The immune status of patients with scoliosis

Full Text

Исследованиями последних лет показано участие клеток иммунной системы и продуктов их деятельности в патогенезе некоторых заболеваний скелета [2, 5, 11]. Это участие проявляется в активирующем действии на остеобласты и выработке цитокинов, способных влиять на процессы костеобразования [3, 7, 9]. Так, в экспериментах на крысах продемонстрировано, что при искусственной гиперактивации иммунной системы увеличиваются сроки консолидации переломов [10]. Известно и то, что дегенеративные изменения при остеохондрозе позвоночника сопровождаются локальной инфильтрацией мононуклеарных клеток, роль которых окончательно неясна [4, 8]. Сколиотическая деформация также вызывает дегенеративные изменения в позвоночных суставах и тканях межпозвонковых дисков, однако сведений о состоянии иммунной системы у больных сколиозом крайне мало [1]. Это побудило нас к изучению иммунного статуса больных сколиозом.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 37 больных сколиозом, которым в отделении патологии позвоночника ЦИТО производилась хирургическая коррекция деформации с использованием системы Cotrel—Dubousset. Среди них лиц мужского пола было 5, женского — 32. Возраст пациентов составлял от 7 до 29 лет (от 7 до 12 лет — 4 человека, от 13 до 15 лет — 23, от 16 лет и старше — 10). Сколиоз III степени диагностирован у 13 больных, IV степени — у 24. У 30 человек был диспластический (идиопатический) сколиоз, у 3 — сколиоз на фоне нейрофиброматоза, у 3 — врожденный и у 1 — нейрогенный. Грудной сколиоз отмечался у 24 больных, грудопоясничный — у 7, комбинированный — у 3, поясничный — у 2, верхнегрудной — у 1.

Изучались следующие основные параметры, характеризующие иммунный статус: содержание лимфоцитов в крови; процентное содержание основных субпопуляций лимфоцитов, несущих маркеры CD3, CD4, CD8 (Т-клетки, в том числе хелперы и цитотоксические), CD 16 (естественные киллеры) и CD20 (В-клетки); способность лимфоцитов к активации, регистрируемая по появлению на их поверхности молекул активационных маркеров CD25 и CD71; способность лимфоцитов к размножению под действием активатора (митогена). Материалом для исследования служили периферическая кровь, спинномозговая жидкость и ткани межпозвонкового диска (удаленные во время операции ткани пульпозного ядра и фиброзного кольца). Лимфоциты из крови получали общепринятым методом — центрифугированием на градиенте (плотность 1,077 г/см³) фиколл — визотраст. Лимфоциты из тканей пульпозного ядра и фиброзного кольца получали после их переваривания 1% коллагеназой в присутствии ДНКазы. Субпопуляции лимфоцитов определяли методом прямой иммунофлюоресценции, используя меченные флуоресцеин-изотиоцианатом моноклональные антитела («Сорбент», Россия) к соответствующим CD-маркерам, с помощью люминесцентного микроскопа («Олимпус», Япония). Ответ лимфоцитов на митоген (фитогемагглютинин — ФГА) оценивали через 3 сут культивирования при 37°С в СО₂-инкубаторе по включению Н³-тимидина, используя счетчик бета-излучения Wallac 1409 (Швеция). Результаты выражали в импульсах в минуту или в виде индекса стимуляции (имп/мин в опыте : имп/мин в контроле). Экспрессию активационных маркеров CD25 и CD71 на поверхности лимфоцитов определяли с помощью соответствующих моноклональных антител после 24 ч инкубации лимфоцитов с ФГА. Статистическую обработку результатов — вычисление критерия Стъюдента — проводили, используя пакет программ «Биостат».

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ полученных данных позволил выделить среди больных две группы. 1-я группа, в которую вошли большинство больных (29 человек), характеризовалась отсутствием в предоперационном периоде существенных отклонений исследованных иммунологических показателей от средних нормальных значений. Возраст пациентов составлял в среднем 15,5 лет. У 11 больных была III степень, у 18 — IV степень сколиоза. Кровопотеря во время операции равнялась в среднем 2255,4 мл. Во 2-ю группу вошли 8 больных, у которых изначально определялось изменение как минимум одного показателя иммунного статуса. Средний возраст пациентов этой группы — 12 лет (только одна пациентка была в возрасте 15 лет, остальные — от 7 до 13 лет). Сколиоз III степени отмечался у 2 больных, IV степени — у 6. У 2 пациентов сколиоз сочетался с нейрофиброматозом, у 3 больных был врожденный и у 3 — диспластический (идиопатический) сколиоз. Кровопотеря во время операции составила в среднем 1719,3 мл, что достоверно меньше (р< 0,05 ), чем в 1-й группе.

Субпопуляционный анализ лимфоцитов

В предоперационном периоде у больных 1-й группы содержание основных субпопуляций лимфоцитов не отличалось от такового у здоровых детей в возрасте 7-13 лет, обследованных в качестве контроля. У пациентов 2-й группы содержание отдельных субпопуляций лимфоцитов — CD4+ и CD 16+ клеток отличалось как от показателей здоровых детей, так и от показателей больных 1-й группы, тогда как по содержанию CD3+ клеток различия выявлялись только между группами больных. Обнаруженные изменения носили разнонаправленный характер: содержание Т-клеток (CD3+ и входящих в их число CD4+ клеток) было снижено, а содержание естественных киллеров (CD16+) существенно повышено (табл. 1). Таким образом, некоторые изменения в содержании отдельных функциональных подклассов лимфоцитов у части больных сколиозом выявляются в предоперационном периоде.

Анализ результатов исследований, проведенных в раннем и среднем послеоперационном периоде (табл. 2), показывает, что влияние оперативного вмешательства на субпопуляционный состав лимфоцитов проявляется стереотипно в обеих группах больных: отмечается снижение абсолютного содержания лимфоцитов крови и процентного содержания CD4+ клеток, что сопровождается также уменьшением содержания всех Т-клеток (CD3+). Однако у больных 1-й группы эти изменения носят неглубокий характер, тогда как у больных 2-й группы они более выражены и сохраняются в течение ближайших 1-2 мес. Это относится и к так называемому иммунорегуляторному индексу (соотношению CD4+ и CD8+ клеток): он существенно понижается в первые 10 дней после операции, но только у больных 2-й группы. Более того, у них появляется новая тенденция — увеличение содержания В-клеток, которая до операции была неотчетливой, а в среднем послеоперационном периоде становилась высокодостоверной. Таким образом, исходные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов (CD3+, CD4+ и CD16+ клетки) у больных 1-й и 2-й групп остаются в разной степени выраженными в раннем и среднем послеоперационном периоде и дополняются тенденцией к увеличению содержания В-клеток у больных 2-й группы.

 

Табл. 1. Исходное содержание субпопуляций лимфоцитов в крови больных сколиозом (М±<у)

Исследуемый показатель	Здоровые дети	Больные 1-й группы	Больные 2-й группы
Лимфоциты (109/л) Субпопуляции, %	1,9=4=0,31	1,8+0,47	2,0+0,76
CD3+	67,6+3,4	75,8+4,8	60,5+9,05* (р<0,001)
CD4+	54,0+1,8	51,2+7,2	40,5+9,9** (Р=0,02)
CD8+	18,6+1,4	28,6+5,9	23,3+6,1
CD16+	8,8+1,3	13,2+6,7	20,7+7,1** (р=0,045)
CD20+	12,7+0,5	9,7+4,5	14,8+10,0
CD4/CD8	2,5+0,28	1,74+0,55	1,8+0,47

*Достоверное отличие от показателя больных 1-й группы.

** Достоверное отличие от показателя больных 1-й группы и здоровых.

 

Табл. 2. Содержание субпопуляций лимфоцитов в крови больных сколиозом в разные сроки после операции (М±<у)

Исследуемый показатель	10-14 дней		1~2 мес		8-15 мес
	1-я группа	2-я группа	1-я группа	2-я группа	1-я группа	2-я группа
Лимфоциты (10 9/л) Субпопуляции, %	1,47+0,16	1,2+0,6	1,5+0,23	1,56+0,3	1,6+0,36	1,3+0,49
CD3+	72,2+4,2	65,0+5,6* (Р=0,05)	74,2+7,3	56,7+5,8* (р=0,009)	73,6+5,7	64,5+11,2* (р=0,015)
CD4+	48,7+9,5	44,0+9,8	48,6+7,5	38,6+4,0* (р—0,038)	50,6+3,9	47,0+12,3
CD8+	25,8+8,0	22,0+1,3	26,5+2,8	16,6+5,7*	26,6+7,0	21,5+5,0
CD16+	12,0+3,6	11,0+1,4	11,7+5,7	16,0+6,9 (Р=0,09)	8,8+3,0	15,7+6,4* (Р=0,07)
CD20+	12,3+5,1	14,0+7,0	6,7+2,8	22,6+3,0* (р<0,001)	10,2+5,2	17,1+6,0* (Р=0,05)
CD4/CD8	2,0+0,8	(р<0,02)	1,7+0,7	2,4+0,5	1,9+0,2	2,2+0,25

 

В отдаленном послеоперационном периоде (8- 15 мес) у больных 1-й группы субпопуляционный состав лимфоцитов мало изменялся, практически восстанавливаясь до исходного (дооперационного) уровня. У пациентов 2-й группы также происходило восстановление структуры популяции лимфоцитов. Однако различия между двумя группами больных оставались практически неизменными: у больных 2-й группы сохранялась тенденция к более низкому содержанию CD3+ и CD4+ клеток и повышенному содержанию CD16+ и CD20+ клеток (см. табл. 2).

Таким образом, при изучении субпопуляционного состава лимфоцитов выявлено следующие:

— исходное содержание лимфоцитов и их основных субпопуляций в крови больных сколиозом в среднем не выходит за границы нормальных значений (характерных для здоровых детей и подростков), однако даже в этих пределах у части больных (2-я группа) имеется тенденция к более низкому содержанию отдельных субпопуляций (CD3+, CD4+ и CD16+ клеток);

• стресс, вызванный операцией на позвоночнике, в раннем послеоперационном периоде приводит к усилению этой тенденции у больных 2-й группы, тогда как у больных 1-й группы его влияние ограничивается снижением содержания только CD3+ клеток;
• восстановление субпопуляционного состава лимфоцитов происходит у больных 1-й группы через 1~2 мес после операции, а у больных 2-й группы существенно позднее;
• обнаруженные в предоперационном периоде различия в субпопуляционном составе лимфоцитов у больных двух групп сохраняются и после полного выздоровления.

Функциональные свойства лимфоцитов

Иммунный ответ лимфоцитов в организме развивается в несколько этапов, основными из которых являются распознавание антигена, активация клетки, начало выработки цитокинов и размножение (пролиферация) активированных клеток. Наиболее доступные для изучения процессы — активация и пролиферация. Активацию клетки можно определить по появлению на ее поверхности активационных молекул, которые служат маркерами, а пролиферацию — по усиленному синтезу ДНК (с помощью Н³-тимидина). В качестве стимулирующего агента, вызывающего активацию, использовали неспецифический митоген ФГА.

В табл. 3 приведены результаты определения двух маркеров активации — CD25 (функционально представляет собой молекулу-рецептор для одного из важнейших в иммунном ответе цитокинов — интерлейкина-2) и CD71 (функционально является молекулой-рецептором для трансферрина).

 

Табл. 3. Экспрессия маркеров активации ФГА-стимулированными лимфоцитами больных сколиозом (М±о)

Срок после операции, мес.	Содержание лимфоцитов, несущих маркеры, %
	CD25		CD71
	1-я группа	2-я группа	1-я группа	2-я группа
0	22,3±15,6	23,5±12,3	28,2+8,2	31,3=4=14,5
1	7,3±2,1*	11,3=4=8,2	22,5±3,5	21,6=4=6,6
2	16,1±4,3	15,5±3,5	24,2±2,6	25,5+5,6
6	21,5+7,2	19,5+5,3	32,5±8,5	30,1+3,5
12	24,1+9,2	21,2=4=4,5	29,1±6,1	31,2±11,2

* Отличие от исходного уровня достоверно (р=0,045).

 

Наиболее демонстративно изменение маркера CD25: процент клеток, экспрессирующих его на своей поверхности, остается сниженным в течение как минимум 1 мес после операции. Другая молекула — CD71 оказалась более устойчивой к действию операционного стресса: ее экспрессия мало изменялась во времени. Полученные результаты позволяют также заключить, что существенных различий в способности лимфоцитов к активации у больных двух групп не обнаруживается.

Результаты исследования другого показателя функциональной способности лимфоцитов — пролиферативного ответа на митоген (табл. 4) позволяют отметить две основных особенности. Первая состоит в том, что ответ у больных 1-й группы всегда — в предоперационном и послеоперационном периоде — достоверно выше, чем у больных 2-й группы. Второй особенностью является то, что динамика ответа у больных обеих групп практически одинакова: способность лимфоцитов к пролиферации наиболее существенно снижается сразу после операции, однако уже через 1 мес она начинает восстанавливаться и спустя 6-12 мес возвращается к исходному уровню. Индекс стимуляции у больных 1-й группы можно расценить как очень высокий в предоперационном периоде и как нормальный в послеоперационном. У пациентов 2-й группы он исходно близок к нижней границе нормы, а его снижение в послеоперационном периоде можно считать проявлением дефекта функциональной активности лимфоцитов.

Анализ данных, представленных в табл. 3 и 4, позволяет также заключить, что один из первых этапов функционирования лимфоцитов после их стимуляции — активация, сопровождающаяся выработкой маркерных молекул активации CD25 и (в меньшей степени) CD71, подвержен изменениям у больных сколиозом меньше, чем второй этап — пролиферативный ответ.

 

Табл. 4. Пролиферативный ответ лимфоцитов больных сколиозом на ФГА (М±ст)

Группа больных	Включение Н -тимидина (в индексах стимуляции) стимулированными культурами лимфоцитов в разные сроки после операции
	0	10 дней	1-2 мес	6-10 мес
1-я	178,0+81	62,0+23,3	80,0±31	110,0±32
2-я	22,0±8,0	12,5±3,5	15,5+5,0	24,5+6,0

 

Поиск локальных проявлений активности иммунной системы. У 12 больных исследовали содержание мононуклеарных клеток в спинномозговой жидкости, взятой в предоперационном периоде. Оказалось, что в ней практически не содержится клеточных элементов: лишь в цитоцентрифужных препаратах, полученных из концентрированной спинномозговой жидкости, обнаруживались отдельные эритроциты и лимфоциты. Это косвенно указывает на отсутствие реакции со стороны иммунной системы на патологические изменения в позвоночнике, связанные со сколиотической болезнью.

У 5 больных была предпринята попытка выделить из тканей пульпозного ядра и фиброзного кольца клетки, которые можно было бы ассоциировать с инфильтративной реакцией иммунной системы на собственно ткань пульпозного ядра и фиброзного кольца на вершине сколиотической деформации. Выяснилось, что ткань пульпозного ядра практически полностью лишена любых клеток. В переваренной ферментами ткани фиброзного кольца среди соединительнотканных клеток обнаружены лишь единичные лимфоциты, что также свидетельствует об отсутствии локальной иммунной реакции, которую можно было бы связать со сколиотической болезнью.

ОБСУЖДЕНИЕ

Главная цель данной работы состояла в поиске связи между показателями иммунного статуса и проявлениями сколиотической болезни. Основанием для этого исследования послужили сведения о способности лимфоцитов, макрофагов и их продуктов — цитокинов, вырабатываемых при активации клеток, влиять на формирование кости и хряща как в эксперименте, так и при некоторых заболеваниях у человека [2~5, 7~11]. Кроме того, иммунный статус может иметь важное значение в обеспечении резистентности к инфекции у больных, подвергаемых стрессорному действию тяжелого оперативного вмешательства [10].

Результаты определения субпопуляционного состава лимфоцитов крови позволяют говорить прежде всего о высоком уровне основных субпопуляций лимфоцитов у больных сколиозом в целом. Наиболее важными являются CD4+ клетки, которые главным образом обеспечивают иммунный ответ [10], распознавая антиген и вырабатывая необходимые для него цитокины. Проведенный анализ показывает, что ни в предоперационном, ни в послеоперационном периоде у больных сколиозом не происходит катастрофического снижения содержания CD4+ клеток, а также других субпопуляций, которое можно было бы расценить как иммунодефицит.

В то же время выделяется небольшая группа больных (2-я группа), которые сильнее, чем остальные, реагируют на оперативное вмешательство снижением содержания CD4 + клеток. При детальном рассмотрении оказалось, что у этих больных исходное содержание наиболее важных субпопуляций Т-клеток также имеет тенденцию к понижению, хотя в среднем остается в пределах нормы. У этих же больных повышено (по сравнению со всеми остальными) содержание субпопуляции лимфоцитов фенотипа CD 16+ — так называемых естественных киллеров, основной функцией которых является распознавание и разрушение зараженных вирусом, опухолевых и паразит-содержащих клеток. Уровень CD16+ клеток у больных 2-й группы изменялся, но всегда оставался выше, чем у остальных пациентов.

Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов у больных обеих групп отличалась тем, что процентное содержание субпопуляций восстанавливалось лишь до изначального уровня, характерного для данной группы. Так, у больных 2-й группы содержание Т-клеток после восстановления не превысило их предоперационный уровень, а у больных 1-й группы не уменьшилось. Это свидетельствует о высокой индивидуальной устойчивости субпопуляционного состава лимфоцитов у больных.

Что касается функциональной способности лимфоцитов, то первая функциональная стадия — активация лимфоцитов — у больных сколиозом не нарушена и быстро восстанавливается после операции. В то же время пролиферативный ответ у больных двух групп явно различался: у пациентов с относительно более низким содержанием Т-клеток он был слабее. Поскольку для пролиферации активированных лимфоцитов требуется последовательная выработка ряда цитокинов, в том числе абсолютно необходимого фактора роста интерлейкина-2, то причины низкой пролиферативной способности заключаются, вероятно, во временной недостаточности одного или более цитокинов.

Как и субпопуляционный состав, функциональная способность лимфоцитов восстанавливалась после операции в соответствии с ее дооперационным уровнем: до высоких значений индекса стимуляции у большинства пациентов (1-я группа) и более низких значений у больных 2-й группы .

Известно, что для здорового взрослого человека характерна высокая стабильность индивидуальных показателей иммунного статуса и их устойчивость к стрессорным воздействиям [6]. Результаты проведенного исследования говорят о том, что это распространяется и на больных сколиозом: у большинства из них восстановление содержания и функций наиболее значимых субпопуляций лимфоцитов после операции происходило в ближайшие недели и лишь у части больных (2-я группа) этот процесс задерживался. Между тем пациенты 2-й группы отличались от основной массы больных не только по иммунологическим, но и по клиническим показателям. Так, в этой группе у 6 из 8 больных была IV степень сколиоза, у 7 возраст не превышал 13 лет, у 3 отмечалось длительное заживление послеоперационной раны в связи с поверхностным нагноением, в одном случае через 1,5 года после операции пришлось удалить металлоконструкцию из-за постоянного функционирования свищей. На этом основании можно полагать, что больные с исходным иммунологическим профилем, характерным для 2-й группы, могут представлять группу потенциального риска и требуют дополнительного внимания.

В то же время результаты исследования в динамике позволяют предположить, что величина показателей иммунного статуса не связана с собственно сколиотической деформацией, поскольку коррекция позвоночника у больных 2-й группы не приводила к повышению этих показателей до уровня, отмечавшегося у больных 1-й группы.

Исследованиями Ю.П. Делевского и соавт. [1] также было показано отсутствие существенных различий между здоровыми и больными сколиозом по таким параметрам иммунного статуса, как ответ на ФГА (бласттрансформацию), содержание сывороточных иммуноглобулинов G, М и А, уровень сывороточного комплемента. Вместе с тем предположение авторов о развитии иммунной реакции на ткани пульпозного ядра и диска не нашло подтверждения в нашей работе. Исследование спинномозговой жидкости и тканей пульпозного ядра и фиброзного кольца показало отсутствие локальных проявлений иммунного ответа (инфильтрации мононуклеарных клеток), что, видимо, отличает патологию ткани при сколиозе от таковой при остеохондрозе позвоночника [4, 8]. Это служит дополнительным свидетельством того, что патологические процессы, приводящие к сколиотической деформации позвоночника, протекают без прямого участия иммунной системы.

ВЫВОДЫ

1. У большей части больных сколиозом иммунный статус по таким параметрам, как уровень лимфоцитов, содержание наиболее значимых субпопуляций лимфоцитов и их функциональная способность, не отличается от средних нормальных значений; после корригирующих операций на позвоночнике показатели иммунного статуса восстанавливаются в ближайшие недели.
2. Потенциальную группу риска по осложненному послеоперационному течению могут составлять пациенты, для которых характерны следующие клинические и иммунологические признаки: возраст до 13 лет, сколиоз IV степени, тенденция к снижению уровня CD3+ и CD4+ клеток и их функциональной активности, тенденция к повышенному содержанию CD 16+ клеток.
3. Отсутствие локальных проявлений иммунного ответа, установленное при исследовании спинномозговой жидкости и тканей межпозвонкового диска (фиброзного кольца и пульпозного ядра) на вершине деформации, свидетельствует о том, что процессы, приводящие к развитию сколиотической деформации, протекают без прямого участия иммунной системы.

About the authors

G. A. Kosmiadi

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

S. T. Vetrila

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

A. A. Kuleshov

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files