Экспрессия белка P63 в аденокарциномах легких как фактор неблагоприятного прогноза

Полный текст

Рак легких (РЛ) – гетерогенная группа злокачественных новообразований легких, которую можно разделить на 2 основные группы – мелкоклеточный рак легких (МКРЛ, менее 15%) и немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ). Самую обширную группу НМКРЛ составляют аденокарциномы (АК), на долю которых приходится 30-40% всех случаев РЛ. В соответствии с классификацией ВОЗ (2015) группа АК включает опухоли различного строения и степени дифференцировки [1]. Данный подтип в большинстве случаев возникает у женщин, некурящих людей и чаще располагается в периферических отделах легких [2, 3].

Морфологический диагноз АК легкого обычно ставится на основании гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином. Однако, в ряде случаев при постановке диагноза возникают определенные сложности. В подобных сложных случаях для уточнения диагноза необходимо иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с использованием спектра специфических для разных типов ткани легкого маркеров (антител), а при подозрении на метастатическое происхождение образования - более широкий набор маркеров. Обычно для подтверждения диагноза большинства АК легкого можно использовать 3-х маркерную панель, которая характеризует иммунофенотип этого типа опухолей – цитокератин 7 (ЦК7), трансформирующий фактор роста TTF-1, инапсин А. При дифференциальной диагностике плоскоклеточного рака легкого (ПКР) можно использовать такие маркеры, как ЦК5/6 (цитокератины, которые обычно интенсивно экспрессируют клетки плоского эпителия), р63 и TTF-1 [4-6]. Однако, иммунофенотип низкодифференцированных вариантов АК и ПКР легкого часто характеризуется экспрессией не свойственных высокодифференцированным вариантам маркеров. Так, в некоторых низкодифференцированных ПКР легких можно обнаружить экспрессию TTF-1 (в 0,9% случаев), и, напротив, р63 иногда экспрессируют популяции клеток АК (по разным данным, в 1/3 случаев АК)[7-9]. Так, A. Warth, et al. (2012) показали, что в 12,1% случаев, верифицированных АК легкого, была выявлена экспрессия р63 [10]. Важно иметь в виду, что число р63-позитивных клеток в АК существенно ниже, чем это характерно для ПКР (где почти 100% ядер опухолевых клеток экспрессируют этот маркер) и обычно имеет очаговое, а не диффузное распределение [10].

В норме экспрессия гена ТР63 выявляется в базальных и супрабазальных клетках плоского эпителия кожи, пищевода, матки, шейки матки, миндалин, мочевого пузыря, бронхов, молочной и предстательной желёз [11]. Этот ген играет важную роль в поддержании популяции полипотентных («стволовых») клеток в этих органах. Следует отметить, что точечные мутации в гене р63 идентифицируются редко, но достаточно часто в различных злокачественных опухолях, в том числе и в опухолях легкого, выявляют амплификацию гена и гиперэкспрессию протеина, который кодируется этим геном [12].

Цель – исследовать спектр клеточных молекулярно-биологических  маркеров и выявить среди них те, которые могут быть использованы в качестве факторов прогноза клинического течения аденокарциномы легких.

Материалы и методы

В настоящей работе был использован архивный материал 129 пациентов с подтвержденным диагнозом АК легкого, которые были обследованы и лечились на базе ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского Минздрава России с января 2014 г. по июль 2018 г. Использование биологического материала в научных целях было одобрено Локальным этическим комитетом.

Операции и диагностические биопсии произведены в торакальном отделении института. Диагноз ставился после гистологического исследования препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, а при необходимости – ИГХ исследования в соответствии с рекомендациями действующей классификации ВОЗ по РЛ [1].

ИГХ исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, срезы толщиной 4-5 мкм наносили на стекла с адгезивным покрытием, затем высушивали при 37ºС в течение ночи и еще 1 час при 60ºС. Дальше срезы подвергались депарафинации и восстановлению антигенности в зависимости от протокола, рекомендованного для каждого конкретного антитела. ИГХ реакция проводилась на операционном материале в автоматическом режиме с использованием автостейнера Ven-tana (Италия), а в диагностических биопсиях при малом объеме материала – на серийных срезах ручным методом. Была использована панель антител: цитокератины (ЦК) широкого спектра (клон АЕ1/АЕ3), ЦК высоких молекулярных весов (клон бета Е12) ЦК7, ЦК5/6, р63, TTF-1, напсин A (Dako, Cell Marque, Ventana).

Для выявления мутаций в гене EGFR в ткани РЛ использовался метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием набора реагентов Therascreen®EGFR RGQ PCR Kit (Qiagen, Голландия) на оборудовании Rotor-Gene Q (Qiagen, Голландия) по протоколу производителя. ДНК выделялось из парафиновых блоков с использованием набора Сobas DNA Sample Preparation Kit.

Категориальные переменные анализировали, используя процентные доли, непрерывные переменные выражали в виде средних значений и стандартных отклонений. Безрецидивную выживаемость анализировали по методу Каплана-Мейера; статистическую значимость различий выживаемости проверяли лог-ранговым критерием. Анализ факторов риска проводили с использованием одномерной регрессии Кокса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Статистические анализы выполняли с помощью программного обеспечения SPSS версии 21.0 (IBM Corporation, США).

Из 129 пациентов с АК легких (93 операционные и 43 диагностические биопсии) было 67 мужчин (52%) и 62 женщины (48%). В возрасте от 40 до 70 лет – 87 пациентов (67,4%), старше 70 лет – 37 пациентов (28,7%), до 40 лет – 5 пациентов (3,9%).

В соответствии с классификацией TNM [13] пациенты с АК 1-й стадии составили 10,1% (13 человек), 2-й стадии – 10,1% (13 человек), 3-й стадии – 17,8% (23 человека) и 4-й стадии – 10,8% (14 человек). У части пациентов стадия TNM отсутствовала. Сводные данные по анализируемой выборке представлены в таблице 1.

Результаты и их обсуждение

В 75 из 129 случаев АК диагностировалась на основание морфологического исследования. В остальных случаях потребовался дополнительный метод – ИГХ, который включал соответствующий локализации опухоли в легком набор органо- и клеточно-специфических маркеров. Обоснование ко-экспрессии в клетках опухоли СК7, TTF-1 и напсина А, и при отсутствии экспрессии СК5/6 и р63 определялась АК легкого. Однако, в ряде случаев наблюдалась экспрессия не характерных для данного подтипа РЛ маркеров (табл. 2). В 96,4% случаев (53 из 55) – в клетках АК наблюдалась экспрессия ЦК7, в 94,9% (50 из 55) – экспрессия TTF-1, в 94,7% (54 из 57) – напсин А, в 34,8% (8 из 23) – СК 5/6, в 47,5% (29 из 32) – р63 (табл. 2 и рис. 1).

 

Таблица 1

Клиническо-демографическая характеристика включенных в анализ пациентов с аденокарциномой легких

Показатели	Число пациентов	%
Пол
мужчины	67	52
женщины	62	48
Возраст
до 40 лет	5	3,9
40-70 лет	87	67,4
старше 70 лет	37	28,7
Стадия АК легких
1 стадия	13	10,1
2 стадия	13	10,1
3 стадия	23	17,8
4 стадия	14	10,8

 

Таблица 2

Экспрессия иммуногистохимических маркеров в клетках аденокарциномы легкого

Маркеры	Положительная экспрессия	Отсутствие экспрессии
СК7	53 (96,4%)	2 (3,6%)
TTF-1	50 (90,9%)	5 (9,1%)
Напсин А	54 (94,7%)	3 (5,3%)
СК5/6	8 (34,8)	15 (65,2)
р63	29 (47,5%)	32 (52,5%)

 

По предварительным данным, полученным в ходе исследования, прогностическое значение имеет экспрессия в клетках АК только одного маркера – р63. И разница между группами по безрецидивной выживаемости (БРВ) составила 2,48±1,11 месяцев, p<0,026. Однако, при увеличении выборки пациентов и времени наблюдения за ними эта тенденция нивелировалась. Тем не менее цитоплазматическую и/или ядерную экспрессию р63 в разной пропорции клеток АК мы наблюдали в 29 случаях (47,5%, рис. 1) и у этих пациентов наблюдалось более агрессивное течение заболевания. Так, у пациентов с АК при экспрессии в клетках опухоли р63 БРВ составляла в среднем 25,7±5,1 месяцев, в то время как у пациентов без экспрессии р63 БРВ составила 26,1±2,8 месяцев. Этот показатель не влиял на общую выживаемость пациентов и в среднем составил 33,6±2,7 месяцев.

В заключение необходимо отметить следующее. Белок р63 кодируется геном ТP63, открытым в 1998 г. и представляющим семейство генов ТР53. Он расположен на хромосоме 3q27-29 и состоит из 15 экзонов. Белок, который кодирует этот ген, имеет высокую степень гомологии с белком р53 в участках трансактивационного, ДНК-связывающего и олигомеризационного доменов, но отличается от него своим С-концевым фрагментом. В отличие от гена ТР53, который кодирует только один белок, хотя и с различными его модификациями, ген ТP63 кодирует сразу несколько белковых продуктов. Матриксная РНК (мРНК) р63 может синтезироваться с двух промоторов (TA и ΔN) и далее подвергаться 3-м альтернативным участкам сплайсинга (a, b и c), которые расположены в карбоксильной концевой области гена. В результате этого с участием гена ТP63 могут продуцироваться 6 изоформ белка р63, как обладающих (ТА-формы), так и не обладающих (ΔN-формы) транс-активирующим доменом (рис. 2) [14, 15]. Изоформа TAp63 активирует ген p53, тем самым останавливая клеточный цикл и запуская апоптоз, а изоформа ΔNp63, напротив, активирует механизм клеточной пролиферации и ингибирует апоптоз [16, 17]. Изоформы ТАр63 могут также активировать другие гены, содержащие близкие по структуре элементы. В частности, эта изоформа опосредованно стимулирует транскрипцию генов белков Jag1 и Jag2, которые представляют собой лиганды для рецепторов Notch, активация которых играет ключевую роль в выборе направления клеточной дифференцировки. Инактивация и/или утрата изоформы ТАр63 в опухолевых клетках увеличивает их метастатический и инвазивный потенциал [15, 17].

 

Рис. 1. Ко-экспрессия TTF-1 и р63 в клетках аденокарцином легких (ИГХ реакция с антителами к TTF-1 и р63, увеличение х125 -A, Б, В, Г, увеличение х250 – Д, Е): экспрессия TTF-1 в большинстве клеток (А, В, Д) при неравномерной и очаговой экспрессии р63 (Б, Г, Е)

 

Рис. 2. Схема гена ТР63 и его белков: А. Схема экзонов и соответствующие домены гена TP63; Б. Изоформы белка р63 [14, 11]

 

В ряде недавних исследований было показано, что ген р63 способствует трансформации стволовых клеток в направлении плоскоклеточной дифференцировки [14]. На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что в эмбриогенезе экспрессия этого гена необходима для нормального морфогенеза эпидермиса, в т.ч. для образования зубов, волос, молочных желез, предстательной железы, потовых и слезных желез и других органов и систем [15]. При трансформации недифференцированных стволовых клеток в тканевые стволовые базальные клетки происходит формирование нормального эпителия. Во взрослом организме p63 играет важную роль в обеспечении поддержания популяции стволовых клеток в плоском и многослойном эпителии. В норме базальные, реснитчатые, бокаловидные, альвеолярные клетки также интенсивно экспрессируют р63. При этом клетки, экспрессирующие р63, рассеянны и в терминальных бронхиолах. Экспрессия р63 наблюдается также в миоэпителиальных клетках, локализованных в подслизистом слое бронхиальных желез [12, 16, 17].

В нашем исследовании экспрессия р63 была выявлена в 47,5% случаях АК легкого, а данные различных авторов в отношении частоты экспрессии этого маркера различаются. Так, по данным P.P. Mas-sion, et al. (2003) экспрессия р63 наблюдалась в 18% случаев (17 из 93) [18], по данным G. Pelosi, et al. (2002) – в 16% (15 из 95 случаев) [17], по данным F. Bir, et al. (2014) – в 25% [12], а по данным B.Y. Wang, et al. (2002) – уже в 60% случаев [19]. Очевидно, что такие различия объясняются, скорее всего, разными подходами в системе оценки.

В нашем исследовании была выявлена слабо выраженная тенденция к снижению безрецидивной выживаемости пациентов с р63-позитивными АК легких. Аналогичные данные получены и в ряде зарубежных исследований. Так, по данным M.L. Iacono, et al. (2011), экспрессия в опухолевых клетках изоформы N-терминального конца р63 достоверно ассоциировалась с выживаемостью пациентов с НПКРЛ, а при мультивариантном анализе было показано увеличение относительно риска неблагоприятного прогноза в 8,09 раз (при р=0,001). Авторы также отмечают, что выявление подобного типа белка в нормальной ткани легкого способствует ее злокачественной трансформации [20]. В исследовании T. Narahashi, et al. (2006) показана корреляция между экспрессией р63 в цитоплазме опухолевых клеток и плохим прогнозом у пациентов с АК легкого, а разница в выживаемости между группой с цитоплазматической экспрессий этого белка в опухоли и группой, где такая экспрессия отсутствовала, составила 2,16 против 4,64 [21]. В работе E. Ko, et al. (2013) показано, что р63 и ген RASSF1A являются независимыми факторами возникновения рецидивов опухолевого роста после хирургического удаления рака легкого на 1-2 стадии и без поражения лимфатических узлов [22].

В исследовании M-Ch. Aubry, et al. (2015) экспрессия р63 в АК легкого коррелировала с амплификацией гена ТР63, они выявили также сложную перестройку в гене B3GALNT1, расположенный на 3 хромосоме (3q26.1a) [23]. Однако, клиническое значение этой перестановки гена пока неясно – необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. Амплификацию гена р63 и его экспрессию наблюдали также при дисплазии и в карциноме in-situ легкого. Это позволило авторам высказать предположение, что ген р63 и его экспрессия в клетках эпителия легких играет существенную роль в механизмах канцерогенеза.

Аномалии в гене EGFR были выявлены у 25 пациентов (31%): у 15 пациентов – del19ex, у 10 пациентов – L858R. Следует отметить, что основную группу пациентов с выявленными мутациями составили женщины (19 случаев).

Не было обнаружено зависимости между экспрессией р63 в клетках АК легкого и выявленными нарушениями в гене EGFR. Нарушения в гене р63 были выявлены как в группе позитивной по исследуемого белку, в которой имелось 5 пациентов с различными мутациями в гене (3 del19ex и 2L858R), так и в группе пациентов без экспрессии р63 (табл. 3).

 

Таблица 3

Выявление мутаций EGFR у пациентов с экспрессий и отсутствием экспрессии р63

	Положительная экспрессия р63	Отсутствие экспрессии р63
Наличие мутации гене EGFR	5	4
Отсутствие мутации в гене EGFR	10	12

 

Заключение

Была выявлена слабо выраженная тенденция к снижению безрецидивной выживаемости пациентов с р63-позитив-ными аденокарциномами легкого. Выявление экспрессии р63 в аденокарциномах легкого может рассматриваться в качестве фактора неблагоприятного прогноза и риска более быстрого прогрессирования опухолевого процесса и требует дальнейшего изучения с увеличением статистической мощности исследования.

Полагаем, что углубленный анализ историй заболевания пациентов с аденокарциномами легкого, увеличение объема выборки с анализом стадий заболевания на момент постановки диагноза, а также изучение экспрессии в них разных изоформ р63, позволит в дальнейшем более достоверно судить о прогностическом значении этого фактора для течения заболевания.

Об авторах

Мария Михайловна Бяхова

ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского Минздрава России; ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5296-0068
SPIN-код: 2590-6506
ResearcherId: G-4419-2017

к.м.н., старший научный сотрудник патологоанатомического отделения; доцент кафедры патологической анатомии

Россия, Москва

Алексей Андреевич Глазков

ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского Минздрава России

Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6122-0638
SPIN-код: 3250-1882
ResearcherId: R-7373-2016

научный сотрудник отдела экспериментальных и клинических исследований

Россия, Москва

Игорь Юрьевич Виноградов

ГБУ РО Областной клинический онкологический диспансер; ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7239-0111
SPIN-код: 5110-8790
ResearcherId: Q-2281-2019

к.м.н., зав. патологоанатомическим отделением; старший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лаборатории

Россия, Рязань

Георгий Авраамович Франк

ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования Минздрава России

Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3719-5388
SPIN-код: 9004-4142
ResearcherId: P-1111-2019

научный сотрудник отдела экспериментальных и клинических исследований

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы