Influence of non-alcoholic fatty liver disease on reproductive function in an experiment

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

В настоящее время неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) занимает лидирующую позицию в структуре заболеваний печени и рассматривается как мультисистемное заболевание, ассоциированное с метаболическим синдромом [10, 12]. Как известно, МС включает такие патологические состояния, как ожирение, инсулинорезистентность (ИР), сахарный диабет 2-го типа, гиперлипидемию и артериальную гипертензию [24].

Общая распространенность НАЖБП в мире в среднем составляет 25,24 %. Наиболее высокая распространенность наблюдается на Ближнем Востоке и в Южной Америке, наиболее низкая — в Африке [25]. По данным Всероссийского эпидемиологического исследования DIREG 2 распространенность НАЖБП в России составляет 37,3 % [9], а в Санкт-Петербурге — 49,1 % [11].

Одна из острых проблем у пациенток с НАЖБП — нарушение репродуктивной функции, в том числе ановуляторный менструальный цикл, гиперандрогенемия, синдром поликистозных яичников, бесплодие [16]. Частота бесплодия в группе женщин с НАЖБП составляет 33,6 % по сравнению с 18,6 % среди женщин с нормальной массой тела [8].

Гиперинсулинемия стимулирует синтез яичниковых андрогенов, а также ингибирует секрецию глобулинов, связывающих половые гормоны в печени, что приводит к увеличению циркуляции свободных андрогенов в кровотоке. Патологическая ИР при беременности может стать причиной развития гестационного сахарного диабета, артериальной гипертензии, привести к прерыванию беременности. Увеличивается риск осложнений и в неонатальном периоде, что связано с нарушениями развития плода, — гипертрофия и гипотрофия плода встречается у женщин с патологической ИР соответственно в 2 и в 3 раза чаще, чем у здоровых женщин [5]. Кроме того, накопление жировых отложений может привести к тканевой гипоксии, митохондриальной дисфункции и развитию окислительного стресса, приводит к активации процессов перекисного окисления липидов [2, 7].

Тем не менее влияние женских половых гормонов на развитие метаболических нарушений у пациенток с НАЖБП не до конца изучено. Для глубокого изучения механизмов взаимосвязи НАЖБП и репродуктивной дисфункции необходим поиск адекватных экспериментальных моделей. В ряде научных исследований была доказана эффективность высококалорийной диеты с повышенным содержанием углеводов («западная диета») [1]. Такая диета приближена к питанию современного человека и считается наиболее подходящей для моделирования НАЖБП. Было также обнаружено, что «диета кафетерия» отрицательно влияет на репродуктивную функцию самок, уменьшая количество ооцитов и толщину фолликулярного слоя [3, 22].

Цель исследования — изучить влияние неалкогольной жировой болезни печени на репродуктивную функцию самок крыс линии Wistar.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 30 самках крыс Wistar, массой тела на момент включения в исследование 220–240 г, на базе научно-исследовательской лаборатории кафедры патологической физиологии с курсом иммунопатологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Животные получены из ФГУП ПЛЖ «Рапполово» РАМН (Ленинградская область). Перед началом исследования его план и стандартные операционные процедуры были рассмотрены и утверждены Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России (№ 09/04 от 11.02.2022).

Животные были разделены на 2 группы:

1. «Контроль» (n = 15) — здоровые, интактные крысы, у которых производили исследование параметров метаболизма для расчета фоновых, референсных значений («нормальные показатели»).
2. «НАЖБП» (n = 15) — крысы, которые на протяжении всего эксперимента в течение 30 дней в качестве корма получали брикеты, содержащие пищевые компоненты в следующих соотношениях (по массе): 26 % белок, 10 % животный жир, 50 % фруктоза, 8 % целлюлоза, 5 % минеральные вещества, 1 % витамины.

Через 30 дней часть животных вывели из эксперимента (5 из контрольной группы, 5 из группы НАЖБП) для оценки параметров метаболизма.

В ходе исследования производили морфометрическую оценку изменения массы тела лабораторных животных, биохимический анализ основных метаболических показателей крови, гистологическое исследование печени. Общепринятыми методами in vitro определяли: уровень глюкозы, общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ).

Для оценки фертильности к оставшимся крысам (n = 10 из контрольной группы, n = 10 из группы НАЖБП) подсаживали интактных самцов (по 1 самцу и 1 самке в клетку). На следующий день производили мазок из влагалища самок и фиксировали наличие в нем живых сперматозоидов (этот день считали первым днем беременности). Через 21 день (срок нормальной беременности у крыс) регистрировали число родивших самок и оценивали количество особей в потомстве. Крысы каждой группы на протяжении беременности получали питание, соответствующее их диете.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения SPSS for Windows 13.0. Сравнение средних данных независимых выборочных совокупностей выполняли с помощью t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении вариант в выборке) и U-критерия Манна – Уитни (при распределении вариант, отличном от нормального). Статистически значимыми изменения принимали при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При воспроизведении НАЖБП у крыс экспериментальной группы были выявлены характерные признаки — висцеральное ожирение, гипергликемия, дислипидемия.

После 30-дневной гиперкалорийной, насыщенной углеводами диеты у животных группы НАЖБП наблюдалось увеличение массы тела на 19 % (300 ± 10 г) по сравнению с контрольной группой (260 ± 7 г) (p < 0,01).

 

Рис. 1. Неалкогольная жировая болезнь печени (аутоптат печени, окраска гематоксилином и эозином, увел. ×40). Мононуклеарная инфильтрация

Fig. 1. Non-alcoholic fatty liver disease (liver autopsy, Hematoxylin-eosin staining, magnification ×40). Mononuclear cell infiltration

 

Основу патогенеза НАЖБП в используемой в исследовании модели поражения печени составляет глубокое нарушение липидного обмена с развитием гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии. Анализ основных биохимических параметров крови выявил статистически значимое повышение уровня ТГ у животных экспериментальной группы (1,13 ± 0,53 ммоль/л) на 24 % по сравнению с контролем (p < 0,01). Регистрировали также статистически значимое повышение уровня ОХ (2,52 ± 0,7 ммоль/л) на 45 % (p < 0,05) и уровня глюкозы (7,25 ± 1,1 ммоль/л) на 42 % (p < 0,05).

Гистологическое исследование также подтвердило различную степень выраженности морфологических изменений в экспериментальной и контрольной группах. У животных группы НАЖБП на гистологических препаратах печени регистрировали мононуклеарную инфильтрацию, гиперемию синусоидов, нарушение балочной структуры (рис. 1). В экспериментальной группе с НАЖБП наблюдалась крупнокапельная жировая дистрофия, которая характеризовалась наличием крупных липидных капель в цитоплазме гепатоцитов со смещением ядра к периферии клетки.

 

Рис. 2. Количество родивших самок крыс в экспериментальной и контрольной группах. *Отличия от группы «Контроль» достоверны на принятом уровне значимости (р < 0,05). НАЖБП — неалкогольная жировая болезнь печени

Fig. 2. The number of females rats who gave birth in the experimental and control groups. *Difference from the “Control” group at the established detection level (р < 0.05). NAFLD — non-alcoholic fatty liver disease

 

По прошествии 21 дня, после того как к оставшимся крысам были подсажены интактные самцы, было получено потомство. В результате развившихся тяжелых метаболических нарушений в группе животных НАЖБ способность к оплодотворению снизилась на 80 % по сравнению с контрольной группой. Все крысы (100 %) контрольной группы забеременели (n = 10), из группы НАЖБП (n = 10) — лишь 2 (20 %) (рис. 2).

У двух родивших крыс из группы НАЖБП родилось по 4 крысенка. В контрольной группе количество крысят в потомстве составило 9 ± 2 особи (рис. 3).

 

Рис. 3. Количественное сравнение родившихся особей в потомстве у экспериментальной и контрольной групп. *Отличия от группы «Контроль» достоверны на принятом уровне значимости (р < 0,05). НАЖБП — неалкогольная жировая болезнь печени

Fig. 3. Quantitative comparison of born individuals in offspring in experimental and control groups. *Difference from the “Control” group at the established detection level (р < 0.05). NAFLD — non-alcoholic fatty liver disease

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование фруктозоиндуцированной модели НАЖБП приводило к развитию основных компонентов метаболическим синдромом: НАЖБП, ожирению, дислипидемии, инсулинорезистентности. Как известно, метаболизм фруктозы значительно влияет как на липидный гомеостаз, так и на обмен глюкозы [14, 19]. Прием фруктозы усиливает липогенез de novo в гепатоцитах, что приводит к накоплению свободных жирных кислот (СЖК) [4, 7].

У животных экспериментальной группы развилась гипергликемия, вследствие развития инсулинорезистентности. Она может быть вызвана снижением как чувствительности клеток-мишеней к инсулину, так и рецепторов инсулина [13]. Гипертрофия жировой ткани сопровождается снижением продукции противовоспалительного адипонектина и увеличением продукции провоспалительных фактора некроза опухоли альфа, интерлейкина 6, лептина, резистина, которые снижают чувствительность тканей к инсулину. Предыдущие эксперименты также доказывают развитие инсулинорезистентности у животных с НАЖБП [1, 17]. Есть данные, подтверждающие увеличение числа апоптотических фолликулов у крыс с НАЖБП по сравнению с контрольной группой [6, 15].

Анализ полученных данных позволяет сделать заключение о снижении фертильности самок крыс с НАЖБП, о чем свидетельствует снижение количества родивших самок, а также уменьшение числа особей в потомстве.

Результаты настоящего эксперимента коррелируют с данными клинических исследований [7, 18, 20]. Механизмы зависимости снижения фертильности при НАЖБП сложны и многофакторны: гормональные изменения могут привести к ановуляции, снижению качества ооцитов и восприимчивости эндометрия. Одним из механизмов повреждения органелл ооцитов является липотоксичность. Избыток СЖК накапливается в виде ТГ в адипоцитах, где они оказывают повреждающее действие на клетки. При снижении способности адипоцитов аккумулировать ТГ, СЖК концентрируются в других тканях, в частности в ооцитах, оказывая токсическое действие [18, 23]. СЖК повышают количество активных форм кислорода, которые способны вызывать окислительный стресс митохондрий [7, 21].

Нередко у женщин с НАЖБП диагностируют синдром поликистозных яичников, недостаточность лютеиновой фазы менструального цикла, гирсутизм, вирилизацию, гиперпластические процессы эндометрия с повышенным риском развития рака эндометрия. Все эти состояния отрицательно влияют на фертильность [20].

ВЫВОДЫ

Результаты настоящего исследования подтверждают, что использование гиперкалорийной, насыщенной углеводами диеты у крыс приводит к развитию НАЖБП, основными проявлениями которой являются: висцеральное ожирение, дислипидемия, инсулинорезистентность, гипергликемия. Данная диета максимально приближена к современному питанию большинства людей.

Результаты эксперимента доказывают, что развитие НАЖБП оказывает негативное влияние на репродуктивную функцию самок лабораторных крыс, что выявляется в статистически значимом снижении числа беременностей в экспериментальной группе и уменьшении числа особей в потомстве родивших самок с НАЖБП.

Применяемая в исследовании модель НАЖБП может быть использована для дальнейшего изучения ее влияния на репродуктивную систему, а также для исследования потенциальных подходов к профилактике и лечению возникающих метаболических нарушений.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. All authors made significant contributions to the development of the concept, research and preparation of the article and approved the final version before publication.

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the study.

About the authors

Tatiana V. Brus

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: bant.90@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7468-8563
SPIN-code: 9597-4953

MD, PhD, Associate Professor, Department of Pathological Physiology with the course of Immunopathology

Russian Federation, 2 Litivskaya st., Saint Petersburg, 194100

Anna A. Kalinina

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: aa_kalinina@list.ru

4^th year student of the pediatric faculty

Russian Federation, 2 Litivskaya st., Saint Petersburg, 194100

Anastasia A. Bannova

S.I. Georgievsky Order of the Red Banner of Labor Medical Institute, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: bannova06@list.ru
ORCID iD: 0009-0007-6867-9477

1^st year student of the 1^st medical faculty

Russian Federation, Simferopol

Rodion V. Korablev

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: rodion.korablev@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-5754-8437
SPIN-code: 4969-6038

MD, PhD, Associate Professor, Department of Pathological Physiology with the course of Immunopathology

Russian Federation, 2 Litivskaya st., Saint Petersburg, 194100

Yurii S. Brus

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: brusyury@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-8932-8076
SPIN-code: 4256-9672

Master's student at the Department of Public Health and Healthcare

Russian Federation, 2 Litivskaya st., Saint Petersburg, 194100

References

Supplementary files