Исследование преобразования желтой соли тетразолия в формазан в клетках HeLa

Актуальность. МТТ-тест является одним из наиболее распространённых методов определения цитотоксического действия экстрактов растений и их индивидуальных соединений. Несмотря на обширное применение этого метода, остаётся неясным, разрушают ли кристаллы МТТ-формазана плазматическую мембрану клеток при восстановлении МТТ в МТТ-формазан; происходит ли потеря формазанового продукта в случае разрушения клеток в процессе проведения исследования цитотоксического действия методом МТТ.

Цель исследования – изучение преобразования МТТ в МТТ-формазан в клетках HeLa методами микроскопии и спектрофотометрии, а также определение возможности потери формазанового продукта при исследовании цитотоксического действия природных и синтетических соединений методом МТТ.

Материал и методы. Клетки HeLa высевали на покровные стекла в бюксах, инкубировали с раствором МТТ (в конечных концентрациях 0,1 и 0,5 мг/мл), изучали при помощи световой микроскопии через 30, 60, 120 и 240 мин после добавления МТТ. При исследовании методом спектрофотометрии, в 96-луночный планшет вносили клетки (5×10⁴ к/лунку), добавляли раствор МТТ и инкубировали в течение 30, 60, 120 и 240 мин, регистрировали спектры поглощения МТТ и МТТ-формазана при помощи планшетного спектрофотометра.

Результаты. Исследование методом микроскопии показало две фазы в преобразовании МТТ клетками в МТТ-формазан – образование гранул и образование кристаллов МТТ-формазана. Максимальное соотношение кристаллов к гранулам МТТ-формазана, а также практически полное разрушение клеток наблюдали на 240-й мин инкубации методом световой микроскопии. Однако при исследовании методом спектрофотометрии, после разрушения клеток диметилсульфоксидом, значения оптической плотности раствора МТТ-формазана через 120 мин инкубации и через 240 мин инкубации были практически одинаковыми. Следовательно, преобразование МТТ-формазана из гранул в кристаллы не влияет на результаты определения оптической плотности, несмотря на разрушение клеток. Культуральная среда без клеток не восстанавливает МТТ в МТТ-формазан. В супернатанте от клеток без их разрушения также не наблюдалось значительного количества МТТ-формазана.

Выводы. Кристаллы МТТ-формазана не растворяются в культуральной среде и растворяются в диметилсульфоксиде. В связи с этим разрушение клеток не приводит к потере формазанового продукта при восстановлении МТТ в формазан и не влияет на результаты определения цитотоксического действия.