METHODS OF IDENTIFICATION OF DRUGS AS P-GLYCOPROTEIN SUBSTRATES

Full Text

В фармакокинетике лекарственных веществ (ЛВ) кроме ферментных систем, участвующих в их биотрансформации, большая роль принадлежит транспортным белкам, обеспечивающим выведение ЛВ из организма или препятствующим их всасыванию и проникновению через тканевые барьеры. Наиболее изученным транспортером является гликопротеин-P (Pgp) -мембранный белок, удаляющий из клеток во внеклеточное пространство или просвет органов широкий спектр эндогенных и экзогенных субстратов, среди которых -большое число лекарственных веществ с различной химической структурой и механизмом действия [9]. Pgp локализован преимущественно на апикальной мем бране клеток слизистой оболочки тонкого кишечника, гепатоцитов, эпителиоцитов проксимальных канальцев нефронов почек и эндотелиоцитов гистогематических барьеров. В связи с особенностями локализации от функциональной активности Pgp в значительной степени зависит фармакокинетика лекарственных веществ, являющихся его субстратами, и, следовательно, эффективность и безопасность фармакотерапии. Функционирование белка-транспортера может быть как индуцировано, так и ингибировано под действием различных факторов внешней и внутренней среды [3], в том числе и при приеме ряда лекарственных средств [4]. При этом высокая активность транспортера ведет к 49 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. неэффективности фармакотерапии веществом-субстратом, а низкая активность - к его относительной передозировке. В связи с вышеизложенным целью работы явилась разработка методики анализа принадлежности лекарственных средств к числу субстратов Pgp. Материалы и методы Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500 - 4300 г. Работа с животными проводилась в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н). Животным вводили фексофенадин (таблетки покрытые оболочкой Телфаст, 180 мг, Aventis Pharma, Италия) однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг массы [1], затем забирали у них кровь из ушной краевой вены в объеме 5 мл в ге-паринизированные пробирки, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы. В плазме крови определяли концентрацию фексофенадина методом ВЭЖХ на хроматографической системе «Stayer» по методике, описанной ранее [2]. Затем животные были разделены на две серии: первая серия (n=6) получала рифампицин (капсулы Рифампицин, 150 мг, РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) в дозе 40 мг/кг дважды в день [7] в течение 14 дней, вторая серия (n=6) получала верапамил (таблетки, покрытые обо лочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг в сутки в три приема [1] аналогичным курсом. Затем животным двух серий снова вводили фексофенадин и анализировали его фармакокинетику. Эксперимент выполнен «слепым» методом. Введение препаратов (рифампицина и верапамила), забор крови и определение концентрации фексофенадина методом ВЭЖХ выполняли разные исследователи после специальной маркировки препаратов и проб крови для выполнения условий «ослепления». Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя модельнонезависимый метод, с применением программы «Kinetica 5.0». Для статистической обработки данных применяли офисный пакет «Microsoft Office XP» и программу Statistica 7.0. При статистической обработке результатов характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Наличие статистически достоверных межгруп-повых различий определяли по критерию Ньюмена-Кейлса после проведения дисперсионного анализа повторных измерений (тест ANOVA - для показателей, имеющих нормальное распределение, критерий Фридмана - для показателей, распределение которых отличалось от нормального). Результаты считали достоверными при уровне значимости меньше 0,05. Результаты и их обсуждение Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина Фармакокинетические параметры Интактные кролики (n=6) После введения верапамила (n=6) Р Cmax нг/мл 673,43±370,67 1012,27±252,67 0,014 AUC0.t, нг*ч/мл 5256,65±4024,58 8064,62±2145,95 0,031 AUC0.«, нг*ч/мл 6216,16±5611,39 11104,14±3353,63 0,011 Tmax ч 5,5 (2,5; 6,0) 2,0 (1,75; 2,5) 0,042 Т1/2, ч 6,4±2,5 13,75±5,65 0,024 MRT, ч 9,72 (8,2; 12,48) 18,4 (13,0; 22,7) 0,116 Cl, л/ч 54,42±44,83 17,47±5,05 0,075 Объем распределения, л 527,51±456,7 305,05±104,63 0,307 Примечание: данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае распределения отличного от нормального. 50 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. На фоне курсового введения вера-памила наблюдалось достоверное повышение максимальной концентрации (Сшзх) фексофенадина на 50,3% (p = 0,014), площади под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC0-t) на 53,4% (p = 0,031), периода полувыведения (Тід) на 114,8% (p=0,024), а также сниже ние времени достижения максимальной концентрации (Tmax) на 63,6% (p = 0,042). Напротив, курсовое введение кроликам рифампицина приводило к снижению площади под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC0-t) фексофенади-на на 61,2% (p = 0,042) и увеличению общего клиренса (Cl) на 130,2% (p = 0,038). Таблица 2 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина до и после введения рифампицина Фармакокинетические параметры Интактные кролики (n=6) После введения рифампицина (n=6) p Сшах, нг/мл 909,89±449,42 506,12±459,05 0,155 AUC0-t, нг*ч/мл 5276,73±2955,84 2049,60±957,59 0,042 AUC0_„ нг*ч/мл 5958,31±3236,25 2308,89±914,97 0,035 Тшэх, Ч 4,0 (2,5; 5,25) 3,0 (2,0; 3,75) 0,357 Т1/2, ч 7,51±5,52 4,90±2,29 0,342 HRT, ч 10,47±4,07 9,35±3,53 0,650 Cl, л/ч 41,49±26,42 95,5±57,32 0,038 Объем распределения, л 367,71±150,83 861,62±468,77 0,074 Примечание: данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае их распределения отличного от нормального. Фексофенадин - это гистаминолитик III поколения, который не метаболизирует-ся в организме, а его всасывание в кишечнике, распределение и элиминация напрямую зависят от функционирования Pgp. Поэтому данный лекарственный препарат может служить маркерным субстратом, отражающим функциональную активность данного белка-транспортера [1, 8]. Верапамил в ряде исследований продемонстрировал свою способность ингибировать функциональную активность Pgp, предположительно, связываясь с его молекулой и нарушая ее контакт с субстратами транспортера [1, 5]. Рифампицин повышает функциональную активность Pgp путем активации транскрипционного фактора PXR, который связывается с промотором гена, кодирующего данный транспортер, и повышает его экспрессию [6]. Выявление зависимости фармакокинетики лекарственного вещества от Pgp позволяет корректировать его дозу с учетом индивидуальной функциональной активности транспортера. Подобную тактику уже рекомендуют американские организации FDA (Food and Drug Administration), U.S. Department of Health and Human Services, Center for Drug Evaluation and Research. Продемонстрированная в данной работе динамика параметров фармакокинетики фексофенадина, который был выбран в качестве эталонного субстрата Pgp, после курсового введения рифампицина и верапамила доказывает пригодность использования указанных индуктора и ингибитора активности транспортера, курсов их введения и доз для тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам Pgp. Выводы 1. Введение кроликам породы шиншилла верапамила в суточной дозе 20 мг/кг массы три раза в сутки в течение 14 дней вызывает снижение функциональной активности гликопротеина-Р, что позволяет использовать препарат в качестве ингибитора для оценки принадлеж 51 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. ности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P. 2. Введение кроликам породы шиншилла рифампицина в дозе 40 мг/кг массы два раза в день в течение 14 дней вызывает повышение функциональной активности гликопротеина-Р, что позволяет использовать препарат в качестве индуктора для оценки принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P. 3. Разработанная методика оценки принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P основана на сравнении фармакокинетических параметров тестируемого субстрата до и после курсового введения индуктора и ингибитора данного белка-транспортера.

References

Supplementary files