Full -Function Restoration of Achilles Tendon with Nanofibrous Implant (experimental study)

Full Text

Введение. Разработка эффективных материалов для пластики и реконструкции поврежденных связок и сухожилий является одной из самых актуальных задач современной спортивной медицины, травматологии и ортопедии [1-4]. Несмотря на острый дефицит материалов для замены или реконструкции поврежденных связок и/или сухожилий, имеющиеся на сегодняшний день биоимплантаты недостаточно эффективны для хирургического восстановления связок и сухожилий, особенно при их обширном/тотальном повреждении. Данное обстоятельство объясняется, прежде всего, недостаточностью знаний о механизмах биоинтеграции имплантированных материалов в организме реципиента и отсутствием четкого понимания того, каким должен быть материал для восстановления связок и сухожилий [4]. На сегодняшний день особый практический интерес представляют неиммуногенные искусственные или биоискусственные имплантаты для регенерации сухожильно-связочного аппарата, способные обеспечивать выполнение функции поврежденной ткани в начальный период времени после имплантации, и одновременно индуцировать морфофункциональное восстановление сухожилий/связок. Ранее авторами работы было предложено использовать для этих целей изготовленный способом электроформования нановолоконный имплантат из полигидроксибутирата (ПГБ) [5-8]. Разработанный композиционный имплантат состоял из опорных полиамидных нитей и кондуктивного биорезорбируемого нановолоконного материала. Было показано, что уже по истечении 6 нед после внедрения имплантата в область тотально иссеченного ахиллова сухожилия происходит формирование соединительнотканной структуры, соединяющей икроножную мышцу с пяточным бугром и обеспечивающей функциональную роль ахиллова сухожилия у крыс. При этом было отмечено, что нерезорбируемые опорные нити к 6-й неделе после имплантации прорезали мышечную и хрящевую ткань и не обеспечивали связывание мышцы с пяточным бугром. Следующим шагом нашей работы стало создание полностью резорбируемого имплантата для регенерации связок и сухожилий, в котором опорные нити были заменены на рассасывающийся полигликолидный шовный материал. Цель работы заключалась в выявлении принципиальной возможности индукции морфофункционального восстановления тотально иссеченного ахиллова сухожилия у крыс путем замещения нановолоконным имплантатом на основе ПГБ, изготовленного с применением резорбируемых опорных нитей. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В работе использовали имплантат, изготовленный подобно тому, как описано ранее [5-8], но с применением в качестве опорных нитей шовного материала Дар-Вин USP 5/0, представляющего собой синтетическую рассасывающуюся нить со сроком резорбции 60-90 дней и сроком сдерживания 21-28 дней. Исследование регенерационного потенциала сухожильных имплантатов проводили на модели тотального дефекта ахиллова сухожилия у крыс линии Wistar (самцы, масса тела 180-200 г), который создавали полным иссечением ахиллова сухожилия от икроножной мышцы до пяточного бугра [9]. Для оценки эффективности восстановления ахиллова сухожилия использовали 2 группы животных по 5 особей в каждой. В опытной группе на обеих задних конечностях крысы полностью иссекали ахиллово сухожилие (рис. 1, а, б). Далее в правой конечности на место иссеченного сухожилия (к икроножной мышце и к пяточному бугру) фиксировали нановолоконный имплантат на опорных нитях (рис. 1, в), а в левой конечности аналогичным образом фиксировали только опорные нити без нановолоконного материала. В отличие от опытной группы во второй группе в правой задней конечности после тотального иссечения сухожилия также фиксировали нановолоконный имплантат (контроль 1), в то время как левая задняя конечность оставалась интактной. В третьей экспериментальной группе правая задняя конечность крыс подвергалась только тотальному иссечению ахиллова сухожилия (без имплантата или опорных нитей, контроль 2), при этом левая задняя конечность оставалась интактной. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. До и после операции животных содержали в стандартных условиях вивария (корм - ad libitum). Все оперативные вмешательства проводили в асептических условиях под ксилазин/золетиловым наркозом. Для выполнения комплексного гистологического анализа использовали продольные криосрезы нативных сухожилий и экспериментальных образцов новообразованных регенератов, которые подвергали стандартному (гематоксилин и эозин) и дифференциальному (трихром по Лилли, трихром по Массону) гистологическому окрашиванию. Гистотопограммы экспериментальных образцов получали с помощью ПрО NIS-Elements микроскопической станции Nikon Ti-E (Япония). Количественную оценку возможной патологической минерализации в образцах до и после имплантации проводили методом адсорбционной спектроскопии, используя планшетный ридер Infinity F200 («TECAN», Австрия) и стандартный набор Calcium AS FS (Arsenazo III; DiaSys, Германия). Определяли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков для выявления разницы в полученных результатах использовали U-критерий Манна - Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Визуальная оценка поведения всех прооперированных животных и анализ их передвижений проводились на протяжении всего эксперимента. Так же, как и в предыдущем исследовании [5], было отмечено, что, начиная со 2-й недели после имплантации, животные из опытной группы начинали активно использовать для передвижения конечность с замененным на нановолоконный имплантат сухожилием. Начиная с 4-й недели после имплантации, не было разницы в использовании интактных и прооперированных с использованием нановолоконного имплантата конечностей. В отличие от вышесказанного, те животные, у которых ахиллово сухожилие иссекали полностью и не протезировали либо протезировали только опорными нитями, при движении подволакивали эти лапы, приоритетно используя интактные или с внедренным имплантатом конечности. В соответствии с поставленными задачами и требованиями стандартов ISO 10993, эксплантация проводилась на сроках как 6, так и 13 нед (13 нед - это пограничный срок выявления последствий субхронической токсичности исследуемых материалов, а также предельный срок исследования эффекта имплантации для резорбируемых материалов) [10, 11]. В образцах, полученных на обоих сроках, мы обнаружили соединительнотканные регенераты на месте всех ПГБ-имплантатов. Макроскопически эти структуры были схожи с нативным сухожилием (рис. 2). Ни в одном из образцов признаков сохранения нановолоконного материала и опорных нитей обнаружено не было, т. е. уже к 6-й неделе после имплантации имела место полная резорбция нановолокон ПГБ. При гистологическом анализе структуры матрикса 6-недельного неорегенерата и нативного сухожилия было отмечено, что структура новообразованной ткани морфологически была сходна с нативным сухожилием; новообразованный матрикс был преимущественно коллагеновой природы и состоял из утолщенных, но достаточно структурированных и упорядоченных волокон (рис. 3). Также было отмечено, что матрикс регенерата был насыщен эозинофильными областями, свидетельствующими о выраженном процессе перифокального формирования волокнистой соединительной ткани, был неоваскуляризован и равномерно содержал большое количество клеток в структурированном внеклеточном матриксе уже к 6-й неделе после имплантации подобно нативному сухожилию (рис. 3, в, г). В криосрезах регенератов хорошо визуализировались вытянутые вдоль по длине коллагеновых волокон ядра клеток, что морфологически подобно расположению тендиноцитов в нативном хряще (см. рис. 3, б, г). Из представленных рисунков также видно, что, несмотря на столь малый срок после тотального иссечения нативного сухожилия, общая картина новообразованного регенерата во многом морфологически сходна с таковой контрольного нативного сухожилия. Гистологический анализ дифференциально окрашенных срезов показал, что в новообразованном регенерате пучки волокон коллагена ориентированы непосредственно вдоль линии нагрузки (оси напряжения) на сухожилие, что соответствует ориентации волокон, характерной для нативного сухожилия, однако сами пучки упорядочены хуже, чем в контрольном образце, и визуально выглядят массивнее. При этом между пучками волокон неорегенерата, в аналогии с нативным сухожилием, расположены тендиноцитоподобные, вытянутые вдоль длинника волокна клетки (см. рис. 3). В дистальных отделах неорегенератов в непосредственной близости от сесамовидного хряща пяточного бугра волокнистая структура новообразованного сухожилия перемежалась тяжами новообразованной хрящевой ткани, свидетельствующей об активном процессе полноценной регенерации (см. рис. 3, б). С целью выявления признаков патологического асептического кальциноза исследуемых имплантатов в организме реципиента мы проводили количественное измерение содержания минерализованного кальция в образцах неорегенератов спустя 6 и 13 нед после имплантации. Было установлено статистически значимое (p<0,05) отсутствие признаков минерализации неорегенератов и окружающих их тканей - содержание минерализованного кальция составило 0,1±0,2 и 0,2±0,2 мг кальция на 1 г сухого веса ткани в опыте и контроле (нативное сухожилие) соответственно. Полученные результаты указывают на перспективность применения нановолоконных имплантатов для морфофункционального восстановления связок и сухожилий при больших повреждениях. Для выявления механизмов этого процесса, его динамических характеристик требуются дальнейшие исследования. Важно выполнить также сравнительные исследования восстановления связок и сухожилий с использованием нановолоконного имплантата у молодых и пожилых экспериментальных животных. И, наконец, большой интерес представляют клинические исследования восстановления сухожильно-связочного аппарата различной локализации при повреждениях больших размеров. Наши последующие исследования будут направлены на решение перечисленных задач. Заключение. В ходе настоящей работы установлено, что через 6 нед после имплантации предложенной конструкции на ее месте формируется соединительнотканный регенерат, полноценно выполняющий функцию ахиллова сухожилия, и в этом регенерате в основном присутствуют зоны, содержащие упорядоченные волокна с организацией, подобной таковой в нативном сухожилии, что максимально выражено в местах сужения перед энтезисом, а также участки внедрения/новообразования хрящевой ткани, также свойственной нормальному нативному сухожилию. Учитывая тот факт, что после тотального удаления нативного сухожилия прошло всего 6 нед, архитектоника новообразованного регенерата является необычайно структурированной и функционально сбалансированной.

About the authors

A. S Senotov

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Pushchino, Russia

A. A Ol’khov

Plekhanov Russian University of Economics

Moscow, Russia

E. D Sklyanchuk

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov

Moscow, Russia

I. S Fadeeva

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Pushchino, Russia

R. S Fadeev

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Pushchino, Russia

N. I Fesenko

Pushchino State Institute of Natural Sciences

Pushchino, Russia

A. A Prosvirin

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov

Moscow, Russia

M. V Lekishvili

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics; Institute of Applied Economic Research

Moscow, Russia

V. V Gur’ev

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov

Moscow, Russia

A. L Iordanskiy

Semenov Institute of Chemical Physics

Moscow, Russia

V. S Akatov

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: akatov.vladimir@gmail.com
Pushchino, Russia

References

Supplementary files