Expression of TSPO and HIF-1α genes as predictors of the organism’s resistance to hyperthermia

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

В исследовании активации генной информации, связанной с генами-регуляторами, наиболее широко используется метод сопоставления с экспрессией генов «домашнего хозяйства», которые являются высококонсервативными и стабильными для данного вида животных и их тканей. Часто с этой целью используется ген TSPO транслокаторного белка для переноса через митохондриальные мембраны стеролов и других субстратов. Транслокаторный белок, 18 кДа (TSPO), — это трансмембранный полипептид, состоящий в зависимости от вида из 153–169 аминокислот, образующих пять спиральных субъединиц. TSPO локализуется преимущественно на наружной мембране митохондрий стероидпродуцирующих тканей многих органов, однако в наибольшей степени он обнаруживается в тканях, продуцирующих стероиды, таких как ткани надпочечников, гонад и мозга.

В центральной нервной системе TSPO обычно представлен в клетках микроглии и реактивных астроцитов. Как основной компонент наружной мембраны митохондрий TSPO опосредует различные функции митохондрий, в том числе транспорт холестерина и синтез стероидных гормонов, транспорт порфиринов, митохондриальное дыхание, открытие митохондриальных пор, апоптоз и пролиферацию клеток [6]. В ранее выполненной работе [9] было показано, что в условиях критической гипоксии экспрессия TSPO может значительно меняться в зависимости от степени интенсивности воздействий, что делает этот ген особенно интересным в исследованиях по экстремальной медицине.

К настоящему времени известно, что одним из ключевых транскрипционных регуляторов, определяющих устойчивость клеток организма к гипоксии, вне зависимости от ее вида и механизма формирования, является гипоксия-индуцибельный фактор 1 (HIF-1), вовлеченный в индукцию транскрипции генов гликолиза и транспортеров глюкозы, гемопоэза, ангиогенеза, образования оксида азота, антиоксидантной защиты, работы клеток эндотелия, надпочечников, адренорецепторов, ростковых факторов, процессов апоптоза регенерации. Свойства HIF-1 достаточно подробно рассмотрены в ряде обзоров [2, 3, 7, 11, 19, 21]. Необходимо отметить, что к настоящему времени установлена взаимосвязь между HIF и белками теплового шока (БТШ, HSP), необходимость экспрессии HIF не только для адаптации к гипоксии, но и гипертермии, установлено влияние температуры тела на эффективность адаптации к гипоксии [4, 10, 14, 16, 17]. Показано, что температура тела влияет на уровень экспрессии HIF-1, замыкая тем самым регуляторные механизмы перекрестной резистентности организма к экстремальным воздействиям [12].

Указанные данные и результаты, полученные другими исследователями, показывают плейотропную роль HIF в устойчивости клеток к экстремальным воздействиям, а изучение роли этого транскрипционного фактора в устойчивости организма к экстремальным воздействиям может обосновать новые направления в медицинских технологиях ее повышения [8, 20].

Устойчивость организма к гипоксии во многом определяет и устойчивость к другим критически значимым воздействиям (гипертермия, гипотермия, гипербария, ионизирующее излучение, химические вещества и др.) [13, 18, 22]. Однако количественной оценки этого влияния в отношении гипертермии в изученной нами литературе обнаружить не удалось, что послужило основанием для выполнения данного исследования.

Цель — оценить значение уровня экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в различных тканях лабораторных крыс для повышения устойчивости животных к воздействию гипертермии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные и их содержание

В исследовании использовали здоровых нелинейных белых крыс-самцов с массой тела на начало исследования 180–220 г, поступивших из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл.) в одном привозе, с ветеринарным свидетельством, и прошедших 14-дневный карантин. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Животные содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария в клетках по 5–10 голов, при контролируемых условиях окружающей среды (при температуре 22 ± 3 °C и относительной влажности воздуха 30–70 %, световой режим — день/ночь, 12/12). Питание животных осуществлялось полнорационным комбинированным кормом для грызунов, корм и питьевая вода предоставлялись в режиме свободного доступа без ограничений. Уход за животными и их кормление обеспечивали прошедшие специальное обучение сотрудники. Для маркировки крыс использовали спиртовой раствор пикриновой кислоты. Сопоставимость экспериментальных групп обеспечивали рандомизацией животных, признанных годными для включения в исследование.

Исследование выполняли в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ¹ и приказом Минздрава России о правилах надлежащей лабораторной практики ², согласно утвержденному письменному протоколу, одобренному локальной биоэтической комиссией Научно-клинического центра токсикологии им. акад. С.Н. Голикова ФМБА России.

Дизайн исследования

Для достижения поставленной цели выполнено моделирование экстремальной гипертермии в группах лабораторных животных, достоверно различающихся по уровню устойчивости к заданному воздействию. Для этого прошедшие 14-недельный карантин 40 белых беспородных крыс в фоновом исследовании предварительно тестировались на устойчивость к гипертермии.

Для дифференциации лабораторных животных по уровню тепловой устойчивости в ходе предварительных исследований были проанализированы индивидуальные кривые динамики ректальной температуры крыс при пребывании их в условиях воздействия внешней высокой температуры (вентилируемый термостат, 40 °C, влажность воздуха 37–40 %). В качестве критериальной длительности воздушной гипертермии, существенно влияющей на функциональное состояние животных, но не вызывающей их гибели, был выбран 20-минутный интервал теплового воздействия. При этом животные, для которых была характерна более высокая скорость роста ректальной температуры (0,9–1,1 °C за 20 мин), относились к термонеустойчивым животным, а с более медленным нарастанием ректальной температуры (0,4–0,7 °C за 20 мин) — к термоустойчивым.

Таким образом, по результатам выполнения в фоновом исследовании 20-минутной тепловой нагрузки на основе данных о приросте ректальной температуры были сформированы 4 экспериментальные группы по 6 животных, из них две группы (1 и 3) включали в себя животных с низким уровнем устойчивости к гипертермии, и две (2 и 4) — с высоким уровнем устойчивости к гипертермии животных, в тканях которых как при термокомфортных условиях, так и сразу после завершения 30-минутного теплового воздействия определялись значения экспрессии генов HIF-1α и TSPO в образцах тканей (плазма, цельная кровь, почки, печень, сердце и головной мозг).

Методика изучения экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в ответ на экстремальное воздействие

Сразу же после прекращения теплового воздействия животные выводились из эксперимента методом декапитации, и у них забирались образцы цельной крови, почек, печени, сердца и головного мозга. Пробы замораживались в жидком азоте и хранились до выполнения исследования в низкотемпературном холодильнике при –140 °C. Контролем служили аналогичные животные, помещаемые в работающую термокамеру без герметизации и теплового воздействия («холостой прогон», позволяющий снизить значимость стрессового фактора на животных). Из исследуемого материала выделяли тотальную РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля согласно протоколу производителя к комплекту реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала «АмплиПрайм РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Москва). Синтез первой цепи кДНК проводили согласно указаниям инструкции «Комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК РЕВЕРТА-L» (ИнтерЛабСервис, Москва).

Амплификацию с последующим определением уровня экспрессии гена HIF-1α крыс проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR, США) с помощью детектирующего амплификатора CFX-96 (Bio-Rad, США) и специфических праймеров и зондов к гену HIF-1α крыс (ДНК-Синтез, Россия). Праймеры для последовательностей HIF-1α и TSPO (гену «домашнего хозяйства») были подобраны с помощью программы Vector NTI. Последовательности мРНК HIF-1α и TSPO были взяты в базе данных NCBI GenBank и синтезированы фирмой ООО «ДНК-Синтез», Москва (табл. 1).

 

Таблица 1. Праймеры и зонды для Real-Time PCR

Table 1. Primers and probes for Real-Time PCR

Исследуемая мишень / Target under study	Олигонуклеотидные праймеры и зонды / Oligonucleotide primers and probes
Ген HIF-1α / HIF-1α gene	HIF_1a_F: 5-ACTCATCATGACATGTTTACTAAAGGAC-3 HIF_1a_R: 5-TGTCAAACGGAAGATGGCAG-3 Z HIF_1a: 5-ROX-TCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGC-BHQ1-3
Ген «домашнего хозяйства» крысы TSPO / TSPO rat “housekeeping” gene	TSPO_F: 5-AGGCTGTGGATCTTTCCAGAAC-3 TSPO_R: 5-GGCTGGGCACCAGAGTGA-3 Z TSPO: 5-FAM-CAATCACTATGTCTCAATCCTGGGTACCCG-BHQ1-3

 

Стадию амплификации кДНК HIF-1α крыс в режиме реального времени проводили в 25 мкл смеси: ПЦР-буфер (×10) — 700 мM Трис-HCl, pH 8,6; 25 °C, 166 мM (NH₄)₂SO₄, 25 мM MgCl₂, 0,2 мM dNTPs, Taq-полимераза, на детектирующем амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad, США). Условия проведения амплификации кДНК HIF-1α с праймерами HIF-1α_F/HIF-1α_R и зонда Z HIF-1α: 95 °C — 15 мин, затем 50 циклов: 95 °C — 30 с, 65 °C — 50 с, 72 °C — 30 с.

Количество исследуемых кДНК (копийных ДНК, полученных из РНК путем обратной транскрипции) в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР. Для оценки уровня экспрессии гена HIF-1α в качестве стандарта сравнения использовался ген TSPO, экспрессия которого

считается стабильной для животного. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводилась с помощью отношения HIF-1α/TSPO.

Критерии соответствия

Критерии включения: беспородные лабораторные крысы-самцы массой на начало исследования 180–210 г, у которых за период наблюдения (карантин 14 дней плюс 12–15 дней после фонового тестирования устойчивости) не выявлены признаки какого-либо заболевания, и рандомизированные по уровню устойчивости к гипертермии в одну из четырех экспериментальных групп по признаку полярности устойчивости организма к экстремальному воздействию.

Критерии невключения: животные, у которых в процессе фонового тестирования устойчивости был выявлен средний (промежуточный) уровень, не позволявший отнести их к категории устойчивых или неустойчивых к гипертермии.

Критерии исключения: животные, у которых во время периода наблюдения были выявлены любые признаки какого-либо заболевания.

Рандомизация животных на группы производилась случайным выборочным методом из сформированных блоков животных с высоким или низким уровнем индивидуальной устойчивости к экстремальному воздействию.

Методы статистического анализа данных

Статистическая обработка полученных результатов проводилась в программной среде процессора таблиц Excel с помощью пакета прикладных программ «Анализ данных» методом дисперсионного анализа ANOVA. Различия между группами оценивались по F-критерию при уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты определения экспрессии генов HIF-1α и TSPO в полярных по уровню устойчивости к гипертермии группах животных представлены в табл. 2–4.

 

Таблица 2. Экспрессия гена TSPO в разных тканях в термокомфортных условиях и после 30-минутного теплового воздействия у животных с разным уровнем устойчивости к гипертермии, тыс. копий, M ± m

Table 2. Expression of TSPO gene in different tissues under thermocomfortable conditions and after 30 minute heat exposure in animals with different levels of resistance to hyperthermia, thousand copies, M ± m

Ткань / Tissue	Термокомфортные условия / Thermal comfort conditions			Гипертермия / Hyperthermia
	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Blood plasma	2,6 ± 0,6	5,0 ± 0,3	+92 %, р = 0,006	4,6 ± 0,6	9,2 ± 0,7	+100 %, р = 0,009
Цельная кровь / Whole blood	142 ± 5	284 ± 4	+99 %, р = 7 · 10–8	261 ± 15	500 ± 25	+91 %, р = 2 · 10–4
Почки / Kidneys	3240 ± 74	4491 ± 42	+54 %, р = 5 · 10–7	4800 ± 400	8249 ± 563	+72 %, р = 0,002
Печень / Liver	954 ± 35	1314 ± 37	+38 %, р = 1 · 10–4	1482 ± 115	2347 ± 172	+58 %, р = 0,004
Сердце / Heart	2203 ± 51	2780 ± 36	+27 %, р = 3 · 10–5	3470 ± 334	3986 ± 303	+15 %, р = 0,29
Мозг / Brain	235 ± 11	372 ± 11	+58 %, р = 2 · 10–5	445 ± 33	813 ± 13	+82 %, р = 1 · 10–4
Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии, ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: LR — low resistant to hypoxia, HR — highly resistant to hypoxia.

 

Таблица 3. Экспрессия гена HIF-1α в разных тканях в термокомфортных условиях и после воздействия гипертермии у животных с разным уровнем устойчивости к тепловому воздействию, тыс. копий, M ± m

Table 3. Expression of HIF-1α gene in different tissues under thermally comfortable conditions and after exposure to hyperthermia in animals with different levels of heat resistance, thousand copies, M ± m

Ткань / Tissue	Термокомфортные условия / Thermal comfort conditions			Гипертермия / Hyperthermia
	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Blood plasma	0,7 ± 0,1	5,8 ± 0,4	+782 %, р = 1 · 10–4	0,7 ± 0,1	23,2 ± 1,7	+3158 %, р = 2 · 10–4
Цельная кровь / Whole blood	114 ± 6	347 ± 23	+204 %, р = 2 · 10–4	653 ± 62	12960 ± 981	+1886 %, р = 2 · 10–4
Почки / Kidneys	1989 ± 47	6029 ± 51	+203 %, р = 4 · 10–4	4454 ± 205	7432 ± 363	+67 %, р = 3 · 10–4
Печень / Liver	12106 ± 462	23318 ± 1575	+93 %, р = 0,001	61568 ± 8442	104330 ± 2974	+69 %, р = 0,005
Сердце / Heart	5304 ± 262	9348 ± 125	+76 %, р = 2 · 10–5	6732 ± 246	15029 ± 928	+123 %, р = 6 · 10–4
Мозг / Brain	53631 ± 2023	112998 ± 1646	+111 %, р = 3 · 10–8	80531 ± 5350	144041 ± 38251	+79 %, р = 0,17
Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии, ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: LR — low resistant to hypoxia, HR — highly resistant to hypoxia.

 

Для финальной оценки экспрессии гена HIF-1α было выполнено его нормирование по экспрессии гена «домашнего хозяйства» TSPO (табл. 4).

 

Таблица 4. Уровень экспрессии гена HIF-1α в разных тканях в термокомфортных условиях и после теплового воздействия у животных с разным уровнем устойчивости к гипертермии, нормированный по активности гена TSPO, отн. ед., M ± m

Table 4. The expression level of HIF-1α gene in different tissues under thermocomfortable conditions and after thermal exposure in animals with different levels of resistance to hyperthermia, normalized by TSPO gene activity, relative units, M ± m

Ткань / Tissue	Термокомфортные условия / Thermal comfort conditions			Гипертермия / Hyperthermia
	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences	НУ / LR	ВУ / HR	различия / differences
Плазма крови / Blood plasma	0,28 ± 0,04	1,17 ± 0,07	+311 %, р = 4 · 10–5	0,16 ± 0,01	2,62 ± 0,24	+1536 %, р = 5 · 10–4
Цельная кровь / Whole blood	0,81 ± 0,06	1,22 ± 0,07	+52 %, р = 0,002	2,52 ± 0,26	26,48 ± 3,02	+949 %, р = 0,001
Почки / Kidneys	0,62 ± 0,03	1,21 ± 0,01	+96 %, р = 4 · 10–6	0,94 ± 0,06	0,91 ± 0,05	–3 %, р = 0,71
Печень / Liver	12,7 ± 0,2	17,8 ± 1,3	+40 %, р = 0,02	42,3 ± 6,2	45,2 ± 2,9	+7 %, р = 0,69
Сердце / Heart	2,40 ± 0,08	3,34 ± 0,05	+39 %, р = 3 · 10–5	2,05 ± 0,31	3,83 ± 0,30	+86 %, р = 0,003
Мозг / Brain	228 ± 7	304 ± 8	+33 %, р = 1 · 10–4	184 ± 14	177 ± 47	–3 %, р = 0,90
Примечание. Группы животных: НУ — низкоустойчивые к гипоксии, ВУ — высокоустойчивые к гипоксии. Note. Groups of animals: LR — low resistant to hypoxia, HR — highly resistant to hypoxia.

 

Уровень устойчивости животных к гипертермии в существенной степени определяется их генетическими особенностями. Даже в термокомфортных условиях экспрессия гена «домашнего хозяйства» TSPO животных с высоким уровнем устойчивости к гипертермии со значительной степенью достоверности отличается от низкоустойчивых животных (в почках, печени и мозге — в среднем на 40–60 %, в сердце — на 25 %). Важно, что даже значения экспрессии этого гена, определяемого в цельной крови или плазме, позволяет дифференцировать группы животных по уровню устойчивости к гипертермии. Интересно, что аналогичное соотношение между животными с высокой и низкой устойчивостью к гипертермии наблюдается и в тканях, полученных сразу после теплового воздействия. Анализ реакции системы геномной регуляции на тепловое воздействие показал, что гипертермия в 1,6–2 раза повышает экспрессию гена TSPO в близкой степени во всех тканях, независимо от уровня устойчивости животных.

Для гена HIF-1α обнаружены аналогичные закономерности, но выраженность их проявлений имеет более существенный (в 1,5–2 раза для термокомфортных условий и в 1,6–2,3 раза для условий гипертермии, особенно для ткани печени и почек) и достоверный характер. Однако реакция генных механизмов на гипертермическое воздействие в группах устойчивых и неустойчивых животных не такая однородная (см. рисунок), как было отмечено для гена TSPO.

 

Рисунок. Коэффициенты реактивности на тепловое воздействие экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в разных тканях в группах высоко- и низкоустойчивых животных (ВУ и НУ соответственно)

Figure. Coefficients of reactivity to thermal effects of the expression of the hypoxia-inducible factor HIF-1α in different tissues in groups of high- and low-resistant animals (RT and RL, respectively)

 

Обращает на себя внимание тот факт, что для низкоустойчивых к гипертермии животных накопление фрагментов HIF-1α в тесте ПЦР выше, чем для высокоустойчивых (за исключением плазмы и цельной крови, для которой у высокоустойчивых животных реактивность на гипертермию была более высокой).

При анализе литературных источников нам не удалось найти работ, решающих в прямой постановке аналогичные задачи. Однако имеются публикации, позволяющие предположить механизм влияния высокого уровня экспрессии HIF-1α на переносимость экстремальных воздействий. Среди них можно выявить несколько групп механизмов, основным из которых является стабилизация митохондриальных функций и энергопродукции. Так, в работе [15] показана способность HIF-1α в большей степени активизировать гликолиз у генетически более устойчивых к гипоксии организмов. Такая активация происходила с использованием сигнального пути mTORC1/eIF4E, а для тканей головного мозга сопровождалась повышенной экспрессией транспортера фруктозы GLUT5 и кетогексокиназы, что свидетельствует об активном вовлечении утилизации фруктозы в качестве резервного источника энергии. Доказана активация альтернативного гликолизу пути утилизации глюкозы с генерацией восстановленных эквивалентов и фосфорибозы — пентозофосфатного метаболического шунта, устойчивого к влиянию к гипоксии и митохондриальным дисфункциям, так как его реакции осуществляются на мембранах эндоплазматического ретикулума клеток [1].

Второй универсальный механизм влияния повышенной экспрессии HIF на устойчивость животных к экстремальным воздействиям — снижение скорости апоптоза клеток, индуцированного экстремальным воздействием (гипертермией, в частности). Показано, что у термоустойчивых животных индукция апоптоза идет медленнее, а уровень экспрессии HIF при этом является достоверно более высоким [10].

Третий универсальный механизм касается не столько механизмов энергопродукции, дефицитной для экстремальных состояний, сколько механизмов нейроадаптации, стабилизации функций нейронов при неблагоприятных воздействиях. Этот механизм раскрыт, в частности, в работе [5].

Представленные данные свидетельствуют, что основным органом, обеспечивающим высокий уровень устойчивости к гипертермии, связанный с базовой (в условиях термокомфорта) экспрессией HIF-1α, является головной мозг. Экспрессия в нем гипоксия-индуцибельного фактора более чем в 300 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства». Вторым по значимости органом служит печень, активность экспрессии в которой HIF-1α более чем 15 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства».

Выявленные особенности могут свидетельствовать, что принципиальные механизмы повышения устойчивости к тепловому воздействию для организмов со сниженным уровнем устойчивости могут протекать за счет активации экспрессии трансляционного фактора HIF-1α во всех органах и тканях, а также о наличии особых механизмов компенсаторно-приспособительных реакций на гипертермию в группе высокоустойчивых животных.

Важным является тот факт, что высокий уровень базовой экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α в повседневных (термокомфортных) условиях может быть предиктором высокого уровня устойчивости данного животного к гипертермии.

Вероятно, для повышения устойчивости организма к экстремальным воздействиям целесообразно использовать медицинские технологии, повышающие уровень экспрессии HIF-1α в повседневных (нормоксических, термокомфортных) условиях в ключевых тканях — головном мозге, печени, миокарде.

ВЫВОДЫ

1. В условиях гипертермии у низкоустойчивых животных отмечается компенсаторно-приспособительная реакция, связанная с активацией механизмов гипоксической защиты в клетках крови, почках и печени, при отсутствии такой реакции в тканях сердца и мозга.
2. Для высокоустойчивых к гипертермии животных характерным являлось существенное (в 30 раз) повышение относительной активности механизмов экспрессии HIF-1α в клетках крови, в 2,5 раза — в клетках печени, и снижение экспрессии на 25 % в почках и практически в 2 раза — в тканях головного мозга.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that there is no conflict of interest.

¹ Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р-53434–2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

² Приказ Минздрава России от 01 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».

About the authors

Aleksey E. Kim

Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: alexpann@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4591-2997

MD, PhD, Associate Professor, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeny B. Shustov

Golikov Research Clinical Center of Toxicology

Email: shustov-msk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5895-688X

MD, PhD. Dr. Med. Sci., Professor, Chief Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Vadim A. Kashuro

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Herzen University

Email: kashuro@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7892-0048

MD, PhD, Dr. Med. Sci., Associate Professor, Head of the Department of Biological Chemistry; Professor of the Department of Anatomy and Physiology of Animals and Humans, Herzen University

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Vyacheslav P. Ganapolsky

Kirov Military Medical Academy

Email: ganvp@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7685-5126

MD, PhD, Dr. Med. Sci., Colonel of the Medical Service, Acting Head of the Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena B. Katkova

Kirov Military Medical Academy

Email: elenaelenakatkova@mail.ru

MD, PhD, Associate Professor, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files