P63蛋白质在肺腺癌表达作为不利的因素

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肺癌是肺恶性肿瘤的不均匀的组，可以分为两个主要组：小细胞肺癌（低于15％）和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌的最大类别是腺癌，其占所有肺癌病例的30-40％。根据世界卫生组织（2015年）的分类，腺癌组包括各种结构和分化程度的肿瘤[1]。在大多数情况下，这种亚型发生在女性，非吸烟者的，并且更常见于肺的周围部分[2, 3]。

肺腺癌的形态学诊断通常基于苏木精和曙红染色的组织学制剂。但是，在某些情况下，诊断时会表达某些困难。在这种疑难杂症下，有必要使用一系列针对不同类型的肺组织（抗体）具有特异性的标记物进行免疫组织化学研究，以明确诊断。通常，可以使用3标记面板来确认大多数肺腺癌的诊断。该标记面板表征了这种类型肿瘤的免疫表型-细胞角蛋白7，转化生长因子TTF-1，合弓纲A.在肺鳞状细胞癌的鉴别诊断中，可以使用诸如细胞角蛋白5/6（通常表达扁平上皮细胞的细胞角蛋白），p63和TTF-1的标记[4-6]。然而，腺癌和肺鳞癌的低分化变体的免疫表型通常以不具有高分化变体特征的标签的表达为特征。因此，在某些低分化肺鳞癌中可以检测到TTF-1的表达（占0.9％的病例），相反，p63有时会表达腺癌细胞群（根据各种来源，在1/3的腺癌病例中）[7-9] 。因此，A.Warth et al.（2012年）表明，在肺腺癌确诊的病例中，有12.1％检测到了p63的表达[10]。重要的是要记住，腺癌中p63阳性细胞的数量显着低于鳞状细胞癌的特征（鳞状细胞癌中几乎100％的细胞核表达该标记）并且通常具有局灶性而不是弥散性分布[10]。

通常，在上曾表皮，食道，子宫，子宫颈，扁桃体，膀胱，支气管，乳腺和前列腺的扁平上皮的超基底细胞和上基底细胞中检测到TP63基因表达[11]。该基因在维持这些器官中的多能性（《干》）细胞群中起重要作用。应当指出，很少确认p63基因中的点突变，但经常在各种恶性肿瘤中发现。包括在肺肿瘤中，检测到该基因编码的蛋白的基因扩增和过表达[12]。

目的是研究细胞分子生物学标记的光谱，并在其中鉴定出可用作肺腺癌临床病程的预后因素的那些分子标记。

材料与方法

在这项制品中使用了2014年1月至2018年7月在国家预算公共卫生机构《莫斯科区域研究临床研究所以夫拉季米尔斯基·命名俄罗斯卫生部》的基础上检查和治疗的129例确诊为肺腺癌的患者的存档材料。将生物材料用于科学目的已获得地方的伦理委员会的批准。

手术和诊断活检在研究所的胸的科进行。诊断是在对苏木精和曙红染色的药物进行组织学检查后做出的，必要时，根据世界卫生组织当前分类推荐的免疫组化研究方法[1]。

免疫组织化学研究按照标准记录进行。将该材料固定在10％的缓冲液的福尔马林中，将厚度为4–5μm的切片涂在涂有粘合剂的玻璃上，然后在37°C下干燥过夜，然后在60°C下干燥1小时。根据对每种特异性抗体推荐的方案，对其他切片进行脱蜡和恢复抗原性。使用 Ven-tana细菌染色机（意大利）在自动模式下对手术材料进行免疫组织化学反应，在诊断性活检中，使用手动方法在连续切片上进行少量材料的诊断活检。使用了抗体组：广谱细胞角蛋白（克隆AE1 / AE3），高分子量细胞角蛋白（克隆βE12），细胞角蛋白7，细胞角蛋白5/6，p63，TTF-1，napsin A（Dako，Cell Marque，Ventana）。

为了检测肺癌组织中EGFR基因的突变，根据生产商的规程，使用Rotor-Gene Q设备（Qiagen，荷兰），使用Therascreen®EGFRRGQ PCR Kit诊断试剂盒（Qiagen，荷兰）使用实时聚合酶链反应方法。使用Cobas 脱氧核糖核酸 Sample Preparation Kit 剂盒从石蜡块中分离脱氧核糖核酸。

使用百分之分析分类变量，将连续变量表示为平均值和标准偏差。通过卡普兰-梅伊叶尔（Kaplan-Meyer）方法分析无复发生存； 生存差异的统计学意义通过对数秩检验。使用一维科克斯（Cox）回归分析风险因素。如果p <0.05则认为差异具有统计学意义。使用SPSS软件版本21.0（IBM Corporation，美国）进行统计分析。

在129例肺腺癌患者中（93例手术和43例诊断活检），男性67例（52％）和女性62例（48％）。40至70岁时87位患者（67.4％），70岁以上37位患者（28.7％），40岁以下5位患者（3.9％）。

根据TNM分类[13]，1期腺癌患者占10.1％（13人），2期患者-10.1％（13人），3期患者-17.8％（23） 人）和4期-10.8％（14人）。在某些患者中，TNM期不存在。表1列出了分析的摘抄汇总信息。

结果和讨论

在129例中的75例中根据形态学研究诊断为腺癌。在其他场合下，还需要补充的方法-免疫组织化学，该方法包括一组与肿瘤在肺中的位置相对应的有机和细胞特异性标签。在CK7，TTF-1和napsin A的肿瘤细胞中共表达的理由，以及在不表达CK5 / 6和p63的情况下，确定了肺腺癌。然而一系列事件，观察到了不是该肺癌亚型特征的标签的表达（表2）。在96.4％的病例中（55个中的53个），在腺癌细胞中观察到了细胞角蛋白7的表达，在94.9％（55个中的50个）中观察到了TTF-1表达，在94.7％（57中的54个）中观察到了餐巾素A， 分别在34.8％（23个中的8个）-SC 5/6中，47.5％（32个中的29个）-p63中（表2和图1）。

根据研究期间获得的初步数据，腺癌细胞中仅一种标记物p63的表达具有预后意义。两组之间的无复发生存差异为2.48±1.11个月，p <0.026。但是，随着患者选录的增加和对他们的观察时间的增加，这种趋势趋于平均化。尽管如此，我们在29例患者中观察到p63在不同比例的腺癌细胞中的胞质和/或核表达（47.5％，图1），并且在这些患者中观察到该病更具侵袭性。在p63肿瘤细胞中表达的腺癌患者，无复发生存平均为25.7±5.1个月，而在无p63表达的患者中，无复发生存为26.1±2.8个月。该指标不影响患者的总体生存，平均33.6±2.7个月。

总之，应注意以下列的。p63蛋白由1998年发现的TP63基因编码，代表TP53基因家族。它位于3q27-29号染色体上，由15个外显子组成。编码该基因的蛋白质在反式激活，脱氧核糖核酸结合和寡聚化范围中与p53蛋白质具有高度同源性，但在其C端一段上却有所不同。与仅编码一种蛋白质的TP53基因相反，尽管具有多种变形，但TP63基因一次编码几种蛋白质产物。可以从两个启动子（TA和ΔN）合成基质p63 RNA，然后将其置于基因的羧基末端区中的3个可变剪接位点（a，b和c）。结果，在TP63基因的参与下，可以产生p63蛋白的6个同工型，它们具有的（TA型）和非具有的（ΔN型）反式激活域（图2）[14，15]。TAp63同工型可激活p53基因；因此，亚型可终止细胞周期并启动细胞凋亡，而ΔNp63同工型则可激活细胞增殖机制并抑制细胞凋亡[16，17]。TAP63同工型还可以激活其他包含结构相似元件的基因。比如，这种同工型间接刺激Jag1和Jag2蛋白基因的转录，它们是Notch受体的配体，其活化在选择细胞分化方向中起关键作用。肿瘤细胞中TA63同工型的失活和/或丧失会增加其转移和侵袭潜能[15, 17]。

最近的许多研究表明，p63基因在鳞状细胞分化的方向上促进了干细胞的转化[14]。在实验模型上证明了在胚发生中该基因的表达对于表皮的正常形态发生是必需的，包括牙齿，头发，乳腺，前列腺，汗液和泪腺以及其他器官和系统的形成[15]。在未分化干细胞转化为组织干基底细胞的过程中，形成正常的上皮细胞。在成年生物中，p63在维持扁平上皮和复层上皮中的干细胞种群中起着重要作用。通常，基础的，纤毛的，杯状的，肺泡细胞也强烈表达p63。此外，表达p63的细胞散布在细支气管末端。在支气管腺粘膜下层的肌上皮细胞中也观察到了p63的表达[12, 16, 17]。

我们的研究中发现了47.5％的肺腺癌病例中检测到p63表达，关于该标志物表达频率的不同作者的数据也不同。根据P.P. Massion, et al. （2003）在18％的病例中观察到p63表达（93个病例中的17个）[18]，根据G.Pelosi, et al.（2002）在16％（95个案例中有15个）[17]中，根据F.Bir et al.（2014）以25％的[12]，根据B.Y.Wang, et al. （2002）- 已经有60％的案例[19]。显然，这种差异很可能由评估系统中的不同方法来解释。

我们的研究中发现了p63阳性肺腺癌患者有轻度降低无复发生存的趋势。在许多国外研究中也获得了类似的资料。因此，根据M.L. Iacono et al.（2011），p63的n端亚型在肿瘤细胞中的表达与低分化鳞肺癌患者的生存显著相关，多变量分析显示其预后不良的风险增加了8.09倍(p = 0.001)。作者还注意到，在正常肺组织中识别这种类型的蛋白有助于其恶性转化[20]。在T. Narahashi et al.的研究中 （2006年）显示了肺腺癌患者肿瘤细胞质中p63的表达与预后不良之间的相关性。在肿瘤中具有这种蛋白的细胞质表达的组与不存在该蛋白的组之间的生存期差异为2.16对4.64 [21]。在E. Ko et al.的作品中（2013年）表明p63和RASSF1A基因是在1-2期手术切除肺癌后且不损害淋巴结的情况下肿瘤生长复发的独立因素[22]。

在M-Ch.Aubry et al.的研究中（2015）肺腺癌中p63的表达与TP63基因的扩增相关了；他们也揭露了位于3号染色体（3q26.1a）上的B3GALNT1基因的复杂改筑[23]。然而，这种基因重排的临床意义还不清楚，这方面还需要进一步的研究。在发育不良和原位肺癌中也观察到了p63基因的扩增及其表达。这使作者提出p63基因及其在肺上皮细胞中的表达在致癌机制中起着重要作用。

在25例患者中发现了EGFR基因异常（31％）：15例患者del19ex，10例患者L858R。应当指出的是，识别出突变的患者主要是女性（19例）。

在肺腺癌细胞中p63的表达与检测到的EGFR基因异常之间没有关系。在研究蛋白阳性组中检测到p63基因的违规，其中有5名患者的基因突变（3 del19ex和2L858R）和无p63表达的患者组（表3）。

结论

发现轻度的趋势会降低p63阳性肺腺癌患者的无病生存期。肺腺癌中p63表达的检测可认为是预后不良和肿瘤进程更快发展的风险的因素。这需要进行进一步的研究，并增加研究的统计能力。

我们认为，对肺腺癌患者病史的深入分析，在诊断时对疾病阶期分析，样本量的增加以及对其中不同p63同工型表达的研究，将使我们能够更可靠地判断该因素对疾病进程的预后意义。

表1。分析中包括肺腺癌患者的临床和人口统计学特征

指标	患者人数	%
性
男人	67	52
女人	62	48
年龄
40岁以下	5	3.9
40-70岁	87	67.4
超过70岁	37	28.7
肺腺癌的期
1期	13	10.1
2期	13	10.1
3期	23	17.8
4期	14	10.8

 

表2。免疫组化标签在肺腺癌细胞中的表达

标签	阳性表达	缺乏表达
CK7	53 (96.4%)	2 (3.6%)
TTF-1	50 (90.9%)	5 (9.1%)
Napsin A	54 (94.7%)	3 (5.3%)
CK5/6	8 (34.8)	15 (65.2)
р63	29 (47.5%)	32 (52.5%)

 

表3。 p63表达和不表达的患者中EGFR突变的鉴定

	p63阳性表达	缺乏p63表达
EGFR基因中存在突变	5	4
EGFR基因无突变	10	12

 

图1。TTF-1和p63在肺腺癌细胞中的共表达（与针对TTF-1和p63的抗体的免疫组织化学反应，x125-A，B，C，D的增加，x250 - E，F的增加）：TTF-1在大多数细胞（A，C，E）中的表达，p63表达不均匀且局灶性中表达（B，D，F）

图2。TP63基因及其蛋白质的略图： А.TP63基因的外显子和相应结构域图； B. p63蛋白的同工型[14.11]

作者简介

Maria Byakhova

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

编辑信件的主要联系方式.
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SPIN 代码: 2590-6506
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MD, PhD, Senior Researcher of the Pathoanatomical Department; Associate Professor of the Department of Pathological Anatomy

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Alexey Glazkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute

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ORCID iD: 0000-0001-6122-0638
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Researcher ID: R-7373-2016

Researcher of the Experimental and Clinical Research Department

俄罗斯联邦, Moscow

Igor Vinogradov

Ryazan Regional Clinical Oncologic Dispensary; Ryazan State Medical University

Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7239-0111
SPIN 代码: 5110-8790
Researcher ID: Q-2281-2019

MD, PhD, Head of the Department of Pathological Anatomy; Senior Researcher of the Central Research Laboratory

俄罗斯联邦, Ryazan

George Frank

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: biakhovamm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3719-5388
SPIN 代码: 9004-4142
Researcher ID: P-1111-2019

MD, PhD, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of Pathological Anatomy

俄罗斯联邦, Moscow

参考

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