Free bone grafting of the distraction regenerate with delayed bone formation

Full Text

По данным областной травматологической МСЭК, травмы и заболевания костно-мышечной системы с 1993 г. прочно занимают второе место в структуре причин инвалидности по Иркутской области. В 46% случаев отмечено замедленное сращение переломов конечностей, в 4,9% — формирование ложных суставов [6]. Такая частота неудовлетворительных результатов лечения закономерно побуждает к выявлению их причин и поиску на этой основе новых путей решения проблемы.

Одна из главных причин неудовлетворительных результатов хирургического лечения повреждений и заболеваний опорно-двигательного аппарата состоит в недооценке клиницистами современных оперативных технологий, обеспечивающих оптимальные, научно обоснованные условия для репаративной регенерации опорных органов и тканей. Другой причиной является ограниченная возможность органотипической перестройки крупных ауто-, алло-, ксенотрансплантатов и неспособность организма к замене их на новую кость [13, 16].

За 50 лет применения системы управляемого чрескостного остеосинтеза в эксперименте и клинике вскрыта и по-новому оценена роль биологии кости, доказано важное значение сберегательной тактики в отношении кости как органа, сохранения кровоснабжения остеогенных тканей с обеспечением статодинамической нагрузки. Исходы лечения больных с ортопедической патологией за эти годы улучшились, и при дифференцированном отборе пациентов для операции процент благоприятных результатов приближается к 100. Однако переоценка дистракции как фактора, стимулирующего остеогенез, механический перенос метода на тяжелую патологию — последствия травм с нарушением кровоснабжения, осложнением гнойной инфекцией, а также удлинение конечностей на большие величины приводят к увеличению сроков реабилитации, при этом неудовлетворительные результаты лечения составляют от 5 до 28%, включая замедленное образование регенерата [2, 5, 9, 10].

В настоящее время в клинической практике применяются различные способы активизации репаративной регенерации костной ткани: от терапевтического воздействия на организменном уровне до местных ортопедических воздействий, в число которых входят различные варианты костной пластики. Пластика в дистракционный регенерат в ортопедии явление новое и малоизученное [1, 4, 11, 12]. Исследования по оптимизации биомеханического комплекса условий для заживления костной раны и поиск путей биологической стимуляции продолжаются и сегодня [8, 14, 15].

В настоящей работе изучались вопросы создания минерального депо в органическом матриксе формирующейся кости при дистракции, судьба мелких аутотрансплантатов и кальцификация дистракционных регенератов.

Материал и методы

Выполнено 60 экспериментов на животных и проведен анализ лечения 12 больных.

В эксперимент брались животные (кролики) в возрасте от 1 года до 1,5 лет с длиной голени от 11 до 13 см.

В стерильных условиях накладывали экспериментальный аппарат Илизарова, производили остеоперфорацию с остеоклазией в средней трети костей правой голени (рис. 1) и на 5-е сутки после операции начинали листракцию.

 

Рис. 1. Рентгенограмма голени кролика после операции.

 

В соответствии с задачами эксперимента животные были разделены на три серии (по 20 кроликов в каждой). В I серии голень удлиняли со скоростью 1 мм в сутки (0,8% от длины сегмента) в течение 10 дней. Дистракцию осуществляли дробно по 0,25 мм 4 раза в день. Во II серии удлинение голени производили за 5 дней, со скоростью 2 мм в сутки (1,6% от длины сегмента) — также дробно по 0,25 мм 8 раз в день. В III серии после удлинения голени за 5 дней на заданную величину (10 мм) выполняли еще одну операцию — трансплантацию в середину дистракционного регенерата участка малоберцовой кости (0,7×0,3×0,2 мм) контралатеральной конечности.

Животных выводили из опыта на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 и 55-е сутки после операции быстрым внутриплевральным введением большой дозы тиопентал-натрия. Вырезали образцы тканей и фиксировали их в 10% растворе нейтрального формалина. Затем часть образцов погружали в 1% раствор четырех- окиси осмия на фосфатном буфере, обезвоживали и заключали в эпон.

Полутонкие и ультратонкие срезы готовили без декальцинации регенератов на ультрамикротомах «LKB Ultrotomi III 8800» и «LKB Bromma Ultrotomi Nova» с помощью стеклянных и алмазных ножей «LKB JUMDI». Полутонкие срезы толщиной 1- 2 мкм окрашивали толуидиновым синим и метиленовым синим (Уикли Б., 1975), гематоксилином и эозином. Ультратонкие срезы контрастировали растворами уранилацетата и растворами свинца на приборе «LKB Bromma 2168 Ultrostainer» и изучали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B.

Поверхности блоков, отполированные в процессе изготовления полутонких и ультратонких срезов, и поверхности продольных распилов регенератов и большеберцовых костей интактных животных, отполированные мелкоабразивными материалами, напыляли для создания электро- и теплопроводности тонким слоем меди в вакуумном напылителе JEE-4X/5B. Подготовленные образцы изучали в отраженных электронах при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840, что позволяло выявлять участки, обладающие различной плотностью и различающиеся по степени минерализации. При этом получали изображения, аналогичные микрорентгенограммам, но с гораздо большими пространственным разрешением и четкостью.

Заливочную среду с образцов после исследования в отраженных электронах удаляли насыщенным раствором этиолята калия. Для выявления топографии рельефа минерализованных структур (костных трабекул и стенок остеонов) мягкотканные компоненты удаляли путем дозированной мацерации 6% раствором гипохлорита натрия в течение 6-8 ч при температуре 4-5°С. Затем образцы тщательно промывали дистиллированной водой, обрабатывали по методике замораживания—высушивания и изучали в сканирующем электронном микроскопе во вторичных электронах.

Исследования проводили на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе LINK 860-500, смонтированном на сканирующем электронном микроскопе JSM-840, при ускоряющем напряжении 20 кэВ и токе пучка, обеспечивающем скорость счета 2000-3000 имп/с.

С помощью качественного микроанализа по программе «Х-Ray Analyser» выявляли присутствующие в образце элементы, идентифицируя на рентгеновском спектре характеристические пики для каждого элемента. По набору программ «ZAF- 4/FLS» определяли концентрацию кальция. По набору программ «МАР» и «DIGIMAP» получали изображения анализируемых участков в характеристическом рентгеновском излучении кальция, которые визуализировали концентрацию изучаемого элемента в тест-объемах различных участков регенератов.

 

Рис. 2. Карта рентгеновского электронно-зондового микроанализа гистотопографического блока большеберцовой кости после 10 дней удлинения. Проксимальная часть регенерата. Ув. 12. 1 — костная ткань (корковый слой большеберцовой кости); 2 — новообразованные костные трабекулы слабоминерализованной консистенции, врастающие в диастаз и ориентированные по вектору силы растяжения; 3 — более минерализованные трабекулы.

 

Для анализа изображении использовали гистограммы. Измеряли содержание кальцифицированных в различной степени компонентов и их долю в общем объеме костной ткани. Получали также многоэлементные карты, которые строили посредством компьютерного назначения различных цветов разным элементам (рис. 2). Эти карты не содержали информации о концентрации элементов, но были полезны для определения наличия связи различных химических элементов друг с другом. Количественные данные обрабатывали статистически. Достоверность отличий определяли по параметрическому критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона—Манна—Уитни.

Результаты

На основании рентгенологических, морфологических данных и результатов рентгеновского сканирования в I серии опытов выявлено, что при дозированном удлинении голени на 10 мм между отломками формируется дистракционный регенерат с четкой зональной структурой на 10-е сутки периода дистракции (рис. 3, а). К 45-му дню опыта (30 дней фиксации) регенерат имеет замыкательную пластинку и начинает формироваться костномозговой канал (рис. 3, б). На 30-е сутки фиксации клинически подвижности в зоне дистракционного регенерата не определялось и аппарат демонтировали.

 

Рис. 3. I серия опытов. Гистотопограммы: а — 10 дней дистракции (1 — периостальная часть регенерата); б — 30 дней фиксации.

 

Во II серии опытов — при большей скорости удлинения (2 мм в сутки) животные хуже переносили период дистракции. Формирование регенерата затягивалось во времени, структурная организация его проявлялась только к 10-20-м суткам периода фиксации при сниженном по сравнению с I серией содержании кальция на протяжении опыта на 10-12% (рис. 4).

 

Рис. 4. II серия опытов. Гистотопограммы (а, в) и карты рентгеновского электронно-зондового микроанализа гистотопографического блока большеберцовой кости (б, г). а, б — 20-е сутки, в, г — 30-е сутки фиксации. 1 — периостальные трабекулярные структуры; 2 — срединная прослойка; 3 — эндостальные трабекулы, переходящие в «мостики», соединяющие отделы регенератов.

 

При исследовании недекальцинированных полутонких срезов дистракционных регенератов отмечалась та же тенденция к нарастанию минерализации срединной прослойки к 25-м суткам фиксации, что и в I серии эксперимента, однако процентное содержание кальцифицированной ткани было значительно ниже (рис. 5).

 

Рис. 5. Содержание кальцифицированной ткани (в %) в средней зоне дистракционных регенератов. Д — дистракция; Ф — фиксация; ДА — демонтаж аппарата.

 

При демонтаже аппарата на 30-е сутки фиксации (40 дней опыта) полного формирования кортикальной пластинки не происходило, отмечалась амортизирующая подвижность в зоне регенерата.

В III серии опытов после 5 дней удлинения голени производили трансплантацию аутокости в дистракционный регенерат. При сниженном темпе формирования регенерата и его структурной организации в периоде дистракции в данной серии на 10-е сутки фиксации остеогенез опережал течение этого процесса в предыдущих группах и по структурной характеристике соответствовал 30-м суткам фиксации во II серии.

На 10-е сутки фиксации аутотрансплантат был окружен мелкопетлистой ячеистой губчатой костью так, что было трудно определить его границы (рис. 6). На 20-е сутки периода фиксации клинически подвижности в зоне регенерата не отмечалось. Аппарат демонтировали. На гистотопограммах определялась сформированная кортикальная пластинка, а при рентгеносканировании — зрелая костная ткань по всему поперечнику регенерата, что опережало подобные результаты в I серии опытов на 15, а во II серии на 20 дней.

Обсуждение

Особенностью формирования новообразованной кости являлось то, что ведущим источником костеобразования был периост, кость в зоне удлинения увеличивалась в половину диаметра. В процессе формирования новой кости во всех сериях опытов происходила последовательная смена клеточных элементов от малодифференцированных фибробластоподобных клеток до остеоцитов. В начальном периоде дистракции (10-е сутки опыта) остеобласты были функционально неоднородны. Наиболее активные синтезировали белок, шли процессы образования волокон и их минерализации с участием остеоцитов, особенно во второй половине периода дистракции (13—17-е сутки опыта) и в начале фиксации, когда в регенерате еще сохранялись очаги мягкотканной прослойки и слабоминерализованных костных трабекул.

 

Рис. 6. III серия опытов. Гистотопограммы (а—в) и карты рентгеновского электронно-зондового микроанализа гистотопографического блока большеберцовой кости (г, д). а — после пластики; б — 10-е сутки, в, г — 20-е сутки, д — 30-е сутки фиксации. 1 — аутотрансплантат; 2 — неминерализованные трабекулы; 3 — срединная прослойка.

 

Для дистракционных регенератов были характерны зональное строение и продольная ориентация трабекул. Середину регенерата занимала коллагеноволокнистая прослойка со слабо кальцифицированной тканью, особенно во II серии опытов (см. рис. 4, б, г).

При исследовании недекальцинированных полутонких срезов дистракционных регенератов выявлялась интенсификация процессов биосинтеза сульфатированных гликозаминогликанов клетками срединной прослойки с накоплением их в межклеточных пространствах.

Степень минерализации в середине регенерата, по данным рентгеносканирования, в I серии опытов нарастала от 46,3% в конце периода дистракции до 66,2% к концу периода фиксации и снятию аппарата. Во II серии отмечалась та же тенденция к нарастанию минерализации срединной прослойки к 25-м суткам фиксации, но процентное содержание кальцифицированной ткани было снижено по сравнению с I серией (см. рис. 5).

Изменение темпа дистракции (2 мм в сутки) и проведенное комплексное исследование в динамике позволили выделить критерии компрометированного костеобразования по рентгеноморфологическим признакам (широкая прослойка, биосинтетическая деятельность остеобластов, активность фибробластов) и по микроэлементному составу новообразованной ткани в диастазе и в плазме крови.

Однотипные признаки компрометированного костеобразования в диастазе у 20 кроликов II серии послужили основой для выполнения III серии опытов с помещением в срединную зону регенерата костного аутотрансплантата, рассматриваемого главным образом как депо минералов. В перестройке аутотрансплантата наблюдалась синхронизация деструктивных и репаративных процессов, отмеченная ранее [3] при дистракции частично васкуляризованного трансплантата в дефекте. На 7-12-е сутки фиксации по периметру трансплантата встречались остеокласты, погибшие остеобласты и микрососуды. Содержание кальция в III серии опытов на 10-й день фиксации превышало показатель II серии на 28,2% и I серии на 25,3%, а на 25-е сутки фиксации — соответственно на 30,2 и 28,3%.

Динамика увеличения содержания кальция и ускорение процесса минерализации при компрометированном остеогенезе после трансплантации в дистракционный регенерат аутокости свидетельствуют о стимулирующем действии последней. Конечный результат в этой серии опытов достигнут на 10-15 дней раньше, чем в других сериях.

На основании проведенных исследований был предложен способ лечения (приоритетная справка по заявке № 98104055 от 18.02.98), примененный нами у 12 пациентов в периоде фиксации. После трансплантации в дистракционный регенерат величиной 6-8 см аутокости фиксация прекращена через 30 дней у 4 больных, через 60 дней у 6 и через 90 дней у 2. После снятия аппарата иммобилизация конечности не проводилась.

Выводы

1. Дистракция оказывает формообразующее влияние на объемно-пространственную организацию регенерирующей костной ткани с преобладающим источником костеобразования у кролика со стороны периоста.
2. Увеличение темпа удлинения более чем до 1% от длины сегмента в сутки ведет к замедлению образования и органотипической перестройки дистракционного регенерата.
3. Клеточный состав срединной прослойки дистракционного регенерата меняется по мере его «созревания» от фибробластоподобных клеток, фибробластов, разной степени активности остеобластов (период дистракции) до остеоцитов (период фиксации).
4. Перестройка аутотрансплантата в коллагеноволокнистой прослойке регенерата начинается с гибели остеоцитов трансплантата, врастания в него капилляров и микроразрушений минерализованных структур остеокластами. Деструктивно-репаративный процесс протекает синхронно.
5. Содержание кальция в средней зоне регенерата по периодам удлинения конечности изменяется с разной скоростью и неоднозначно. Дистракция с ежедневным приростом в 1,6% от длины сегмента сопровождается уменьшением содержания кальция на 10-12%.
6. После удлинения голени у кроликов на 10 мм содержание кальция в регенерате составляет при темпе дистракции 1 мм в сутки 66,2%, 2 мм в сутки — 56,8%, при трансплантации аутокости- 73,7%. Органотипическая перестройка дистракционного регенерата после костной аутопластики ускоряется в эксперименте на 10-15 дней; в клинической практике после аутотрансплантации возможно прекращение фиксации через 1-2 мес.

About the authors

A. A. Barabash

Institute of Traumatology and Orthopedics, Scientific Center for Reconstructive and Reconstructive Surgery, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Irkutsk

References

Supplementary files