классификации R-AFS и 11 здоровых женщин, составивших контрольную группу. Диагноз у всех больных был установлен на основании лапароскопии и подтвержден результатами гистологического исследования. НГЭ I степени наблюдался у 42,9 % (12) больных, II степени — у 57,1 % (16) пациенток. Контрольную группу составили пациентки, у которых при лапароскопическом обследовании не было найдено гинекологической патологии. Средний возраст пациенток с НГЭ составил 32,5 ± 5,5 года, в контрольной группе — 34,1 ± 4,9 года. У всех больных с НГЭ наблюдалось бесплодие, соотношение первичного бесплодия к вторичному составило 1 : 1. Гормональное обследование выполнялось на 2-й и 8-й дни менструального цикла и включало определение в сыворотке крови уровня метастина (кисспептина), ФСГ, ЛГ, АМГ, пролактина, эстрадиола, эстрона, андрогенов (свободного тестостерона, дегидроэпиандростерона сульфата). Пролактин, ФСГ, ЛГ, общий тестостерон, ДЭА-сульфат определяли при помощи тест-систем «Алкор-био» (Россия); эстрадиол, андростендион, свободный тестостерон, эстрон, 17-OHP определяли при помощи тест-систем DRG Diagnostic (Германия); АМГ — с использованием тест-системы Beckman Coulter (США). Для определения метастина в периферической крови образцы крови собирались на 2-й и 8-й дни менструального цикла с дальнейшим замораживанием образца до –70 °С. Определение концентрации кисспептина в сыворотке крови у пациенток осуществлялась с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Всем пациенткам было проведено гистологическое исследование биоптатов эндометрия, взятых на 18–22-й дни менструального цикла, ткани яичника, интактной брюшины в группе контроля, у больных НГЭ — эндометриоидных гетеротопий, которые располагались на брюшине малого таза. Иммуногистохимическое исследование проведено в вышеперечисленных образцах тканей. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования были выполнены по стандартной методике с обзорной окраской гематоксилином и эозином. Для исследования рецепторов кисспептина использовали первичные моноклональные мышиные антитела к KISS [клон ab 55384] производства Abcam в стандартном разведении 1 : 100; для изучения его рецептора KISS1R [клон ab 140839] использовали поликлональные кроличьи антитела производства Abcam в стандартном разведении 1 : 200. Оценку результатов иммуногистохимического окрашивания проводили методом морфометрии с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus, цифровой камеры Olympus-BX46 и программного обеспечения СellSens Entry. Дальнейшее количественное исследование осуществляли с помощью программы компьютерного анализа изображений Морфология 5.0 (ВидеоТест, Россия).

Результаты исследования и их обсуждение

В настоящее время в литературе отсутствуют исследования, посвященные изучению уровня метастина (кисспептина) в периферической крови больных НГЭ.

Согласно результатам нашего исследования уровень кисспептина в сыворотке крови у больных с НГЭ на 2-й день менструального цикла был достоверно выше (1,2 ± 0,04 нг/мл) по сравнению с показателями в контрольной группе (0,57 ± 0,03 нг/мл; p < 0,01), при этом уровень АМГ был достоверно ниже (1,74 ± 0,64 нг/мл) по сравнению с уровнем в группе контроля (5,74 ± 2,07 нг/мл; p < 0,05). Отмечено достоверное повышение уровня эстрадиола (276,33 ± 41,46 пмоль/л) при эндометриозе по сравнению со значениями в контрольной группе (169,80 ± 36,87 пмоль/л; p < 0,01). Содержание ФСГ и ЛГ у пациенток с эндометриозом не имело достоверных отличий от значений в группе контроля. Установлена отрицательная корреляционная связь между уровнем ФСГ и эстрадиола в периферической крови у больных НГЭ (коэффициент корреляции Спирмена rs = –0,72). Наблюдалась тенденция к повышению уровня эстрона у больных НГЭ (252,39 ± 19,82 пмоль/л) по сравнению с показателями в контрольной группе (227,14 ± 24,15 пмоль/л), а также уровня пролактина (293,75 ± 30,21 мМЕ/л) по сравнению с уровнем в группе контроля (235,08 ± 71,38 мМЕ/л). Отмечена прямая корреляционная зависимость между уровнем эстрадиола у больных НГЭ в сыворотке крови с уровнем эстрона (rs = 0,69). Значения свободного тестостерона (2,36 ± 0,74 пмоль/л) и ДГЭА-С (6,50 ± 1,20 мкмоль/л) в периферической крови у больных НГЭ не имели значимых отличий от показателей в группе контроля (2,15 ± 0,33 и 5,73 ± 1,27 мкмоль/л соответственно).

Ароматазная активность у больных НГЭ, рассчитанная по формуле ΔЕ2/АМГ, была достоверно выше (61,21 ± 17,39) по сравнению со значениями в группе контроля (34,96 ± 16,08; p < 0,01).

Уровень кисспептина (метастина) у больных НГЭ на 8-й день менструального цикла в периферической крови был достоверно выше (0,87 ± 0,05 нг/мл) по сравнению с уровнем в контрольной группе (0,52 ± 0,04 нг/мл; p < 0,01), однако отмечено его снижение относительно уровня на 2-й день менструального цикла. У больных НГЭ уровень АМГ был достоверно ниже (2,03 ± 0,75 нг/мл) по сравнению со значениями в группе контроля (7,54 ± 2,59 нг/мл; p < 0,05), при этом выявлена тенденция к повышению относительно уровня на 2-й день менструального цикла. Отмечено достоверное повышение уровня эстрадиола (361,31 ± 52,09 пмоль/л) при эндометриозе по сравнению с уровнем в контрольной группе (291,80 ± 71,36 пмоль/л; p < 0,01). Содержание ФСГ и ЛГ в сыворотке крови у пациенток с эндометриозом достоверно ниже (5,76 ± 0,45 МЕ/л; 5,77 ± 0,55 МЕ/л) по сравнению с показателями в группе контроля (7,14 ± 0,78 МЕ/л; 6,47 ± 0,54 МЕ/л; p < 0,05). Наблюдалась тенденция к повышению уровня эстрона у больных НГЭ (339,26 ± 19,84 пмоль/л) по сравнению с уровнем в контрольной группе (275,53 ± 43,38 пмоль/л; p < 0,01). Уровень пролактина (238,03 ± 31,72 мМЕ/л) у больных эндометриозом также имел тенденцию к повышению по сравнению с группой контроля (177,58 ± 28,60 мМЕ/л). Отмечена прямая корреляционная зависимость между уровнем эстрадиола у больных НГЭ в сыворотке крови с уровнем эстрона (rs = 0,69). Содержание свободного тестостерона (2,00 ± 0,63 пмоль/л) в периферической крови у больных НГЭ не имело значимых отличий от показателей в группе контроля (2,32 ± 0,73 пмоль/л).

Ароматазная активность у больных НГЭ на 8-й день менструального цикла была достоверно выше (57,27 ± 17,00) по сравнению с группой контроля (25,74 ± 10,39; p < 0,01). Выявлены отрицательные корреляционные связи между уровнем АМГ на 8-й день менструального цикла в периферической крови и уровнем ароматазной активности на 2-й и 8-й дни менструального цикла в сыворотке крови (rs = –0,57 и rs = –0,68 соответственно). Отмечена прямая корреляционная зависимость между уровнем эстрадиола на 8-й день менструального цикла в сыворотке крови с уровнем ароматазной активности на 8-й день менструального цикла в периферической крови (rs = 0,60).

Результаты гистологического исследования биоптатов эндометрия у 28 больных НГЭ показали, что у 17,9 % (5) пациенток эндометрий соответствовал ранней стадии фазы секреции, у 50,0 % (14) пациенток — средней стадии фазы секреции и у 28,6 % (8) пациенток отмечалась слабовыраженная секреторная трансформация эндометрия с отставанием в развитии стромального компонента, в 3,6 % (1) случаев была верифицирована гиперплазия эндометрия.

В контрольной группе у 27,3 % (3) пациенток эндометрий соответствовал ранней стадии фазы секреции, у 54,5 % (6) женщин — средней стадии фазы секреции, слабовыраженная секреторная трансформация эндометрия была отмечена у 18,2 % (2) пациенток.

В группе больных НГЭ очаги эндометриоидных гетеротопий были подтверждены гистологически во всех исследуемых образцах. В 7,1 % (2) случаев было выявлено наличие большого числа желез как округлой, так и неправильной формы, с эпителием пролиферативного типа и умеренным количеством цитогенной стромы, представленной веретенообразными фибропластическими клетками (рис. 1). В 64,3 % (18) случаев очаг эндометриоидной гетеротопии был представлен умеренным количеством эндометриальных желез со скудным количеством стромы, и в 28,6 % (8) случаев исследования стромальный компонент отсутствовал.

 

Рис. 1. Эндометриоидные железы и строма в очаге эндометриоидной гетеротопии. Окраска гематоксилином и эозином, ×40

 

Воспалительная инфильтрация продуктивного характера присутствовала только в 21,4 % (6) случаев и характеризовалась умеренной степенью выраженности с наличием моноцитов в очаге воспаления.

Сосудистый компонент эндометриоидных гетеротопий был представлен преимущественно венозно-капиллярным типом и характеризовался слабой степенью выраженности в 35,7 % (10) случаев, в одном из которых выявлялись очаги кальцификации, и в одном случае был представлен артериовенозным типом сосудистого компонента. В 64,3 % (18) исследуемых образцов определялся капиллярно-венозный тип васкуляризации с умеренной степенью выраженности, в 3 случаях — с очагами кровоизлияний (рис. 2).

 

Рис. 2. Очаги эндометриоидных гетеротопий на брюшине: a — очаг эндометриоидной гетеротопии с участками отложения солей кальция; b — жировая ткань с умеренным кровенаполнением сосудистого русла и очагами кровоизлияний. Окраска гематоксилином и эозином, ×100

 

В контрольной группе при гистологическом исследовании брюшины выявлены фрагменты мышечно-жировой ткани со слабо выраженной степенью васкуляризации в 72,7 % (8) случаев и умеренной степенью васкуляризации в 27,3 % (3) случаев.

Было исследовано 28 биоптатов яичника у больных с эндометриозом, из них в 7,1 % (2) случаев выявлялся слабовыраженный склероз белочной оболочки с наличием в 1 образце фолликулярной кисты яичника, в 53,6 % (15) случаев были диагностированы кисты яичников, представленные фолликулярными кистами, кистами неовулировавших фолликулов и их сочетаниями, кистой неполноценного желтого тела и в одном случае эндометриоидной кистой яичника диаметром 0,5 см. В 14,3 % (4) представленных образцов были выявлены атретические фолликулы. Патологических изменений в биоптатах яичника не было обнаружено в 25 % (7) случаев.

Биоптаты яичников контрольной группы исследования (11 больных) представлены корковой зоной с первичными фолликулами. В двух исследуемых образцах были выявлены неовулировавший фолликул и формирующаяся фолликулярная киста, в девяти случаях в корковой зоне определялись атретические фолликулы.

Результаты иммуногистохимического исследования биоптатов эндометрия показали, что у пациенток с НГЭ площадь экспрессии КISS была достоверно ниже при сопоставлении с показателями группы контроля (p < 0,05), что не противоречит результатам других исследователей [11]. Данные представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Относительная площадь экспрессии белка KISS и KISS1R у больных наружным генитальным эндометриозом и в группе контроля

Table 1. Relative expression area of KISS and KISS1R protein in EGE patients and in control group

Маркер	Группа больных эндометриозом			Контрольная группа
Локализа-ция	биоптаты эндометрия	эндометрио-идные гетеротопии	биоптаты яичников	биоптаты эндометрия	интактная брюшина	биоптаты яичников
	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m
KISS1	28,5 ± 2,79*	33,6 ± 5,21α	26,7 ± 7,4	41,7 ± 4,0	9,5 ± 3,24	17,9 ± 4,1
KISS1R	30,7 ± 1,6*	43,7 ± 2,5 α α α	28,2 ± 6,4	36,7 ± 2,2	11,8 ± 2,7	17,3 ± 7,1
*p < 0,05, αp < 0,05, **p < 0,01, α α αp < 0,001 при сравнении с группой контроля; *p < 0.05, αp < 0.05, **p < 0,01, α α αp < 0.001 when compared with control group

 

Оптическая плотность экспрессии исследуемого маркера в эндометрии статистически значимо не отличалась. Аналогичная картина отмечалась при оценке экспрессии рецептора KISS1R в эндометрии (р < 0,05).

Выявлена прямая корреляционная зависимость между площадью экспрессии белка (KISS) в эндометрии и уровнем кисспептина на 8-й день менструального цикла в периферической крови (rs = 0,90). В очагах эндометриоидных гетеротопий на брюшине экспрессия белка KISS и рецептора KISS1R составила 33,6 ± 5,21 и 43,7 ± 2,5 соответственно. Определено, что уровень кисс пептина на 2-й день менструального цикла в периферической крови коррелирует с площадью экспрессии рецептора KISS1R в брюшине (rs = 0,57). Отмечается прямая корреляционная зависимость между площадью экспрессии рецептора KISS1R в интактной брюшине с уровнем кисспептина на 8-й день менструального цикла в сыворотке крови (rs = 0,90). Оптическая плотность экспрессии рецептора KISS1R у больных НГЭ достоверно не отличалась от показателей контрольной группы (0,16 ± 0,01 и 0,16 ± 0,04 соответственно). На рис. 3 представлена экспрессия KISS и KISS1R в эндометрии.

 

Рис. 3. Экспрессия кисспептина и его рецептора в эутопическом эндометрии: a — экспрессия KISS; b — KISS1R. Иммуногистохимическое исследование. ×400

 

При сравнении площади экспрессии белка КISS1 в эндометриоидных гетеротопиях (рис. 4, а) в секреторную фазу менструального цикла была отмечена тенденция к его повышению по сравнению с экспрессией в эндометрии у больных НГЭ — 33,6 ± 5,21 и 28,5 ± 2,79 соответственно, а также в очагах эндометриоидных гетеротопий на брюшине отмечалось достоверное повышение экспрессии белка КISS1 по сравнению с фрагментами интактной брюшины (р < 0,01). При этом отмечено, что площадь экспрессии рецептора KISS1R в эндометриоидных гетеротопиях (рис. 4, b) достоверно превышала площадь экспрессии как в интактной брюшине, так и в эндометрии больных НГЭ и в эндометрии женщин контрольной группы. Оптическая плотность экспрессии в обеих группах была одинакова и составила 0,16 ± 0,01 и 0,15 ± 0,04 соответственно.

 

Рис. 4. Экспрессия кисспептина и его рецептора в эндометриоидных гетеротопиях: а — экспрессия KISS; b — KISS1R. Иммуногистохимическое исследование. ×400

 

В биоптатах яичников у пациенток с НГЭ площадь экспрессии KISS достоверно выше по сравнению с контрольной группой (р < 0,05) (рис. 5, а). Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем кисспептина в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла с площадью белка (KISS) в яичнике (rs = 0,53). Оптическая плотность в группе больных с НГЭ имела тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой (рис. 5, b). При оценке площади экспрессии и оптической плотности экспрессии рецептора KISS1R была отмечена тенденция к его повышению по сравнению с контрольной группой.

 

Рис. 5. Экспрессия кисспептина и его рецептора в биоптатах яичника: а — экспрессия KISS; b — KISS1R. Иммуногистохимическое исследование. ×400

 

Литературные данные, посвященные изучению экспрессии кисспептина и его рецептора при наружном генитальном эндометриозе, также немногочисленны и противоречивы [11, 12]. А. Makri et al. изучали экспрессию кисспептина и его рецептора у больныx НГЭ в эутопическом эндометрии и в эндометриоидных гетеротопиях как в пролиферативную, так и в секреторную фазу менструального цикла [12]. В эндометрии у здоровых женщин, а также в эндометриоидных гетеротопиях не было выявлено экспрессии кисспептина и его рецептора [12]. При исследовании 24 образцов эутопического эндометрия у 10 женщин с эндометриозом определена экспрессия рецептора KISSIR [12]. У всех пациенток был установлен диагноз «Наружный генитальный эндометриоз III–IV степеней» [12].

A. Timologou et al. в 2016 г. провели изучение эндометриоидных гетеротопий и эндометрия у 38 пациенток с наружным генитальным эндометриозом и у 29 женщин без эндометриоза, подвергшихся лапароскопии в пролиферативную фазу менструального цикла [13]. Диагноз эндометриоза (или отсутствие заболевания) был установлен на основании результатов гистологического исследования. Экспрессию белков KISS1 и KAI1 (супрессор метастазирования опухоли) анализировали иммуногистохимическим методом. Было определено, что экспрессия KAI1 в эндометрии у больных с эндометриозом была достоверно снижена по сравнению с уровнем экспрессии у пациенток контрольной группы [13]. Экспрессия KISS1 в железистом компоненте эндометриоидной гетеротопии была значительно повышена по сравнению с экспрессией в эндометрии у больных как с эндометриозом, так и в эндометрии пациенток контрольной группы [13], что не противоречит полученным данным в секреторную фазу менструального цикла. Была также обнаружена повышенная экспрессия KISS1 при аденомиозе по сравнению с эутопическим железистым эндометрием пациенток с аденомиозом, а также с эндометрием контрольной группы [14], что является перспективным для рассмотрения экспрессии KISS1 в качестве маркера для ранней и малоинвазивной диагностики аденомиоза.

Экспрессия рецептора KISS1R, согласно результатам наших исследований, также была достоверно повышена в эндометриоидных гетеротопиях по сравнению с интактной брюшиной, а также эутопическим эндометрием больных НГЭ и эндометрием пациенток группы контроля, что указывает на большое значение метастина (кисспептина) и его рецептора в патогенезе генитального эндометриоза.

Выводы

Таким образом, полученные данные показывают несомненную роль кисспептина в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Можно предположить, что повышение уровня метастина (кисспептина) в периферической крови, а также увеличение экспрессии в эндометриоидных гетеротопиях KISS1, и особенно его рецептора KISS1R, являются компенсаторно-приспособительной реакцией, направленной на «сдерживание» дальнейшего распространения эндометриоза. Полученные результаты обосновывают необходимость продолжения исследований в данном направлении для углубленного понимания патогенеза вышеуказанного заболевания и возможного применения метастина в качестве биомаркера для неинвазивной диагностики, а также потенциальной таргетной терапии НГЭ.

About the authors

Edvard K. Aylamazyan

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Author for correspondence.
Email: iagmail@ott.ru

chief, academician, professor

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Mariya I. Yarmolinskaya

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com

professor of Russian Academy of Sciences, leading research assistant of department of endocrinology of reproduction, Doctor of medical sciences, head of center “Diagnostics and treatment of endometriosis”

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Nigar F. Ganbarli

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: n-ganbarli@mail.ru

3rd year post-graduate student of Surgical Gynecology Department

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Natalia N. Tkachenko

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: liberin@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Head of the hormonal laboratory

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Gulrukhsor Kh. Tolibova

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: gulyatolibova@mail.ru

PhD, MD

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Tatyana G. Tral

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: TTG2008@bk.ru

PhD, MD, Pathologist, Head of Pathologist Laboratory, Department of Pathomorphology

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Viktor V. Rulev

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: vrulev@mail.ru

Candidate of medical sciences, Researcher Endocrinology of Reproduction department

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Anna A. Tsipurdeeva

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: tsypurdeeva@mail.ru

MD, Head of Department of Operative Gynecology

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

References

Supplementary files