Bacteriostatic Characteristics of Bone Substituting Constructors Obtained from Composite Materials Based on Natural Polymers, Calcium Phosphates and Vancomycin

Full Text

Введение. Лечение гнойно-некротических вос- палительных процессов (остеомиелитов), разви- вающихся в костях и костном мозге в присутствии пиогенной флоры, а также микобактерий, является актуальной и во многом нерешенной проблемой со- временной травматологии и ортопедии. Известно, что при ряде патологических состояний на фоне об- щего снижения иммунитета, травм, хирургических вмешательств или имплантаций искусственных эндопротезов происходит нарушение целостности защитных барьеров костной ткани, приводящее к гематогенному или первичному проникновению внутрь костей бактерий с последующим развитием инфекционных процессов [1, 2]. В частности, осте- омиелит является нередким осложнением рекон- структивных операций у пациентов с опухолевыми и метастатическими поражениями костей [3, 4]. В 90% случаев в роли возбудителя инфекцион- ных процессов в костях выступает Staphylococcus aureus, реже - Streptococcus pyogenes (4%), Haemophilus influenzae (4%), Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis и микроорганизмы ро- дов Salmonella и Brucella [5-7]. При этом лечение больных остеомиелитом в значительной степени осложнено низкой биодоступностью формирую- щихся очагов остеонекроза и секвестров для анти- микробных препаратов при их системном введении, и, как следствие, быстрым развитием резистент- ности возбудителей инфекции. С этих позиций ло- кальная доставка терапевтических концентраций антибиотиков в зону оперативного вмешательства у больных из группы высокого риска позволяет предотвратить или существенно замедлить разви- тие инфекционных осложнений [8]. Накопленный к настоящему времени богатый опыт использования костнозамещающих каль- цийфосфатных материалов свидетельствует в пользу их хорошей биосовместимости и выражен- ных остеокондуктивных свойств [9]. В то же время разработка композиционных материалов на ос- нове фосфатов кальция с добавлением натураль- ных (полисахаридов и белков) или синтетических органических компонентов перспективна с точки зрения получения нового поколения костнозаме- щающих имплантатов, демонстрирующих лучшие показатели пористости, механической прочности и контролируемой скорости биорезорбции [10]. В последние годы активно разрабатываются ме- тоды прототипирования и в частности, 3D-печати, направленные на изготовление персонализирован- ных костных имплантатов с заданной конфигура- цией. Ранее нами была показана принципиальная возможность симбатного прототипирования по- лимерного каркаса и кальцийфосфатных арми- рующих фаз [11]. Кроме того, в качестве наиболее подходящего для 3D-печати кальцийфосфатного материала был выбран синтетический октакаль- циевый фосфат, являющийся возможным пред- шественником биологического апатита кости и демонстрирующий наилучшие показатели биосов- местимости in vitro и in vivo в сравнении с трикаль- циевым фосфатом и карбонатзамещенным гидрок- сиапатитом [12, 13]. С другой стороны, существует возможность придания напечатанным имплантатам на основе биорезорбируемых компонентов дополнительных полезных свойств посредством их функционализа- ции биологически активными или лекарственными веществами, в том числе антибиотиками. Например, было показано, что сформированные трехмерные конструкты можно насыщать антимикробными препаратами на разных этапах их получения: как перед началом 3D-печати, на этапе смешивания сухих компонентов и приготовления «чернил» для печати [14], так и после ее завершения - путем ин- фильтрации готовых имплантатов антибиотиками [15] или их биомиметического осаждения совместно с фосфатами кальция на активированную органи- ческими кислотами поверхность конструктов для получения микроразмерного покрытия [16]. При этом во многих экспериментальных исследованиях для функционализации имплантатов для остеопла- стики используют антибиотик ванкомицин, актив- ный в отношении ряда штаммов S. aureus - основ- ного возбудителя инфекционного остеомиелита [17, 18]. Тем не менее, несмотря на очевидные пер- спективы, исследования в этом направлении на- ходятся в начальной стадии, поэтому в настоящий момент не представляется возможным заранее предсказать, какой из методов обеспечит доста- точное связывание антибиотика с конструктом и подходящую скорость его высвобождения из кон- структа для обеспечения пролонгированного фар- макологического эффекта. Целью настоящей работы было изучение связывания, динамики высвобождения и анти- бактериальных свойств ванкомицина при его включении в состав гидрогеля для 3D-печати конструктов, предназначенных для замещения костных дефектов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Прототипирование образцов трехмерных кон- структов (ТК) и исследование физико-химических характеристик получаемых конструктов состава альгинат-желатин-октакальциевый фосфат про- водилось по схеме, описанной нами ранее [11, 13]. В качестве «чернил» для печати использовали композиционный гидрогель на основе 2% раство- ра альгината натрия (Альг) («Acros», Германия), 10% водного раствора желатина (Жел) (Gelatine 80-100, «Sigma-Aldrich», США) и гранул октакаль- циевого фосфата (ОКФ) диаметром 100-200 мкм. Гранулированный ОКФ получали методом двух- стадийного химического синтеза из карбоната кальция (CaCO3) как описано ранее [12]. 3D-печать экспериментальных образцов осуществляли при помощи оригинальной установки для струйной печати ИПЛИТ 50/01 (разработка ФГБУН ИПЛИТ РАН) на основе предварительно созданной цифровой модели в формате STL. По за- вершении процесса печати трехмерные конструк- ты помещали в морозильную камеру (-50°C), после чего подвергали сублимационной сушке и затем обрабатывали сшивающим агентом - 10% водноспиртовым раствором хлорида кальция (СаСl2). Образцы «сшитых» ТК помещали в термостат (37°C) до полного высыхания. Состав исходных ком- позиционных ТК включал 56 масс. % Альг, 14 масс. % Жел и 30 масс. % ОКФ. Функционализацию композиционного материа- ла Альг-Жел-ОКФ осуществляли антибиотиком ванкомицин («Teva Pvt. Ltd», Венгрия) посредством его введения в состав гидрогеля в процессе изготов- ления. Для этого ванкомицин в сухом виде вводили в состав композита на этапе растворения органи- ческих компонентов и приготовления чернил для печати с содержанием антибиотика в сухом веще- стве материала 30, 50 и 70 масс. %. После формиро- вания функционализированных ТК их помещали в морозильную камеру при температуре -47°С на 24 ч. Далее образцы подвергались лиофилизации в течение 1 сут. Исследовали микроструктуру ТК на скани- рующем электронном микроскопе Vega II SBU («Tescan», Чехия) и их прочностные характеристи- ки (прочность на сжатие, растяжение) на электро- динамической испытательной системе ElectroPuls E3000 («Instron», США). Динамику выхода ванкомицина из функцио- нализированных ТК в течение 25 сут исследовали при их выдерживании в фосфатно-солевом буфе- ре (PBS, «ПанЭко», Россия) при 37°С и постоянном перемешивании. Три одинаковых ТК помещали в 1 мл модельной жидкости и в установленные сроки (30, 60, 90, 120, 150, 180 мин, 6 ч, и далее каждые 1-3 сут) осуществляли забор образцов жидко- сти для измерения выхода препарата с последу- ющим добавлением новой порции того же объ- ема. Концентрацию ванкомицина (молярная масса 1480 Да, _=4,084 л_моль-1 _ см-1) в пробах оценивали методомУФ-спектроскопиипридлиневолны 280 нм на бескюветном спектрофотометре NanoDrop-2000 («ThermoFisher Scientific», США) [19]. Стерилизацию образцов для изучения их био- совместимости осуществляли _-облучением (15 кГр). Для изучения бактериостатического/бактерицид- ного действия ТК в модельных экспериментах in vitro и in vivo был выбран штамм S. aureus 6538-P из американской коллекции типовых культур (ATCC). Концентрацию бактерий доводили до 1,5_108 КОЕ в 1 мл, используя стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-59-85. Для экспериментов исполь- зовали чистую суточную культуру в концентрации 1,5_108 КОЕ/мл, выросшую на плотной питательной среде TSA (триптон-соевый агар). Антибактериальную активность функционали- зированных ТК в отношении S. аureus определяли диско-диффузионным методом по выходу ванкоми- цина из образцов в среду TSA с нанесенной суспен- зией микроорганизмов [20]. Контролем служили ТК без препарата. Учет результатов антимикроб- ной активности ванкомицина в ТК проводили через 24 ч путем измерения размеров зоны задержки ро- ста тест-штамма S. аureus от края образца до гра- ницы роста микроорганизмов. Исследования in vivo бактериостатического/ бактерицидного действия ТК на основе Альг- Жел-ОКФ, насыщенных ванкомицином, проводи- ли на модели эксцизионной инфицированной раны на коже половозрелых аутбредных крыс (самок). Для этого было сформировано 4 группы животных (по 5 особей в каждой): 1-я группа (отрицательный контроль) - неинфицированные раны, без лече- ния; 2-я группа (положительный контроль) - ин- фицированные раны без лечения; 3-я и 4-я группа - инфицированные раны с внесенными ТК, функ- ционализированными ванкомицином с содержани- ем антибиотика в сухом веществе 30 и 70 масс. % соответственно. Все эксперименты с мелкими лабораторными животными проводили с соблюдением принципов гуманности в соответствии с Директивами Совета Европейского Сообщества 2010/63/EU «Об ис- пользовании животных для экспериментальных исследований». Для анестезии использовали зо- летил 100 («Вирбак», Франция), который вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг. Затем в области лопаток на коже формировали полнослойные раны размером 20 _ 20 мм. Полученные раны инфици- ровали S. aureus в дозе 1,5_109 КОЕ/мл на раневую поверхность, затем в рану закладывали тестиру- емые ТК и накладывали хирургические швы. Все манипуляции осуществляли с соблюдением правил асептики. Антимикробный потенциал функциона- лизированных ТК оценивали по следующим крите- риям: общее состояние животных и поведенческие реакции, местная воспалительная реакция, сроки заживления ран. Животных выводили из эксперимента на 15-е сутки после формирования дефектов методом де- капитации с предварительной общей анестези- ей. Производили забор тканей из области ранево- го дефекта с прилежащей кожей и подлежащими мышцами. Ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине, далее изготавливали парафиновые блоки и окрашенные гематоксилином и эозином срезы. Анализ и получение цифровых изображений гистологических препаратов осуществляли при помощи микроскопа Eclipse Ti («Nikon», Япония). РЕЗУЛЬТАТЫ Методом струйной 3D-печати были получе- ны ТК для замещения костных дефектов соста- ва Альг-Жел-ОКФ. Изделия имели форму ци- линдров диаметром 4,0-4,5 мм, высотой 3-4 мм и массой 3,5-4,4 мг. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показала, что органическая составляющая ТК имеет пористую структуру, в которую «вкраплены» гранулы ОКФ (рис. 1, а). Общая пористость напечатанного материала на- ходилась в пределах 60-80 % со средними разме- рами пор порядка 50-60 мкм. Введение в состав гидрогеля 30 масс. % ванкомицина не влияло на структуру образца. Согласно данным СЭМ при увеличении концентрации антибиотика в гидроге- ле до 50 масс. % микроструктура ТК претерпевала небольшие изменения. Средний размер пор воз- растал до 200-230 мкм, а на поверхности образцов формировался слой ванкомицина толщиной до 20 мкм (рис. 1, б). С увеличением концентрации антибиотика в гидрогеле распределение новооб- разованного слоя становилось более однородным, а его толщина увеличивалась. Прочность при сжатии образцов на основе гидрогеля с антибактериальным препаратом уменьшалась с ростом концентрации лекарствен- ного препарата в гидрогеле. Так, у ТК с исходным содержанием ванкомицина 30 масс. % показатели прочности на сжатие не отличались от таковых у исходных образцов (без препарата) и составляли в среднем 5,5 МПа. При повышении содержания ван- комицина до 50 и 70 масс. % прочность снижалась до 4,4 и 3,7 МПа соответственно. Кинетику высвобождения ванкмицина из функционализированных ТК исследовали пу- тем измерения его свободной концентрации в мо- дельной жидкости. Анализ кинетических кривых показал, что вне зависимости от начальной кон- центрации основная часть препарата высвобож- далась в течение первых 6 ч, после чего скорость его выхода заметно снижалась, и после первых суток дальнейшего увеличения свободной концен- трации препарата в растворе практически не на- блюдалось (рис. 2). Общий выход антибиотика из ТК за весь период инкубации составлял 0,069 мг для 30 масс. % ванкомицина, 0,110 мг для 50 масс. % было считать, что масса вышедшего ванкомицина соответствовала массе связавшегося с ТК препа- рата и составляла приблизительно 20% от расчет- ного количества для всех трех исходных концен- траций (табл. 1). По всей видимости, остальная часть внесенного препарата «терялась» на разных этапах изготовления ТК, в том числе при сшива- нии альгинатной матрицы в водно-спиртовом рас- творе СаСl2 и при последующей многократной отмывке в дистиллированной воде. При исследовании антимикробной активности ТК с ванкомицином in vitro оценивали линейные размеры зоны подавления роста S. aureus штам- ма ATCC 6538-P на плотной питательной среде. Четкий край зоны подавления роста и ее диаметр ≥12 мм свидетельствовали о чувствительности бак- терий к антибиотику, в то время как нечеткий край или рост изолированных колоний внутри зоны ука- зывали на резистентность. Согласно полученным данным, исходные ТК на основе Альг-Жел-ОКФ не обладали само- стоятельной антимикробной активностью. В то же время наличие в составе ванкомицина при- водило к формированию выраженной зоны по- давления роста бактерий вокруг ТК, средний диаметр которой для 30 масс. % ванкомицина со- ставил 16,2±0,2 мм, для 50 масс. % - 15,4±0,4 мм, для 70 масс. %- 17,4±0,3 мм (p>0,05), т. е. все три использованные концентрации ванкомицина де- монстрировали хороший антимикробный эффект в отношении тестового штамма S. aureus. Исследование бактериостатических свойств in vivo проводили на модели эксцизионных ран на коже крыс. Во всех группах, за исключением 2-й группы (инфицированные раны с нефункционали- зированными ТК), животные выглядели здоровы- ми, охотно поедали корм, были подвижны, имели густой шерстный покров белого цвета, который плотно прилегал к поверхности тела. Мышечный тонус, рефлексы, частота мочеиспускания, цвет мочи, количество и консистенция фекальных масс, зоосоциальное поведение животных соответство- вали физиологической норме. У крыс 2-й группы в течение первых 4 суток после инфицирования наблюдались признаки интоксикации: адинамия, жажда, плохой аппетит. Полученные данные свидетельствовали о на- личии значительных различий как в характере, так и в динамике заживления ран в разных груп- пах животных. Это выражалось и в существенной разнице в сроках полного заживления ран (табл. 2). Так, в 1-й группе (отрицательный контроль) не- инфицированные раны заживали первичным на- тяжением, причем их закрытие наблюдалось с 8-х по 12-е сутки (рис. 3, а). У животных 2-й группы (положительный контроль) констатировали об- разование гнойных инфильтратов, расхождение швов; начальные признаки заживления ран появ- лялись у отдельных животных лишь к 14-м сут- кам, а к 15-м суткам раны зажили не у всех крыс (рис. 3, б). В обеих опытных группах животных (ТК с со- держанием ванкомицина 30 и 70 масс. %) в сравне- нии со 2-й группой снижалась степень выраженно- сти и частота воспалительных процессов в ранний (3-7 сут) послеоперационный период: лишь у 3 из 10 крыс в этих двух группах визуализировались гнойные инфильтраты. Кроме того, в этих груп- пах наблюдалось более раннее (в сравнении со 2-й группой) очищение ран (рис. 3, в). Наличие в инфи- цированных ранах ТК, функционализированных ванкомицином, сокращало и общие сроки заживле- ния ран (4 из 10 животных - уже к 12-м суткам). Значимых различий в заживлении ран в присут- ствии ТК с разными концентрациями ванкомицина не выявлено. При анализе гистологических препаратов участков кожи крыс (15-е сутки после формирова- ния раны) в 1-й группе были хорошо видны резуль- таты активных процессов регенерации всех сло- ев кожи, признаки отека отсутствовали (рис. 4, а). В этой группе наблюдалась полная эпителиза- ция раневой поверхности с формированием более сглаженного эпителиального края (в сравнении с интактной кожей). Дерма была представлена зре- лой, хорошо васкуляризированной соединительной тканью. Во 2-й группе (рис. 4, б) также выявлена пол- ная эпителизация поверхности раны. Однако ра- невой процесс здесь развивался по некротиче- скому и дегенеративно-воспалительному типу: новообразованная дерма представлена соедини- тельной тканью с выраженной диффузной лимфо- идной инфильтрацией и интерстициальным отеком. В отдельных случаях гнойный экссудат распро- странялся диффузно в дерме и подкожной клет- чатке вплоть до подлежащих мышечных структур - миосимпластов с образованием полиморфно- клеточных инфильтратов. В гистологических препаратах из операцион- ной зоны животных 3-й группы также визуализировались признаки эпителизации раны (рис. 4, в). Дерма была выполнена зрелой васкулязирован- ной соединительной тканью с гладкомышечными волокнами, признаки воспаления отсутствовали. В подкожно-жировой клетчатке определялся им- плантат, пространства между слоями полимерно- го компонента которого были заполнены соедини- тельной тканью. Гистологические препараты животных 4-й группы в целом были идентичны таковым для жи- вотных 3-й группы (рис. 4, г). Таким образом, репаративный гистогенез в зоне инфицированной раны в присутствии насыщенных ванкомицином конструктов завершался в большей степени и физиологически более адекватно к 15-м суткам после формирования дефекта, что косвенно подтверждало терапевтический эффект функцио- нализированных антибиотиком ТК. ОБСУЖДЕНИЕ Технологические подходы к созданию персона- лизированных имплантатов нового поколения с ис- пользованием метода 3D-печати находят все боль- шее применение в биомедицинских исследованиях. Использование напечатанных по индивидуальным цифровым моделям трехмерных конструктов для замещения сложных дефектов костей черепа при операциях в челюстно-лицевой хирургии и стома- тологии уже сегодня позволяет сократить время хирургического вмешательства, ускорить прижив- ление имплантатов, снизить частоту нежелатель- ных побочных реакций, а также существенно улуч- шить косметический эффект лечения [21]. Одним из ключевых этапов 3D-печати им- плантатов, предназначенных для постоянного замещения костных дефектов, является выбор остеопластических материалов, обладающих опти- мальными параметрами остеокондукции и биоре- зорбции. Разработанные в последние десятилетия методы химического синтеза различных кальций- фосфатных соединений - карбонатзамещенного гидроксиапатита, _- и _-трикальцийфосфата и др. - позволяют получать керамические материалы, близкие по составу к биологическому гидроксиа- патиту натуральной кости. В настоящей работе мы использовали октакальциевый фосфат, обладаю- щий относительно высокой растворимостью в жид- костях организма и усиливающий процесс биоми- нерализации формирующейся костной ткани [22]. В то же время недостатками всех кальцийфосфат- ных материалов являются невысокие показатели их механической прочности и пористости, исклю- чающие формирование на их основе крупных им- плантатов для замещения критических дефектов. Кроме того, скорость биорезорбции таких имплан- татов значительно ниже скорости неоостеогенеза, что приводит к замуровыванию остатков матери- алов и образованию микрополостей вследствие последующей пассивной резорбции и, в конечном итоге, снижает прочность новообразованной кости [23]. Добавление к кальцийфосфатным керамиче- ским гранулам природных полимеров (например, коллагена, хитозана, желатина и др.) способствует улучшению механических свойств имплантатов и формированию в них крупных взаимосвязанных пор, обеспечивающих миграцию и заселение клет- ками остеобластического ряда, прорастание со- судов, перенос питательных веществ и выведение продуктов обмена. Применение подобных много- компонентных, в частности минералполимерных, композитных материалов, базируется на фунда- ментальных представлениях о структуре межкле- точного вещества костной ткани, представляющего собой композит из коллагеновых фибрилл и биоло- гического апатита [24, 25]. С технологической точки зрения добавление органической компоненты (альгинаты, желатин и др.) обеспечивает допол- нительные преимущества, поскольку позволяет контролировать требуемые параметры текучести и вязкости гидрогеля, используемого в качестве «чернил» для экструзионной 3D-печати. Сочетание 3D-печати с адресной доставкой лекарственных средств (гормонов, противовоспа- лительных средств, анальгезирующих препара- тов, антибиотиков, цитостатиков и генетических конструкций) является новым направлением ме- дицинских аддитивных технологий, способным в значительной степени повысить терапевтический потенциал создаваемых индивидуальных имплан- татов. Важными аспектами подобных подходов яв- ляются количество препарата, которое может быть включено в структуру имплантата, и сохранение его активности по окончании всех технологических этапов производства. В настоящей работе мы исследовали возмож- ность получения полимерно-керамических кон- структов, функционализированных ванкомицином, предназначенных для лечения и профилактики остеомиелита - широко распространенного ин- фекционного поражения костной ткани. Несмотря на то что «золотым стандартом» для адресной до- ставки антимикробных препаратов являются кост- ные цементы на основе полиметилметакрилата (PMMA), многочисленные ограничения данного материала, такие как неспособность связывания большинства антибиотиков, короткий период вы- свобождения препаратов и необходимость по- вторных операций для удаления небиодегради- руемого цемента, обусловливают поиск новых композиционных материалов-носителей, в том числе содержащих кальцийфосфатную керамику [26]. Подобный подход был недавно использован в работе коллектива исследователей, получавших методом 3D-печати насыщенные рифампицином и ванкомицином кальцийфосфатные скаффол- ды и убедительно доказавших их преимущества над аналогичными PMMA-скаффолдами в модели остеомиелита in vivo [14]. Кинетика выхода препа- ратов, как и в нашей работе, соответствовала вы- ходу основного количества антибиотиков в первые часы после помещения в модельную систему, при этом бактериостатический эффект конструктов на основе фосфатов кальция в области инфицирован- ных костных дефектов у мышей сохранялся в тече- ние 3 нед после имплантации. Заключение. В ходе настоящего исследования была показана возможность получения функци- онально-ориентированных полимерно-керами- ческих конструктов с заданным содержанием антимикробного препарата и его контролируемой кинетикой высвобождения. Кроме того, доказана принципиальная возможность 3D-печати костно- замещающих имплантатов многокомпонентны- ми гидрогелиевыми композициями без изменения свойств отдельных составляющих. Проведение дальнейших исследований на моделях острого и хронического остеомиелита у животных [27] позво- лит подробно изучить остеопластические свойства и бактериостатические эффекты функционализи- рованных композиционных материалов, что, несо- мненно, приблизит момент внедрения получаемых на их основе персонализированных имплантатов в повседневную клиническую практику.

About the authors

P. A Karalkin

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Email: prognoz.06@mail.ru
cand. med. sci., senior research worker, department of conservative treatment efficacy prognosis, MNIOI named after P.A. Gertsen - branch of NMIRTs Moscow, Russia

N. S Sergeeva

Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, Russia

V. S Komlev

A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science

Moscow, Russia

I. K Sviridova

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

V. A Kirsanova

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

S. A Akhmedova

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

Ya. D Shanskiy

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

E. A Kuvshinova

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

A. Yu Fedotov

A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science

Moscow, Russia

A. Yu Teterina

A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science

Moscow, Russia

S. M Barinov

A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science

Moscow, Russia

A. D Kaprin

P.A. Herzen Moscow Oncology Research Institute

Moscow, Russia

References

Supplementary files