Морфологическая иллюстрация изменений артериального эндотелия на фоне ишемического и реперфузионного повреждений

Полный текст

Реперфузионный синдром является неизбежным явлением при восстановлении кровотока после продолжительной ишемии [1, 2]. Врачи специализированных отделений вынуждены сталкиваться с ишемией конечности и, как следствие, развитием повреждающей реоксигенации при успешно выполненной реканализации [3, 4]. Происходит необратимая клеточная гибель ткани. К сожалению, сохранить конечность в такой ситуации удается далеко не всегда [5]. Эти патологические процессы являются следствием не только предшествовавшей ишемии конечности, но и последующей реперфузии [6]. Многогранность патофизиологических процессов определяет важность проведения экспериментальных работ в изучении данного феномена [7] с возможностью сопоставления и сравнения глубины морфологических изменений эндотелия на различных этапах хирургической коррекции.

Цель исследования – сравнить глубину морфологических изменений артериального эндотелия на фоне ишемического и реперфузионного поражения в эксперименте.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 90 лабораторных животных (крысах линии Wistar массой тела 250300 г). Животные содержались в стандартных условиях вивария, получали стандартный рацион питания и воду ad libitum в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и МЗРФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Mодели ишемии и реперфузии cозданы путем пережатия брюшного отдела аорты (1ая группа) с последующим кондиционированием (2ая группа). Все операции осуществлялись под наркозом с использованием препаратов «Ксило» 1 мг/кг и «Золетил 50» 15 мг/кг. Вывод животных из эксперимента проводили передозировкой золетила («Virbac Sante Animale», Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50 мг/кг на 1, 3, 5, 7ые сутки. Выделенный сосудистый ствол фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (фосфатный буфер, pH=7,2–7,4), обезвоживали в серии этанолов возрастающей концентрации, с применением изопропанола, заливали в парафин. Изготавливали тотальные серии срезов (10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином («Biovitrum», Россия). Гистологические срезы также окрашивали пикрофуксином по Ван Гизону и по методу Маллори по общепринятой методике. Морфологическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DMI 4000 B с видеозахватом камерой Leica.

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии фрагменты сосудистой стенки фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида («Fluka», Швейцария) с постфиксацией в 1% растворе OsO₄ («Fluka», Швейцария). Контрастирование проводили 2,5% спиртовым раствором (70º этиловый спирт) уранила ацетата («Fluka», Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М («Fluka», Швейцария). Полутонкие срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали солями свинца и уранилацетатом по Рейнольдсу. Изучение препаратов проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ); трансмиссионный электронный микроскоп «Libra 120» с автоматическим сканированием изображений («Carl Zeiss», Германия).

Результаты и их обсуждение

На 1ые и 3ьи сутки после проведения моделирования ишемии патогистологическая и ультраструктурная картина мало отличались (в динамике). При проведении световой микроскопии установлено, что в тканях происходят дистрофические и некробиотические изменения. В стенке сосуда констатирован выраженный интерстициальный отек. Выявлена гетероморфия эндотелия: очаговое сглаживание и истончение эндотелиальной выстилки, чередующееся с набуханием эндотелиоцитов. Для этого срока характерна мозаичная десквамация внутренней выстилки сосуда. В субэндотелиальном слое выявлены набухание волокон, признаки интерстициального отека, нечеткость контуров внутренней эластической мембраны, ее базофилия и сегментация.

Ультраструктура эндотелиоцитов характеризуется наличием обратимых реактивных изменений ядра и органелл (рис. 1).

Нуклеолемма образовывает глубокие инвагинации; перинуклеарное пространство неравномерно расширено. Хроматин находился преимущественно в конденсированном состоянии. Его осмиофильные глыбки плотным кольцом концентрированы вдоль кариолеммы. Центральная часть кариоплазмы содержит деконденсированный хроматин и обладает низкой электронной плотностью.

Митохондрии эндотелиоцитов обладают средней электронной плотностью и гомогенным матриксом. Кристы значительного числа митохондрий не выявлялись, т.е. были сглажены и(или) разрушены. Отдельные митохондрии содержали тотально лизированные кристы, а в матриксе выявлено фибриллярное содержимое. Наружные мембраны этих органелл имели очаги деструкции, что свидетельствует об их необратимом повреждении (рис. 2). Следует отметить, что к этому сроку наблюдается частичное разрушение контактов между эндотелиоцитами с расширением межклеточных щелей; т.е. наблюдается частичная дискомплексация эндотелиального пласта, являющаяся предиктором мозаичной десквамации.

 

Рис. 1. Ультраструктура t. intima подвздошной артерии крысы через 1 сутки после моделирования ишемии: 1 – просвет; 2 – вакуолизированная цитоплазма эндотелиоцитов; 3 – базальная мембрана; 4 – отечный субэндотелиальный соединительнотканный слой; 5 – фрагмент богатой митохондриями клетки. ТЭМ. Ув.×4000

 

Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума сильно расширены и представляют собой электроннопрозрачные вакуоли. На мембранах практически отсутствуют рибосомы, а в цитоплазме выявляются большое количество свободных рибосом и полисом. Гиалоплазма эндотелиоцитов умеренно просветлена. Наблюдался очаговый лизис мембран гранулярной эндоплазматической сети. Пластический цитоплазматический комплекс Гольджи подвержен редукции и представлен отдельно лежащими, беспорядочно ориентированными гладкими мембранными стопками, вблизи которых располагаются крупные электроннопрозрачные вакуоли, первичные и вторичные лизосомы, а также включения липидов.

 

Рис. 2. Ультраструктура эндотелиоцитов крысы через трое суток после моделирования ишемии: 1 – ядра эндотелиоцитов с маргинацией гетерохроматина; 2 – цитоплазма эндотелиоцита с частичной деструкцией органелл; 3 – расширенная зона контакта соседних эндотелиоцитов. ТЭМ. Ув.×4000

 

Таким образом, ишемическое повреждение сосудистой стенки и особенно клеток функциональноведущей ткани – эндотелия – представляют собой умеренно выраженные признаки альтеративных структурных и ультраструктурных изменений.

При изучении препаратов от экспериментальных животных через пять и семь суток в патогистологических и ультраструктурных находках могут быть обнаружены различия по сравнению с ранними сроками.

При световой микроскопии отмечено, что изменения затрагивают все слои сосуда, от tunica intima до tunica externa. Внутренняя оболочка рельефная, резко утолщена за счет отека, с выраженными дистрофическими изменениями и наличием разволокнения фибриллярного каркаса, что делает возможным наличие оптически пустых ячеек, признаки плазморрагии. Эндотелиоциты полиморфные, разноразмерные, с набуханием некоторых клеток. Внутренняя эластическая мембрана неравномерно утолщена, с наличием глубоких складок и фрагментаций.

Средняя оболочка и адвентиция с явлениями мозаичной пикрино и фуксинофилии (при окрашивании по Ван Гизону), эластические компоненты фрагментированы, с набуханием волокон и нередкими фигурами деформации. Адевентиция, преимущественно вокруг собственных сосудов, очагово гипертрофированна, с наличием лимфоплазмоцитарной инфильтрации, в этих локусах отмечено существенное количество эозинофилов.

На 7ые сутки эндотелий утолщен, на некоторых участках попрежнему десквамирован, субэндотелиальный слой набухший. В адвентиции определяется полнокровие и кровенаполенение капилляров адвентиции и гиперхроматией эндотелия капилляров, в некоторых сосудах адвентиции лейкостазы и эритродиапедез. Основное вещество адвентиции и средней оболочки базофильно, сегментарными разрывами коллагеновых фибрилл, формированием концентрических структур.

При ультраструктурном исследовании отмечается эндотелиоциты с тотальной деструкцией всех внутриклеточных органелл и мембранных структур. Однако, в большинстве случаев цитоплазма клеток потеряла обнаруженную на ранних сроках вакуолизированность. Вместе с тем следует подчеркнуть сохранность гетероморфии клеток, в большом количестве встречаются эндотелиоциты с темной (осмиофильной) гомогенизированной цитоплазмой; клетки формируют множество ламеллоподий, эти отростки инвазированы в утолщенную базальную мембрану (рис. 3, 4).

 

Рис. 3. Ультраструктура эндотелиоцитов крысы через 7 суток после моделирования ишемии: 1 – просвет сосуда; 2 – фрагменты цитоплазмы эндотелиоцитов; 3 – ядро лейкоцита; 4 – утолщенная базальная мембрана. ТЭМ. Ув.×4000

 

Рис. 4. Ультраструктура эндотелиоцитов крысы через 7 суток после моделирования ишемии: 1 – эритроциты в просвете сосуда; 2 – фрагменты цитоплазмы эндотелиоцитов; 3 – отростки эндотелиоцитов в утолщенной базальной мембране. ТЭМ. Ув.×8000

 

В некоторых митохондриях наблюдался тотальный лизис крист и наружных мембран. Гранулярный эндоплазматический ретикулум фрагментирован. Рибосомы, как свободно лежащие в цитоплазме, так и связанные с мембранами гранулярного эндоплазматического ретикулума, практически отсутствовали. Редукция пластинчатого цитоплазматического комплекса Гольджи сопровождалась разрыхлением и лизисом его мембран.

Таким образом, на 5ые и 7ые сутки в стенке сосуда происходят более глубокие деструктивные изменения, сопровождающиеся не только дистрофическими, но и некробиотическими изменениями. Вместе с тем, следует отметить, что такие изменения не захватывают тотально всю эндотелиальную выстилку; часть эндотелиоцитов демонстрирует лишь умеренно выраженные реактивные изменения.

В первые сутки после моделирования реперфузии патогистологические находки на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях не отличаются от выявленных в первой группе: отмечалось наличие дистрофических изменений и выраженного интерстициального отека в стенке сосуда, что является маркером гипоксического повреждения специализированной ткани. Однако, на 3ьи сутки во второй группе эти изменения приобретают мозаичный характер. Наряду с патологическими процессами происходят также и адаптационные изменения структур сосудистой стенки. В частности, отмечено умеренное расширение просвета некоторых сосудов, изменение органелл эндотелиальных клеток: отек отдельных митохондрий, увеличение площади поверхности ядер за счет образование инвагинаций, умеренное усиление микропиноцитоза (рис. 5). Вместе с компенсаторными изменениями обнаружены патологические нарушения эндотелиоцитов кровеносных сосудов, которые характеризуются отеком эндотелиальных клеток – их набуханием и деструкцией отдельных митохондрий.

 

Рис. 5. Ультраструктура t. intima подвздошной артерии крысы через 1 сутки после моделирования ишемии-реперфузии: 1 – просвет; 2 – эндотелиоциты; 3 – утолщенная базальная мембрана; 4 – отечный субэндотелиальный соединительнотканный слой. ТЭМ. Ув.×4000

 

Митохондрии вакуолизированы, их матрикс просветлен, кристы дезориентированы. Цистерны цитоплазматической сети и пластинчатого комплекса расширены. Превалируют данные, указывающие на реактивные изменения эндотелиоцитов, которые заключается в том числе в увеличении ядерной поверхности за счет образования инвагинаций различной глубины и выраженной пиноцитозной активности плазмолеммы эндотелиоцитов.

Параллельно в отдельных участках наблюдаются нарушения межэндотелиальных контактов с расширением и отеком перикапиллярного пространства. При электронномикроскопическом исследовании ультраструктуры, обнаружены изменения эндотелиальных клеток, базальной мембраны сосудов микроциркуляторного русла, перицитов и периваскулярного пространства.

Выявленное чередование «светлых» и «темных» эндотелиоцитов свидетельствует о том, что клетки находятся либо в различных стадиях повреждения, либо различных фазах функциональной активности; нельзя исключить, что первые находятся в стадии деструкции, а вторые выполняют основную функцию эндотелиального слоя.

К 5ым и 7ым суткам в исследованном сосуде у животных этой группы наблюдается процессы ремоделирования кровеносных сосудов – деформирование и сужение просвета микрососудов, разрыхление и нарушение целостности базальной мембраны, изменения перицитов, склонность эритроцитов к адгезии и гемолизу. Эти изменения свидетельствуют о нарушении синхронности участия всего эндотелия в кровоснабжении тканей, повышении проницаемости сосудов и ведут к замедлению микрогемоциркуляции и агрегации клеток крови.

Через семь суток выявлены генерализованные изменения, которые состоят в нарушении ультраструктуры всех слоев сосудистой стенки. Эндотелиальные клетки часто находятся в состоянии тяжелой дистрофии, некроза, часть их выступает в просвет сосудов в виде сосочков. Просвет сосуда несколько сужен вследствие отека эндотелиоцитов. Претерпевают изменения и митохондрии эндотелиальных клеток. Для них характерны отек, просветление матрикса, частичная или полная деструкция крист, вакуолизация. Базальная мембрана имеет неравномерную толщину и среднюю электронную плотность. В структуре базальной

мембраны выявлялись вакуолеподобные образования, не ограниченные мембраной. Кроме того, обнаруживались участки разрушения базальной мембраны (рис. 6).

 

Рис. 6. Ультраструктура t. intima подвздошной артерии крысы через 7 суток после моделирования ишемии-реперфузии: 1 – просвет; 2 – вакуолизированная цитоплазма «темного» эндотелиоцита; 3 – утолщенная базальная мембрана с очагами деструкции, дефектами, просветлениями; 4 – субэндотелиальные структуры. ТЭМ. Ув.×4000

 

В области разрушения эндотелиального пласта наблюдался контакт эритроцитов крови с коллагеновыми и эластическими волокнами, в этих участках констатируется пристеночный сладж эритроцитов, их агрегация. Для этих участков констатировано прилежание эритроцитов непосредственно к лейомиоцитам.

В непосредственной близи к участкам десквамации эндотелия, активировались внутриклеточные процессы в фибробластах. Их ядра приобретали фестончатый вид с множеством глубоких и мелких инвагинаций ядерной мембраны. Ядерный хроматин частично конденсировался и концентрировался вблизи ядерной мембраны. В центральной области матрикса появлялись скопления рибосом. Перинуклеарные пространства расширены не были.

Таким образом, при исследовании ультраструктуры сосудистой стенки в группе ишемияреперфузия обнаружены адаптивные и патологические изменения эндотелиальных клеток. Получены данные, свидетельствующие о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях при реперфузии. Сопоставление патоморфологических данных, полученных при изучении аорт и подвздошных артерий животных двух групп («ишемия» и «реперфузия») показывает, что каскад патоморфологических изменений включает в себя несколько основных этапов и укладывается в традиционные представления о реактивности тканевых систем. Транзиторная ишемия приводит к повреждению (альтерации) основных компонентов сосудистой стенки. Эндотелиоциты под воздействием этого фактора реагируют неспецифическим образом изменяя свою синтетическую активность [8], что проявляется совокупностью морфологических изменений, захватывающих ядро, кариолемму, цитоплазму и плазмалемму. В некоторых клетках изменения приобретают необратимый характер, сопровождаются разрывом мембран митохондрий, органелл общего назначения, плазмалеммы. Такие эндотелиоциты погибают и десквамируются. Ввиду незначительной продолжительности ишемии эти изменения выражены не сильно. Субэндотелиальные структуры подвергаются отеку, что закономерно в связи с учетом нарушения барьерной функции эндотелия и незначительно выраженного воспалительного компонента (в ответ на гибель части эндотелиоцитов и клеток стромы сосудистой стенки).

Сроки наблюдения в данном эксперименте не позволили проследить всю последовательность событий от повреждения до полной реституции, однако очевидно, что алгоритм тканевых событий будет развиваться именно таким образом и повреждение на органном уровне (сосуд) обратимо.

Для более тонкой дифференцировки различий патоморфогенеза при двух изученных состояниях целесообразно применить высокоразрешающие методы исследований [9].

Вывод

Существенных структурных и ультраструктурных отличий в картине повреждения и реактивных изменений в группах «ишемия» и «реперфузия» обнаружено не было.

Об авторах

Александр Сергеевич Пшенников

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: pshennikov1610@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-1687-332X
SPIN-код: 3962-7057

к.м.н., доцент кафедры сердечно-сосудистой, рентгенэндоваскулярной, оперативной хирургии и топографической анатомии

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Роман Вадимович Деев

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: pshennikov1610@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841
SPIN-код: 2957-1687

к.м.н., доцент, заведующий кафедрой патологической анатомии с курсом судебной медицины

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Список литературы

Дополнительные файлы