Elaboration of New Treatment Methods for Spinal Cord Injuries Using Magnetic Nanoparticles in Combination with Electromagnetic Field (Experimental Study)

Full Text

Введение. В настоящее время травма спинного мозга остается одной из наиболее значимых проблем в медицине, не имеющих эффективного решения. От последствий травм спинного мозга страдает до 2,5 млн человек во всем мире, при этом каждый год новые травмы получают до 130 000 человек [1]. В большинстве случаев повреждение спинного мозга приводит к инвалидизирующим осложнениям, в том числе потере моторных функций и чувствительности, нарушению функций тазовых органов и дыхательной функции. Несмотря на значительный прогресс в уходе за пациентами и совершенствование реабилитационных мероприятий, необходимость в разработке методик, способствующих регенерации нервной ткани у пациентов с повреждениями спинного мозга, не вызывает сомнения. В отличие от периферической нервной системы способность нейронов зрелой ЦНС млекопитающих к регенерации крайне ограничена. Существенный рост аксонов нервных клеток спинного мозга после их пересечения наблюдается только на ранних стадиях развития [2, 3]. На более поздних стадиях «прорастанию» аксонов в области повреждения ЦНС препятствует глиальная рубцовая ткань, которая выполняет функцию ограничения объема тканевого повреждения, предотвращая распространение воспаления и возможность инфекции. С другой стороны, результатом этого процесса является формирование непреодолимого для регенерирующих аксонов барьера, предотвращающего удлинение конусов роста аксонов как механически, так и биохимически [4, 5]. Экспериментальные исследования последних лет были направлены на изучение и стимуляцию механизмов регенерации нервной ткани ЦНС, большинство из которых концентрировалось на клеточных и молекулярных терапевтических методиках [6-14]. Однако известно, что, помимо биохимических сигналов, процесс удлинения конусов роста также подвержен влиянию механических сил [15-18]. Магнитные наночастицы (МНЧ) широко применяются в экспериментальных исследованиях новых методов магнитно-резонансной диагностики, таргетной доставки препаратов, биоинженерных разработках, культивировании клеток [19-23]. Их малые размеры, высокая степень биосовместимости, возможность поверхностной модификации и, что особенно важно, способность взаимодействовать с внешним магнитным полем отвечают требованиям, предъявляемым к средствам для механической стимуляции роста аксонов. Настоящее исследование направлено на определение эффективности применения МНЧ с целью восстановления двигательных функций лабораторных животных после пересечения спинного мозга за счет стимуляции удлинения аксонов in vivo в условиях воздействия внешнего магнитного поля. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Исследование одобрено этическим комитетом ЦИТО им. Н.Н. Приорова. Работа проведена на 72 взрослых (8-10 недель) самках лабораторных крыс породы Wistar массой 220-310 г. Эксперименты выполняли в соответствии с «Рекомендациями комитета по этике, проводящего экспертизу биомедицинских исследований» (ВОЗ, 2000). Животных содержали при температуре 23°C в условиях 12-часового дневного цикла и стандартной диеты. Все животные разделены на экспериментальную и контрольную группы, каждая из которых была разделена на 3 подгруппы в зависимости от объема повреждения спинного мозга - 50, 80 или 100%. Всем животным экспериментальных подгрупп в область повреждения через подшитый катетер вводили суспензию МНЧ (Fe3O4, 10-50 нм в диаметре) каждые вторые сутки в течение 4 нед (подгруппы 50%+МНЧ, 80%+МНЧ и 100%+МНЧ). Животным контрольных подгрупп в соответствующие сроки вводили физиологический раствор, не содержащий МНЧ (подгруппы 50%, 80% и 100%). Животных как контрольной, так и экспериментальной группы подвергали воздействию внешнего магнитного поля (постоянный ток, 3мТ) в течение 5 ч каждые вторые сутки на протяжении 4 нед. Магнитное ядро наночастиц синтезировали с помощью модифицированной методики. Растворы солей железа FeCl3•6H2O (4 мл, 2 M) и FeCl2•4H2O (2 мл, 2 M) добавляли в колбу с 250 мл воды и перемешивали 45 мин при комнатной температуре. Затем в систему добавляли при непрерывном перемешивании по каплям водный раствор аммиака (100 мл, 1 M), пока рН раствора не достиг 10. Через 30 мин наблюдали выпадение черного осадка наночастиц Fe3O4. Наночастицы собирали осаждением на магните, многократно промывали водой, высушивали в вакуумной печи и редиспергировали в растворе с нужной концентрацией при помощи ультразвука. Все оперативные вмешательства проводились двумя хирургами при помощи хирургического микроскопа в асептических условиях с поддержанием температуры тела животных на уровне 38°C. Перед операцией животных наркотизировали путем интраперитонеального введения ксилазина (10 мг/кг) и кетамина (100 мг/кг). Дополнительные дозы препаратов вводили по необходимости. Кожу в области грудного отдела позвоночника тщательно выбривали и обрабатывали раствором йода и 70% спирта. Выполняли разрез кожи на протяжении 4 см по срединной линии, выделяли задние элементы позвоночника, на уровне Th9-Th10 при помощи микрохирургических кусачек проводили ламинэктомию, открывая таким образом доступ к спинному мозгу. Пересечение спинного мозга необходимого объема производили хирургическим лезвием толщиной 0,1 мм при помощи специально разработанного ограничителя [24], после чего в область повреждения устанавливали и подшивали в мягкие ткани пластиковый катетер (24G). Рану ушивали послойно. Послеоперационный уход включал интраперитонеальные инъекции 5 мл раствора Рингера для предотвращения дегидратации и поддержания необходимой температуры тела. В течение первых трех дней после операции всем животным вводили гантамицин/цефазолин (20 мг/кг) для профилактики инфекционно-воспалительных осложнений и обеспечивали неограниченный доступ к воде и корму. При нарушениях мочеиспускания проводили ручную экскурсия мочевого пузыря в целях профилактики инфекционных осложнений. Моторные функции задних конечностей экспериментальных животных оценивали визуально в 1-е сутки после операции, а затем еженедельно в течение 4 нед. Оценку осуществляли путем слепого тестирования независимыми наблюдателями в соответствии с визуальной моторной шкалой BBB (Basso, Beattie, Bresnahan) [25]. Данная шкала дает возможность проводить объективную количественную оценку моторных функций при повреждении спинного мозга, при этом оценка 0 баллов указывает на полное отсутствие движений, 21 балл - на нормальное координированное передвижение. Количество баллов рассчитывается, исходя из наличия движений в суставах, установки лап и стабильности передвижения. Раздел шкалы от 0 до 7 баллов характеризует движения в крупных суставах конечностей, от 8 до 13 баллов - степень координации и характер установки лап животного, от 14 до 21 балла - общую стабильность передвижения. Электрофизиологическую оценку функциональной целостности проводящих путей спинного мозга животных осуществляли до операции для определения исходного уровня, в 1-е сутки после операции и затем еженедельно в течение 4 нед. В целях регистрации вызванных моторных потенциалов [26] применяли 4-канальный электронейромиографический анализатор Синапсис («Нейротех», Россия). Регистрацию проводили в условиях анестезии с передних большеберцовых мышц задних конечностей при транскраниальной стимуляции области моторной коры при помощи биполярных игольчатых электродов. Продолжительность стимула составляла 0,2 мс при силе 10 мА и частоте 10 Гц. Минимум три серии стимулов записывали в течение 25 мс. Регистрируемые данные были амплифицированы и оцифрованы. По окончании 4-недельного периода животные были выведены из эксперимента путем интраперитонеального введения кетамина (70 мг/кг) и транскардиального введения холодного раствора Рингера. Затем также транскардиально вводился перфузионный раствор (4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере). После извлечения позвоночного столба от Th7 до L3 проводили постфиксацию по стандартному протоколу. Блок с тканевым образцом, включающим участок повреждения спинного мозга, был порезан на криотоме. Срезы окрашивали по стандартной методике (гематоксилин и эозин, трихром по Массону). Ткани в зоне повреждения затем были изучены под световым микроскопом («Nikon»). Срезы были проанализированы методом случайного выбора в эпицентре повреждения и на 250-300 мкм ростральнее и каудальнее эпицентра повреждения. Количественная оценка числа жизнеспособных нейронов была проведена тремя разными исследователями слепым методом с помощью специального программного обеспечения (NIS, «Nikon Corporation», Япония). Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Statistical Package for Social Sciences 18.0 (SPSS Inc., Chicago, Il, США). Сравнение показателей групп животных проводили для каждого временного отрезка при помощи теста Краскела -Уоллиса с последующим анализом при помощи U-критерия Манна - Уитни. Все показатели выражали в виде средних значений и стандартной ошибки среднего значения (SEM). Порог статистической значимости составлял 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Выживаемость в послеоперационном периоде. Уровень выживаемости по прошествии первых суток после пересечения спинного мозга составил 85% (61 из 72 животных). К концу 1-й недели после операции выжило 51 (71%) животное, которое и оставалось в эксперименте до истечения 4 нед. Выживаемость в подгруппах животных с полным пересечением спинного мозга была самой низкой, что, скорее всего, связано с самокалечением (агрессивное расчесывание, отгрызание конечностей), инфекционными осложнениями и разрывом мочевого пузыря. В целом экспериментальные данные, которые были подвергнуты анализу, получены по результатам обследования 10 животных подгруппы 50%+МНЧ, 11 - 80%+МНЧ, 7 - 100%+МНЧ, а также 9, 8 и 7 животных контрольных подгрупп с соответствующим объемом повреждения спинного мозга. Поведенческая оценка результатов. Как ожидалось, во всех экспериментальных группах животных были отмечены драматические функциональные изменения, выражающиеся в полном отсутствии способности к произвольным движениям или в сохранении минимальной подвижности задних конечностей. Через сутки после операции статистически значимых (p>0,05) функциональных различий между экспериментальными подгруппами отмечено не было. По истечении недели ни у одного из животных контрольной группы повышения показателей по функциональной шкале BBB не отмечалось. В течение 4-недельного периода после операции животные в контрольных подгруппах не демонстрировали статистически значимых улучшений моторных функций по шкале BBB или амплитуды моторных вызванных потенциалов. Статистически значимых улучшений также не наблюдалось в экспериментальной подгруппе с полным пересечением спинного мозга. Однако в экспериментальной подгруппе 50%+МНЧ по сравнению с соответствующей контрольной подгруппой (улучшение в среднем на 0,9±0,4 балла) наблюдалось улучшение в среднем на 4,3±1,4 балла (p<0,001) по шкале BBB через 4 нед после операции с умеренными или выраженными движениями в двух или более суставах задних конечностей. В подгруппе 80%+МНЧ среднее увеличение показателей по шкале BBB по сравнению с соответствующей контрольной подгруппой (увеличение в среднем на 1,6±0,7 балла) через 4 нед составило 2,3±1,7 балла (p=0,061), что близко к порогу статистической значимости. Показатели моторной функции постепенно увеличивались в указанных выше экспериментальных подгруппах в течение всего периода наблюдения с наиболее выраженными изменениями в течение 2-й недели исследования (рис. 1, а). Оценка результатов электрофизиологическими методами. Так же, как и при визуальной оценке моторной функции, через сутки после хирургического вмешательства амплитуда вызванных потенциалов демонстрировала значительное падение во всех группах, причем у некоторых животных потенциалы не регистрировались. Различия в амплитуде между группами в 1-е сутки после операции не были статистически значимыми (хотя средние значения амплитуды в подгруппах с 50% пересечением были несколько выше) и составляли в среднем (по всем шести группам) 4,7±1,4% от предоперационных значений амплитуды (в среднем 538,7±91,5 мкВ). Животные в контрольных подгруппах и в экспериментальной подгруппе с полным пересечением ствола спинного мозга также не продемонстрировали статистически значимого (p>0,05) возрастания амплитуды вызванных потенциалов в течение всего периода наблюдения. В подгруппе 50%+МНЧ по сравнению с контрольной подгруппой было отмечено постепенное улучшение электрофизиологического ответа, и среднее значение амплитуды к концу 4-недельного периода достигало 17,1±3,5% (p<0,001) (по сравнению с 8,2±3,7%) от предоперационных значений. К концу этого периода статистически значимое возрастание амплитуды (до 9,9±3,0% от первоначальных значений; p<0,05) по сравнению с контрольной подгруппой (8,3±2,4% от исходных значений) было отмечено и в подгруппе 80%+МНЧ. В обоих случаях наиболее быстрое возрастание амплитуды наблюдалось в течение 2-й недели наблюдений (рис. 1, б). Гистологический анализ области повреждения через 4 нед после хирургического воздействия не выявил существенных различий в группах. Вместе с тем в экспериментальной подгруппе 50%+МНЧ по сравнению с соответствующей контрольной подгруппой отмечалось большее среднее количество моторных нейронов - в среднем на 11,8±5,6% (p<0,05) и более выраженная степень миелинизации волокон в эпицентре повреждения и в непосредственной близости от него (рис. 2). Измерения области дефекта показали, что в экспериментальной подгруппе 50%+МНЧ значения этого показателя были в среднем на 17,8±2,4% меньше (p<0,05). Хотя окрашивание трихромом по Массону выявило выраженную глиальную реакцию в области повреждения, содержание коллагена было существенно меньше в подгруппах с 50% пересечением спинного мозга по сравнению с другими подгруппами. ОБСУЖДЕНИЕ В результате настоящего экспериментального исследования показано, что применение МНЧ в сочетании с внешним магнитным полем способствует увеличению темпов функционального восстановления при повреждениях спинного мозга у лабораторных животных. Гистопатологический анализ выявил обширные изменения в области разрезов, преимущественно в виде коллагенового перерождения тканей, которые выраженно коррелировали с потерей функций задних конечностей. Несмотря на то что проведено большое количество исследований, направленных на предотвращение образования глиального рубца и применение клеточных технологий с целью восстановления нейрональных клеток в области повреждения, только в последние годы начали уделять внимание методикам механической модуляции роста аксонов. Главная цель данного подхода состоит в направлении роста аксонов и стимуляции их удлинения в области повреждения. Совместное применение МНЧ и внешнего магнитного поля для восстановления обусловленных повреждением спинного мозга функций представляет собой перспективный, безопасный, малоинвазивный подход к решению данной проблемы, так как он обеспечивает условия для пространственной модуляции процесса роста аксонов без дополнительного повреждения окружающих ЦНС тканей. Магнитные наночастицы практически не оказывают цитотоксического воздействия и могут быть свободно интернализированы клетками различных тканей, что делает их наиболее подходящим объектом для исследований в этом направлении [27, 28]. Заключение. Результаты исследования продемонстрировали, что вышеупомянутое комплексное воздействие на ткани спинного мозга положительно влияет на регенерацию нервных тканей спинного мозга в области повреждения, что подтверждается нейроэлектрофизиологическими, поведенческими и патогистологическими данными и указывает на вероятное формирование новых нейрональных связей. Механизм описанного частичного функционального восстановления после пересечения спинного мозга требует дальнейших исследований.

About the authors

S. V Kolesov

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Moscow, Russia

A. A Panteleev

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Moscow, Russia

M. L Sazhnev

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Email: mak.sajnev@yandex.ru
Moscow, Russia

A. I Kaz’min

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Moscow, Russia

References

Supplementary files