Experimental model of hereditary spinal deformity

Full Text

Первые попытки моделирования болезни Шейермана—Мау на животных относятся ко времени первых описаний этой болезни. К. Маu зафиксировал позвоночник собаки в положении сгибания, и через 3 мес в грудном отделе у нее сформировалась кифотическая деформация. По признанию автора, полученная модель не могла считаться репрезентативной, так как в основе патологии лежат не механические, а более сложные механизмы. В дальнейшем поиск этиологических факторов путем моделирования болезни Шейермана—Мау был продолжен. Воспроизводились метаболические сдвиги в организме животных [17] нарушением локального кровообращения в позвоночнике посредством перевязки сегментарных артерий [1], перевязки вен в сочетании с повреждением структур позвоночника [2], что приводило к развитию у животных кифотической деформации. По мере накопления данных о морфологических и клинических нарушениях при болезни Шейермана—Мау изменялся и подход к экспериментальным исследованиям этой патологии.

В последние годы все чаще появляются сведения о наследственной природе заболевания и сообщения о попытках создания его генетической модели. При исследовании мышей с врожденными аномалиями позвоночника, гомозиготных по Ку гену [14, 15], установлено, что нарушение синтеза протеогликанов в сочетании с механической нагрузкой приводит к кифотической деформации позвоночника. Позднее было показано, что первичный эффект данной мутации обусловлен первичной миопатией [6]. Роль стресса как фактора развития патологии межпозвонковых дисков исследовалась в работах Revel и соавт. [13]. Авторами было выявлено, что механические, особенно повторяющиеся нагрузки приводят к пролабированию диска и нарушению в хрящевых структурах тел позвонков. Этиологию болезни пытались объяснить дефицитом меди и цистеина в организме птиц на примере тибиальной дисхондроплазии, однако провести параллели между болезнью Шейермана—Мау и тибиальной дисхондроплазией авторам не удалось [10]. Все эти модели болезни Шейермана—Мау не были достаточно информативными, поскольку не объясняли патогенетических особенностей заболевания.

Нами на основе полученных клинико-генетических данных в эксперименте была создана генетически зависимая модель деформации позвоночника. Последующее исследование с использованием морфологических, биохимических методов и сопоставление с клиническими данными позволило считать эту модель репрезентативной.

Материал и методы

На 120 животных была получена генетически зависимая модель деформации позвоночника типа болезни Шейермана—Мау путем скрещивания двух линий мышей с известными генетическими дефектами. Одна из линий была гетерозиготна по мутации Undulated short tail — Un^s (мутантный PAX-1 ген), другая — по Agouty yelloy — A^Y (Agouty мутантный ген)¹. В норме РАХ-1 ген на стадии 11 -дневного эмбриона кодирует формирование вентральных отделов склеротома [3, 13]. Agouty ген оказывает влияние на обменные процессы в соединительной ткани, проницаемость клеточных мембран и обмен внутриклеточных ионов кальция [8, 12]. При скрещивании этих двух линий мышей были получены двойные гетерозиготы Un^sA^Y, у которых наблюдались кифотические деформации грудного отдела позвоночника (пат. 2152644 РФ). Контролем служили 50 мышей, гомозиготных по нормальным аллелям генов РАХ-1 и Agouty, которые сегрегировали при скрещивании родительских линий и не имели деформаций позвоночника.

В сроки 1,5,3 и 6 мес постнатального периода проводили рентгенологический контроль позвоночника. Кроме того, морфологическими методами исследовали 12-14- дневные эмбрионы. В эти же сроки животных выводили из эксперимента. Препараты позвоночника исследовали методами традиционной гистологии и гистохимии (Хейл- реакция, реакция с альциановым и толуидиновым синим при разных значениях pH, ШИК-реакция). Для исследования окислительно-восстановительных ферментов — СДГ, NAD, NADH, L-глицерофосфата — использовали криостатные срезы. Для электронной микроскопии материал фиксировали в глютаральдегиде и 1% растворе осмия и заливали в эпон.

У 2-недельных мышей с кифотической деформацией исследовали состав гликозаминогликанов (ГАГ) в межпозвонковых дисках. Контролем служили позвоночники мышей без деформаций. ГАГ выделяли раствором папаина в 0,2 М буфере ацетата натрия pH 5,8 с добавлением 0,01 М ЭДТА и 0,01 М цистеина в течение 18 ч при 60 °С. Белки осаждали в среде 5% трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием. Затем раствор диализовали против 50 мМ буфера ацетата натрия с 0,01 М ЭДТА pH 5,8 в течение 18 ч на холоду. ГАГ осаждали тремя объемами 96% этанола с 4% ацетатом калия, полученные осадки растворяли в 0,4 М Gu-НСl и в этом растворе определяли количество гексуроновых кислот [5] и сульфатированных ГАГ [4].

Результаты

Клинико-рентгенологическое исследование. Через 1,5 мес у подопытных животных наблюдалась клинически определяемая кифотическая деформация грудного отдела позвоночника. Рентгенологически отмечалась деформация в 40° по Коббу с вершиной кифоза на уровне грудопоясничного отдела позвоночника (рис. 1). На вершине искривления выявлялись клиновидно измененные тела позвонков.

 

Рис. 1. Кифотическая деформация позвоночника у подопытной 1,5-месячной мыши.

 

У двух особей в поясничном отделе позвоночника присутствовал и сколиотический компонент.

В 3-месячном возрасте деформация позвоночника у животных становилась ригидной. Угол кифоза на уровне Т4-6 позвонков достигал 60°. Тела позвонков на вершине искривления были клиновидно изменены, межпозвонковые диски неравномерно сужены. На уровне Т5 позвонка имелись грыжи Шморля.

Через 6 мес кифотическая деформация в среднегрудном отделе позвоночника усугублялась. Угол кифоза достигал 70-90°, наблюдались клиновидные изменения тел позвонков (рис. 2). На вершине дуги деформации выявлялись грыжи Шморля.

 

Рис. 2. Кифотическая деформация позвоночника у подопытной 6-месячной мыши.

 

Морфологические исследования. У плодов экспериментальных животных II половины беременности (12-14 дней) позвоночник представлен хрящевой тканью. На уровне Т5^_7 наблюдается легкая клиновидная деформация тел позвонков (рис. 3) за счет снижения высоты их вентральных отделов. Гистохимически в цитоплазме клеток вентральных отделов тел Т4-6 позвонков (зона будущей пластинки роста) определяется резкое снижение уровня выявляемых высокополимерных ГАГ (реакция Хейла) (рис. 4). В этих же клетках реакции на СДГ и NAD резко снижены. В зонах остеогенеза морфологических изменений не наблюдается. Межпозвонковый диск представлен в основном хрящевой тканью. Хордальные элементы смещены дорсально.

 

Рис. 3. Легкая кифотическая деформация грудного отдела позвоночника у 14-дневного эмбриона (окраска гематоксилином и эозином, ув. 200).

 

Рис. 4. Хейл-реакция в вентральных отделах хрящевой бластомы 14-дневного эмбриона (ув. 200).

 

У животных в возрасте 1-1,5 мес на сагиттальных срезах грудного отдела позвоночника определяется клиновидная деформация тел Т4-6 позвонков. В вентральных отделах хрящевой пластинки роста хондробласты располагаются беспорядочно, колонковый слой отсутствует. Гистохимические реакции (Хейл, альциановый и толуидиновый синий) выявляют очаговое скопление хондроитинсульфатов в матриксе и бледную реакцию цитоплазмы клеток. Единичные гранулы гликогена (ШИК-реакция, контроль амилазой) обнаруживаются в цитоплазме хондробластов. Ультраструктура хондробластов этих зон резко изменена: митохондрии лишены крист, отечны; пластинчатый комплекс единичен, располагается приядерно; эндоплазматическая сеть с расширенными цистернами (рис. 5). Окислительно-восстановительные ферменты — СДГ, NAD, NADH в виде редких гранул определяются в приядерной зоне хондробластов пролиферирующего слоя и интенсивно — в клетках всех зон дорсальных отделов пластинки роста (рис. 6). Вместе с тем наблюдается активная сосудистая инвазия и формирование костной ткани в гипертрофированном слое клеток вентральных отделов пластинки роста тел позвонков. В матриксе пластинки роста на границе центральных и вентральных отделов имеют зоны разволокнения и фрагментации. В дорсальных отделах пластинки роста архитектоника сохранена, ШИК-реакция в цитоплазме хондро-бластов интенсивна. Хондроитинсульфаты А и С (реакции с толуидиновым синим pH 3,0) выявляются в цитоплазме клеток и матриксе. Отмечается легкая клиновидная деформация диска и смещение пульпозного ядра дорсально.

 

Рис. 5. Ультраструктура хондробластов зоны пролиферации вентральных отделов пластинки роста тела позвонка 1,5-месячной мыши (электронограмма, ув. 500).

 

Рис. 6. Выявление СДГ и NADH в виде редких гранул в цитоплазме хондробластов пролиферирующего слоя вентральных отделов пластинки роста тела позвонка (реакция НАДИ, ув. 200).

 

Через 3 мес клиновидная деформация тел позвонков на уровне Т4-7 нарастает. В вентральных отделах тел позвонков костные балки широкие, со следами перестройки. На высоте деформации вентральные отделы пластинки роста тел позвонков сужены, ориентация хондробластов нарушена (рис. 7). Зональность не прослеживается, матрикс местами фрагментирован, в зонах разволокнения видны демаскированные коллагеновые фибриллы. В цитоплазме хондробластов и матриксе интенсивность реакций с альциановым и толуидиновым синим снижена. Цитоплазматические гранулы гликогена отсутствуют, снижена активность ферментов тканевого дыхания (СДГ и NAD), повышена активность кислой фосфатазы. На фоне инвазии капилляров в вентральные отделы пластинки роста наблюдается активный остеогенез. Межпозвонковые диски клиновидно деформированы. Пульпозное ядро смещено дорсально, в центральных отделах — грыжа Шморля (рис. 8). В дорсальных отделах пластинки роста сохраняется обычная структура. Пульпозное ядро и рыхловолокнистая часть диска Хейл- и альциан-позитивны. Ферментная идентификация позволяет выявить сульфатированные ГАГ типа хондроитинсульфатов А и С.

 

Рис. 7. Нарушение архитектоники хондробластов вентральных отделов пластинки роста тел позвонков 3-месячной мыши (реакция Стедмена, ув. 200).

 

Рис. 8. Грыжа Шморля в центральных отделах пластинки роста тел позвонков 3-месячной мыши (окраска гематоксилином и эозином, ув. 150).

 

Через 6 мес деформация позвоночника имеет выраженный ригидный характер. Спинной мозг на вершине искривления сужен. Наблюдается периваскулярный отек и вакуолизация цитоплазмы нейронов. В вентральных отделах тел Т5-6 зоны роста отсутствуют — здесь сформировалась костная ткань. В дорсальных отделах пластинки роста наблюдается сужение герминативного слоя и зоны пролиферации. В гипертрофированный слой клеток внедряются сосуды и формируется костная ткань. В этих участках в цитоплазме хондроцитов и матриксе выявляются ГАГ типа хондроитинсульфатов А и С (Хейл-реакция, реакции с альциановым и толуидиновым синим, контроль гиалуронидазой). В пульпозном ядре эти реакции также позитивны. Активность ферментов тканевого дыхания СДГ и NAD в сохранившихся клетках пластинки роста тел позвонков по-прежнему высокая.

Для объективизации полученных данных были проведены количественные исследования ферментов окислительно-восстановительного ряда на ранних стадиях патологии. Статистический анализ полученных данных позволил разбить выборку на четыре группы, достоверно различающиеся между собой и соответствующие зонам роста: изогенных групп, низкоактивных и высокоактивных колонковых структур, гипертрофированных хондроцитов. В вентральной части зон роста активность NAD была ниже, что проявлялось уменьшением количества гранул тетразолиевого синего. Наиболее ярко выраженная и статистически достоверная асимметрия активности NAD наблюдалась в клетках изогенных групп. В дальнейшем, по мере перехода клеток в колонковые структуры, зону гипертрофированных хондроцитов, эти различия сглаживались и становились недостоверными. В областях зон роста, прилегающих к продольной оси тела позвонка, асимметрия активности NAD была более выражена за счет того, что клетки с низким содержанием гранул тетразолевого синего встречались ближе к вентральной, чем к дорсальной половине тела позвонка.

Биохимические исследования. Выявлено, что содержание сульфатированных ГАГ и уроновых кислот в хрящевых тканях межпозвонковых дисков и пластинках роста тел позвонков у животных опытной группы снижено (см. таблицу), т.е. наряду с уменьшением общего содержания ГАГ отмечалась низкая степень сульфатированности этих веществ, что соответствует морфологическим данным.

 

Содержание уроновых кислот и сульфатированных ГАГ в образцах из позвоночников животных контрольной и опытной групп (М±т)

Группа животных	Гексуроновые кислоты (ГУК)	Сульфатированные ГАГ (S-ГАГ)	Отношение S-ГАГ/ГУК
	мкг/мг
Контрольная	960,1±202,1	226,9±14,6	0,216±0,028
Опытная	280,1±12,8	21,7±1,1	0,092±0,006
Р	<0,02	<0,01	<0,02

 

Обсуждение

При рассмотрении результатов исследования прежде всего встает вопрос об адекватности полученной экспериментальной модели клинической форме болезни Шейермана—Мау. Клинико-рентгенологические исследования дают основание с некоторой осторожностью экстраполировать результаты экспериментов на клинические проявления изучаемой патологии и позволяют объяснить основные патогенетические механизмы развития процесса. Основными клиническими проявлениями болезни у экспериментальных животных были: кифотическая деформация преимущественно грудного отдела позвоночника, грыжи Шморля, смещение пульпозного ядра дорсально и усугубление деформации в периоды роста. Аналогичные клинические симптомы характерны и для клинической формы болезни Шейермана—Мау. Морфологические проявления деформации состояли в нарушении архитектоники вентральных частей пластинки роста тел позвонков грудного отдела. На этом фоне отмечалось резкое снижение интенсивности реакции на хондроитинсульфаты А и С в матриксе хрящевой ткани и в цитоплазме хондроцитов указанных зон, что дает основание думать о нарушении либо синтеза ГАГ, либо структуры протеогликанов.

По-видимому, все наблюдаемые изменения являются не причинами, а следствием локальных нарушений развития позвоночника на ранних этапах эмбриогенеза. Гены семейства РАХ продуцируют ДНК-связывающиеся белки, которые являются внутриядерными факторами транскрипции. Транскрипция самого гена РАХ-1 ограничивается эмбриональным периодом и не наблюдается у взрослых животных [11]. Было показано, что в норме экспрессия гена РАХ-1 начинается на 9-й день развития мышиного эмбриона в склеротомальных частях сомитов. На 10-й день он экспрессируется в склеротомальных клетках, которые формируют перихордиальную трубку. Затем этот район экспрессии подразделяется на сегменты, соответствующие межпозвонковым дискам [7]. Анализ различных мутаций по гену РАХ-1 из серии Undulated показал, что РАХ-1 играет роль медиатора в передаче сигналов от нотохорды. В развитии аксиального скелета РАХ-1 определяет паттерн сегментации склеротома и развития межпозвонковых дисков.

Было показано, что мутация Un^s является по существу весьма протяженной делецией (размером более 100 тпн) всего гена РАХ и его фланкирующих последовательностей. Эксперименты по направленному получению нуль-мутаций в гене РАХ-1 выявили, что морфогенетические эффекты мутации Un^s связаны с делецией не только самого гена РАХ-1, но и его фланкирующих последовательностей. Было обнаружено, что гетерозиготы по нуль-РАХ имеют практически нормальный фенотип, а степень нарушения развития у гомозигот значительно слабее, чем у гомозигот по Un^s [18].

Эти различия в эффектах между делецией РАХ-1 (Un^s) и его нуль-мутацией могут служить объяснением обнаруженного факта, что двойные гетерозиготы Un^s/A^Y имеют гораздо более выраженные нарушения в развитии осевого скелета, чем одиночные гетерозиготы Un^s/+ (у гетерозигот A^Y/+ нарушений в развитии позвоночника не найдено). Известно, что мутация A^Y (как и Un^s) является протяженной [9, 16]. Два эти гена находятся в дифференциально импринтируемом районе хромосомы 2 на расстоянии 7 сМ друг от друга. Можно думать, что присутствие на близком расстоянии в трансположении второй делеции ведет к усилению морфогенетических дефектов, обусловленных делецией гена РАХ-1, который сам по себе является гапло-достаточным.

Не исключено, однако, что мутация A^Y усугубляет последствия нарушений формирования позвоночника, обусловленных эмбриональными эффектами Un^s. Обнаруженное нами изменение содержания ГАГ в хрящевой ткани может быть объяснено характерными для гетерозигот по A^Y изменениями проницаемости ионных каналов клеточных мембран, регуляция которых зависит от внутриклеточного обмена ионов Са⁺⁺. Поскольку протеогликаны являются основными компонентами хрящевой ткани, в том числе и пластинок роста, в этих зонах нарастают дистрофические изменения клеток и матрикса. Известна роль ионов Са⁺⁺ — вторичного посредника как в процессе направленной дифференцировки клеток, так и в регуляции митотической активности клеток. Становятся объяснимыми нарушение пролиферации и дифференцировки хондроцитов, дистрофические изменения клеток и матрикса вентральных отделов тел позвонков и, как следствие, формирование кифотической деформации тел позвонков.

¹ Мыши мутантных стоков С57В1/6 Un^S + и С57В1/6 А^Y/+ были любезно предоставлены А.М. Малашенко (Лаборато­рия экспериментальных животных РАМН, Москва) и Т.С. Морозковой (Институт цитологии и генетики СО РАН. Новосибирск).

About the authors

A. M. Zaydman

Research Institute of Traumatology and Orthopedics; Institute of Cytology and Genetics SB RAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

P. M. Borodin

Research Institute of Traumatology and Orthopedics; Institute of Cytology and Genetics SB RAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

T. V. Rusova

Research Institute of Traumatology and Orthopedics; Institute of Cytology and Genetics SB RAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

A. V. Korel

Research Institute of Traumatology and Orthopedics; Institute of Cytology and Genetics SB RAS Novosibirsk; Novosibirsk

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

A. V. Sakharov

Research Institute of Traumatology and Orthopedics; Institute of Cytology and Genetics SB RAS

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

References

Supplementary files