The study of autoantibodies to collagen of various types in the blood serum of patients with degenerative-dystrophic diseases of the hip joints

全文:

На протяжении многих лет дегенеративно-дистрофические заболевания тазобедренных суставов привлекают пристальное внимание врачей разных специальностей (хирургов-ортопедов, терапевтов, ревматологов), что связано как с их распространенностью [3], так и с огромными затратами на диагностику и лечение [12]. Этим определяется и неослабевающий интерес исследователей к морфологическим, биохимическим и иммунным сдвигам, происходящим в организме больных, в первую очередь в хрящевой и костной тканях [3]. Главной структурой этих тканей является коллаген, который в организме человека и животных составляет приблизительно третью часть всего белка. В разных тканях организма присутствуют различные типы коллагена. В настоящее время идентифицировано 19 типов коллагеновых белков, включающих более 30 видов полипептидных цепей. Изоформы коллагена различаются по аминокислотному составу, иммунным свойствам, макромолекулярной организации и распространенности в организме. Наибольшую распространенность имеют: коллаген I типа — преимущественно в костной ткани, II типа — в тканях хряща, стекловидного тела, межпозвонковых дисков, III типа — в сосудах, коже, легких, кишечнике, строме внутренних органов, IV типа — в базальных мембранах [1].

В суставном гиалиновом хряще в норме представлен коллаген II типа, особенности которого соответствуют высоким механическим нагрузкам. В случае заболевания сустава прежде всего поражаются хондроциты, весьма неустойчивые даже к относительно небольшим неблагоприятным воздействиям. Это вызывает изменения в продукции коллагена: пораженный хондроцит вместо коллагена II типа начинает синтезировать коллагены I и III типа [2]. Коллаген II типа в большей своей части гликозилирован и имеет «сильную» сольватированную оболочку, благодаря чему он связывает значительное количество воды. Это весьма помогает питанию хряща при изменениях механического, осмотического давления и способствует амортизации вертикальных давлений и ударов. Присутствие не характерых в норме коллагенов I и III типа снижает сопротивляемость механическим нагрузкам. Кроме того, эти коллагены существенно легче расщепляются, чем коллаген II типа. Продукты расщепления могут вызывать образование аутоантител (ААТ) к различным типам коллагена, что, в свою очередь, может стать толчком к аутоагрессии по отношению к суставу.

Целью данной работы было исследование ААТ к коллагену в сыворотке крови больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава.

Материал и методы

Исследования проведены у 185 больных (124 женщины и 61 мужчина) в возрасте от 19 до 72 лет с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренных суставов: деформирующим коксартрозом I, II, III стадии, асептическим некрозом головки бедренной кости III-ІѴ стадии и кистовидной перестройкой суставных концов II, III стадии. Все больные находились на консервативном лечении в отделении реабилитации Нижегородского НИИТО. Исследование включало два этапа: на первом этапе (123 больных) изучали содержание в сыворотке крови ААТ к общим детерминантам коллагенов всех типов, на втором этапе (62 пациента) определяли уровень ААТ к коллагену I, II, III и IV типа. В качестве контроля использовали сыворотку крови клинически здоровых доноров.

Кровь для исследования брали из периферической вены (5-6 мл) в сухие чистые пробирки. Для образования сгустка образцы крови выдерживали в течение 30 мин в термостате при температуре 4°С. Свернувшуюся кровь центрифугировали при 2000 g 15 мин. Сыворотку отбирали в сухие чистые пластиковые пробирки и до выполнения анализа хранили при температуре -60°С. Максимальный срок хранения составил 2 мес.

ААТ к общим детерминантам коллагенов различных типов определяли при помощи реакции пассивной гемагглютинации с использованием диагностической тест- системы «Аутоколлаген» (НПК «Препарат», Н. Новгород). Содержание ААТ к коллагенам I, II, III, IV типа исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Имтек» (Москва) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Приводим краткое описание методики. В сорбированные коллагеном человека лунки полистиролового планшета вносили образцы исследуемых и контрольных сывороток в разведении 1:50. В первый ряд планшета вносили в разведениях положительный контроль с исходной концентрацией 0,1 мг/мл. Планшет с растворами контрольных и исследуемых образцов инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с последующим отмыванием не связавшихся белков. Затем во все лунки планшета вносили раствор очищенных кроличьих моноклональных антител к иммуноглобулину человека, конъюгированных с пероксидазой хрена, и инкубировали в тех же условиях. После отмывания не связавшегося конъюгата для проявления реакции в лунки планшета вносили субстратную смесь (0,1% раствор ортофенилендиамина, содержащего 0,01% перекиси водорода) и инкубировали при комнатной температуре до появления выраженного окрашивания в положительных контрольных образцах, после чего реакцию останавливали 10% раствором серной кислоты. Регистрировали результаты на вертикальном спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 492 нм. Количественное определение ААТ к коллагену производили с помощью калибровочной кривой, выстраиваемой прибором при введении значений концентраций положительного контроля в различных разведениях и с учетом разведения исследуемых образцов.

Полученные результаты подвергали статистической обработке по методу Стьюдента. При р<0,05 результаты считались достоверными. При статистических расчетах использовали пакет программ «Statistica» («StatSoft», Russia. 1998)

 

Табл. 1. Частота встречаемости различных титров аутоантител к общим детерминантам коллагенов разных типов при дегенеративно-дистрофических заболеваниях тазобедренного сустава (в %)

Вид суставной патологии	Титры аутоантител
	≤1:40	1:80	≥1:160
Деформирующий кокс- артроз	60	32	0
Асептический некроз головки бедренной кости	20	28	40
Кистовидная перестройка суставных концов	20	40	60
Всего	100	100	100

 

Результаты

Почти у трети больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава зарегистрирован достаточно низкий титр ААТ к общим детерминантам коллагенов различных типов (1:20—1:40), что соответствовало аналогичному показателю у здоровых доноров. У 47% больных титр ААТ составлял 1:80 и только у 24% пациентов был высоким, диагностически значимым (1:160 и 1:320). Обнаружена зависимость между количеством аутоантител к общим детерминантам коллагенов различных типов в сыворотке крови и характером суставной патологии (табл. 1). В частности, у больных с кистовидной перестройкой суставных концов и асептическим некрозом головки бедренной кости высокие титры ААТ к общим детерминантам коллагенов отмечались значительно чаще, чем при деформирующем коксартрозе.

Мы не включили в исследование больных, оперированных на тазобедренном суставе. Опыт показывает, что у подавляющего большинства оперированных наблюдается значительное увеличение количества ААТ к коллагену в сыворотке крови (их титр составляет 1:320-1:640), что, по-видимому, связано с повреждающим действием самого хирургического вмешательства. В дальнейшем содержание ААТ постепенно уменьшается до нормы, причем динамика этого процесса зависит от целого ряда факторов (наличие послеоперационных осложнений, индивидуальные особенности больного и т.д.).

При определении методом иммуноферментного анализа содержания в сыворотке крови ААТ к коллагенам I, II, III и IV типа высокий уровень ААТ к различным типам коллагена выявлен у 20% обследованных больных. При этом содержание ААТ к коллагену I типа было повышено у всех этих пациентов, к коллагену II типа — у 10%, а к коллагену III и IV типа — только у 4%. Средние значения полученных показателей представлены в табл. 2. Из нее видно, что наиболее высоким было содержание ААТ к коллагену I и II типа.

 

Табл. 2. Содержание аутоантител к коллагенам I, II, III и IV типа в сыворотке крови у больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава (М±т)

Исследуемая группа	Содержание ААТ (в мг/мл) к коллагену
	I типа	II типа	III типа	IV типа
Больные	0,0639±0,019	0,0951±0,037	0,0241±0,008	0,0131±0,007
Здоровые доноры	0,0078±0,0003	0,0087±0,0007	0,0072±0,0001	0,0072±0,002

 

Табл. 3. Содержание аутоантител к коллагенам I, II, III и IV типа в сыворотке крови у больных с различными дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава (М±т)

Исследуемая группа	Содержание ААТ (в мг/мл) к коллагену
	I типа	II типа	III типа	IV типа
Больные: коксартроз	0,0171±0,006	0,0228±0,007	0,0245±0,01	0,0063±0,0004
асептический некроз головки бедренной кости	0,0468±0,013*	0,1178±0,06	0,0212±0,007	0,0112±0,005
кистовидная перестройка суставных концов	0,0873±0,039	0,1127±0,039*	0,0252±0,006	0,0155±0,006
Здоровые доноры	0,0078±0,0003	0,0087±0,0007	0,0081±0,0001	0,0073±0,0003

* р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

 

Анализ результатов, полученных у больных с разными дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава, показал, что у пациентов с асептическим некрозом головки бедренной кости имелось статистически достоверное повышение уровня ААТ к коллагену I типа, а у больных с кистовидной перестройкой суставных концов — к коллагену II типа (табл. 3). Среднее содержание ААТ к коллагену II типа было наиболее высоким у пациентов с асептическим некрозом головки бедренной кости и с кистовидной перестройкой суставных концов. Высокое значение этого показателя зарегистрировано у 33% больных с асептическим некрозом, у 47% пациентов с кистовидной перестройкой и только у 20% больных с деформирующим коксартрозом.

Выявлена зависимость между содержанием ААТ к коллагену II типа и тяжестью клинического состояния пациентов с асептическим некрозом и кистовидной перестройкой суставных концов. В соответствии с тяжестью клинического состояния пациенты были разделены на две группы: с легкими (1-я группа) и с умеренными (2-я группа) статодинамическими нарушениями. Тяжесть поражения тазобедренных суставов (по данным рентгенологического исследования) у всех больных была одинаковой и соответствовала III-ІѴ стадии асептического некроза головки бедренной кости и III стадии кистовидной перестройки суставных концов. При асептическом некрозе головки бедренной кости у всех больных с легкими статодинамическими нарушениями уровень ААТ к коллагену II типа превышал 0,009 мг/мл (от 0,009 до 0,7) и в среднем составлял 0,178±0,0181 мг/мл (табл. 4). Наиболее высоким этот показатель был у больных с максимально выраженной клинической компенсацией (0,7 мг/мл). У всех пациентов с умеренными статодинамическими нарушениями уровень ААТ к коллагену II типа был ниже 0,009 мг/мл (от 0,006 до 0,0089) и в среднем составлял 0,0078± 0,00002 мг/мл.

Аналогичная закономерность выявлена и при кистовидной перестройке суставных концов. В частности, содержание ААТ выше 0,009 мг/мл отмечено у 70% больных с легкими статодинамическими нарушениями. Средний показатель в этой группе (0,184±0,0324 мг/мл) был близок к среднему показателю у пациентов 1-й группы с асептическим некрозом головки бедренной кости. Вместе с тем во 2-й группе больных с кистовидной перестройкой суставных концов содержание ААТ ниже 0,009 мг/мл зарегистрировано в 80% случаев, средний показатель составил 0,043±0,0044 мг/мл, что значительно выше, чем у больных 2-й группы с асептическим некрозом головки бедренной кости (см. табл. 4).

 

Табл. 4. Содержание аутоантител к коллагену II типа у больных с асептическим некрозом головки бедренной кости и с кистовидной перестройкой суставных концов

Вид суставной патологии	Группа больных	Содержание ААТ, мг/мл (М±m)	Количество больных (в %) с уровнем ААТ выше 0,009 мг/мл
Асептический некроз головки бедренной кости	1-я	0,178±0,0181	100
	2-я	0,0078±0,00002	0
Кистовидная перестройка суставных концов	1-я	0,184±0,0324	70
	2-я	0,043±0,0044	20

 

Обсуждение

Вопрос об участии антител к собственным тканям суставов в патогенезе их различных заболеваний рассматривается уже около 100 лет [5], однако устоявшейся точки зрения здесь не существует и по сей день. В отличие от ревматоидного артрита, считающегося «классическим» аутоиммунным заболеванием, такие виды патологии суставов, как деформирующий артроз, асептический некроз головки бедренной кости, кистовидная перестройка сочленяющихся костей, в основе своего патогенеза имеют нарушения обменных процессов, в частности внутрикостного и хрящевого метаболизма [4]. В последнее время показано, что иммунная система играет довольно активную роль на разных этапах развития этих патологических процессов [9, 16], причем ключевыми являются аутоиммунные процессы, связанные с коллагеном II типа [10, 17, 18].

В проведенных нами исследованиях в сыворотке крови пациентов с кистовидной перестройкой суставных концов и асептическим некрозом головки бедренной кости выявлены высокие титры ААТ к общим детерминантам коллагенов, что говорит о несомненной заинтересованности иммунных механизмов при данной патологии тазобедренного сустава. Это послужило основанием для более детального изучения ААТ по их принадлежности к различным типам коллагена.

Как показал иммуноферментный анализ, у больных с асептическим некрозом достоверно увеличено содержание в сыворотке крови ААТ к коллагену I типа («костный» коллаген) и имеется выраженная тенденция к повышению уровня ААТ к коллагену II типа («хрящевой» коллаген). Вероятно, это объясняется последовательностью патогенетически значимых событий при данной патологии, когда первично в субхондральных отделах эпифизов появляются очаги некроза губчатой кости и вторично поражается суставной хрящ [6]. У больных с кистовидной перестройкой сочленяющихся костей, при которой кистовидные образования возникают в наиболее нагружаемых отделах суставных концов на фоне выраженной деструкции суставных хрящей, напротив, обнаружено достоверное увеличение содержания ААТ к коллагену II типа и только тенденция к повышению уровня ААТ к коллагену I типа.

Все это указывает на то, что образование ААТ при дегенеративно-дистрофических заболеваниях тазобедренного сустава — вновь в отличие от ревматоидного, или коллагениндуцированного, артрита — имеет вторичный характер и представляет собой реакцию на деструкцию заинтересованной (костной либо хрящевой) ткани. Это подтверждается и небольшим процентом больных дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава с наличием ААТ к коллагену III типа (преимущественно расположенного в сосудах и коже) и IV типа (составляющего основу базальных мембран) и относительно невысоким содержанием этих ААТ.

Отсутствие достоверных изменений содержания ААТ к коллагену I и II типа в сыворотке крови у больных коксартрозом, по-видимому, объясняется менее выраженной деструкцией суставных тканей при данной патологии, особенно на ранних стадиях заболевания. Можно предположить, что иммунные процессы у этих больных происходят на местном уровне и не проявляются в виде изменений показателей аутосенсибилизации в периферической циркуляции.

Выраженность иммунных механизмов при суставной патологии определяется не только наличием (или отсутствием) ААТ к тканям сустава и их структурам, в частности к коллагену II типа. Показано, что кроме гуморальных механизмов, большое значение имеют аутоиммунные процессы, связанные с активацией клеток — в первую очередь Т-лимфоцитов [7, 13, 15]. Однако одновременно получены данные о том, что при артрите, вызванном введением в организм аллогенного коллагена II типа, разрушение хряща и кости может произойти и при отсутствии Т- и даже В-лимфоцитов [14].

Ведущим моментом в выборе иммунной системой гуморального или клеточного аутоиммунного ответа является соотношение Т-хелперов I (Thl) и II (Th2) класса. Считается, что клеточный аутоиммунный ответ протекает более остро, чем гуморальный, когда образуются ААТ. Своевременная диагностика выбора пути аутоиммунной реакции обычно затруднена — отчасти тем, что Thl лимфоциты, сенсибилизированные к коллагену II типа, накапливаются преимущественно в полости сустава и не идентифицируются в периферическом кровотоке [8].

Анализ содержания ААТ к коллагену II типа в сыворотке крови у больных дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава с разной выраженностью статодинамических нарушений показал, что при сопоставимой рентгенологической картине тазобедренных суставов имеется довольно четкая зависимость содержания ААТ от клинической картины заболевания. У пациентов с асептическим некрозом головки бедренной кости, которых можно отнести к группе с легкими статодинамическими нарушениями, содержание ААТ к коллагену II типа было достоверно выше, чем у больных с умеренными статодинамическими нарушениями, и всегда повышено по сравнению с контрольной группой. Подобная ситуация, хотя менее четко выраженная, отмечалась и у пациентов с кистовидной перестройкой суставных концов. Отчасти наше наблюдение подтверждает данные, полученные Kim Wan-Uk и соавт. [11] у пациентов с ревматоидным артритом.

Проведенное нами исследование позволяет говорить о том, что показатели аутоиммунной составляющей патогенеза дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава могут быть клинически значимыми. При этом важно понимание баланса выраженности клеточного и гуморального ответов. Существенную помощь здесь может оказать исследование суставной жидкости пораженного сегмента, в первую очередь определение различных цитокинов как маркеров Thl и Th2 лимфоцитов. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о возможности использования значений уровня ААТ к коллагену II типа в сыворотке крови для оценки компенсаторных способностей организма у больных с асептическим некрозом головки бедренной кости и кистовидной перестройкой суставных концов. Выявленные закономерности и корреляции между клиническими и иммунологическими показателями могут быть использованы хирургами-ортопедами и реабилитологами при составлении программы оперативного и консервативного лечения больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренных суставов.

作者简介

T. Buylova

Nizhny Novgorod Institute of Traumatology and Orthopedics

Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Nizhny Novgorod

E. Puchenkina

Nizhny Novgorod Institute of Traumatology and Orthopedics

Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Nizhny Novgorod

M. Lebedev

Nizhny Novgorod Institute of Traumatology and Orthopedics

编辑信件的主要联系方式.
Email: info@eco-vector.com
俄罗斯联邦, Nizhny Novgorod

参考

补充文件