Features of the hormone-receptor interaction in the endometrium during ovulatory menstrual cycle in women with reproductive failure

Full Text

Введение. Значительное число репродуктивных неудач в настоящее время не имеет тенденции к снижению. Существенное внимание уделяется ис- следованию эндометрия в середину периода суще- ствования желтого тела в яичнике в предполагаемый отрезок времени, называемый «окном имплантации» [9]. В лютеиновой фазе овариального цикла под воз- действием половых стероидных гормонов, в первую очередь прогестерона, на фоне достаточного эстро- генного влияния в эндометрии происходят секре- торные преобразования [3]. Физиологическая роль и молекулярно-клеточные механизмы гормон-эстро- ген-прогестерон-рецепторного ответа в эндометрии при овуляторном и ановуляторном менструальных циклах изучены недостаточно. Нарушение функциональной полноценности эстрогеновых и прогестероновых рецепторов как по- казателя рецептивности эндометрия является одним из значимых факторов в патогенезе бесплодия и не- вынашивания беременности. Цель исследования. Провести сравнительный анализ сывороточных уровней эстрадиола (E2) и про- гестерона (P) в крови и иммуногистохимических (ИГХ) показателей рецепторов эстрогенов (ER) и рецепто- ров прогестерона (PR) в эндометрии на 6-8-й день после овуляции у женщин с нарушениями репродук- тивной функции в анамнезе. Материалы и методы. В основную группу были включены 107 женщин от 23 до 40 лет (средний воз- раст - 32,53±0,04 г.) с бесплодием, невынашиванием беременности раннего срока и неудачными попыт- ками экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (нарушения имплантации морулы/бластоцисты после переноса эмбриона) в анамнезе. Критериями исклю- чения из исследования были тяжелые соматические заболевания, любые онкологические процессы, тром- бофилии, аномалии развития матки, клинически зна- чимая миома матки (субмукозный миоматозный узел, субсерозно-интрамуральный миоматозный узел 3 см в диаметре и более), инфекционно-воспалительный процесс урогенитального тракта в период предпо- лагаемого инвазивного внутриматочного вмеша- тельства, использование гормональных препаратов (женских половых стероидных гормонов) в течение трех месяцев до включения в исследование. Контрольную группу (КГ) составили 15 соматиче- ски здоровых женщин от 20 до 40 лет (средний воз- раст - 27,6±0,4 лет) без нарушений репродуктивной и менструальной функций в анамнезе, проходивших обследование в связи с наличием диагноза «бесплод- ный брак» по причине мужского фактора бесплодия, женщины-добровольцы, а также пациентки из архив- ной базы данных патолого-анатомического отделения Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова Министерства по ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 63 Клинические исследования чрезвычайным ситуациям России (ВЦЭРМ). Все под- писывали добровольное информированное согласие. Всем женщинам была произведена аспирационная пайпель-биопсия эндометрия на 6-8-й день после овуляции (в среднем - на 20-22-й день менструаль- ного цикла) в гинекологическом отделении Центра планирования семьи и репродукции (Санкт-Петербург) с одномоментным забором венозной крови для опре- деления сывороточных уровней эстрадиола и проге- стерона. Гистологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследования образцов эндометрия выполняли в патолого-анатомическом отделении ВЦЭРМ. Гистоло- гическую проводку тканевых фрагментов эндометрия осуществляли по стандартному протоколу в автомате «Leica ASP200» (Германия), далее заливали в парафин и приготовленные срезы толщиной 5 мкм окраши- вали гематоксилином и эозином. ИГХ исследование выполняли полимерным методом с применением на- бора системы визуализации «En-Vision» фирмы «Dako Cytomation» (Дания), моноклональных антител к рецеп- торам эстрогенов альфа (ER) (clone 1D5, RTU) фирмы «Dako Cytomation» (Дания), моноклональных антител к рецепторам прогестерона (PR) (clone PgR 636, RTU) фирмы «Dako Cytomation» (Дания). Результаты иммуно- гистохимической реакции проявляли диаминобензиди- ном (DAB-kit, RTU) фирмы «Dako Cytomation» (Дания). Оценку экспрессии ER и PR в железах и строме эндоме- трия проводили путем подсчета методом Histochemical Score, где учитывали процент окрашенных клеток (до 100%) и балл интенсивности (0 - нет окрашивания, 1 - слабое, 2 - умеренное, 3 - сильное окрашивание) (в модификации McCartey, 1986) [5]. Определение значений E2 и P в периферической крови выполняли в день пайпель-биопсии эндометрия (6-8 день после овуляции) в эндокринной лаборатории Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта. Применяли иммунофер- ментные методы исследования крови для определения уровней E2 с использованием тест-системы фирмы «DRG Diagnostics» (Германия) и P с использованием тестсистемы фирмы «Beckman Coulter» (Соединенные Штаты Америки) в крови. Референтные значения в лютеиновую фазу менструального цикла составили для E2 в крови от 180 до 1070 пмоль/л, P - от 16,1 до 59,1 нмоль/л. Полученные данные были проверены на нормаль- ность распределения с использованием критерия Шапиро - Уилка. Анализ различий значений прово- дили с использованием U-критерия Манна - Уитни непараметрической статистики. Различия считали статистически достоверными при р<0,01. Результаты показаны в виде процентных соотношений среднего и 95% доверительного интервала. Результаты и их обсуждение. Индекс массы тела (ИМТ) у женщин основной группы был 22,54±0,04 кг/ м2, контрольной группы - 22,0 ±0,8 кг/м2. Все женщины указали, что менструальный цикл (м.ц.) регулярный. Характеристики менструальной функции в основной и контрольной группах: возраст менархе (соответственно, 13,04±0,01 и 13±0,01 лет), длительность менструаций (4,7±0,1 и 5,7±0,2 дней) и менструального цикла (29,9±0,4 и 31±0,5 дней) - между группами не раз- личались и соответствовали популяционным значениям. Альгоменорея была отмечена у 22 (21%) и 3 (20%) жен- щин основной и контрольной групп соответственно. В течение последнего года до включения в исследование у 27 (25%) женщин основной группы были единичные эпизоды нарушений менструальной функции по типу опсоменореи, у 14 (13%) - по типу пройоменореи. Воз- раст начала половой жизни в обеих группах в среднем составил 18,14±0,02 и 18,1±0,1 лет. По данным гинекологического анамнеза, в основной группе бесплодие отмечали 84 (78,5%) женщины (у по- ловины из них в анамнезе были неудачные попытки ЭКО), у 23 (21,5%) - невынашивание беременности ранних сро- ков. В анамнезе у 76 (71%) пациенток основной группы были внутриматочные вмешательства (выскабливания полости матки с диагностической/лечебной целью, искусственные аборты, аспирационные биопсии эндо- метрия). Среди этих пациенток (n=76) у 46 (60,5%) было два и более выскабливаний полости матки в прошлом. На основании данных ультразвукового монитори- рования фолликулогенеза, визуализации желтого тела в яичнике и показателей уровня P в периферической крови на 6-8-й день после овуляции (у большинства - 20-22-й день м.ц.) была проведена оценка 279 менструальных циклов (минимум 2 м.ц. у каждой па- циентки): в изучаемую когорту включены все женщины с овуляторным менструальным циклом основной и контрольной групп. При гистологическом исследовании у 47 (44%) жен- щин основной группы эндометрий был с полноценной секреторной трансформацией желез и стромы и со- ответствовал средней стадии фазы секреции, как и у 100% женщин контрольной группы: с хорошо извитыми железами с широким просветом, округлыми светлыми, везикулярными ядрами, расположенными базально, и признаками апокринной секреции в просвете отдельных желез, с фокальным отеком стромы. Неполноценная секреторная трансформация эндометрия в виде слабо извитых желез различной формы, без признаков функ- циональной секреторной активности и отсутствием синхронного преобразования развития эпителиального и стромального компонента и отеком в строме была обнаружена у 60 (56%) женщин основной группы. При ИГХ исследовании эндометрия у женщин кон- трольной группы наблюдалось синхронное снижение ER как в железах, так и в строме в виде слабого фокаль- ного окрашивания менее 50% ядер эпителиоцитов и стромы, что соответствовало их низким количествен- ным показателям (H-score ER в железах - 72,2±13,6 у. е. и ER в строме - 88,9±12,9 у. е.). В то же время экс- прессия рецепторов прогестерона характеризовалась дисинхронным ответом: слабой экспрессией в железах при наличии постоянства высокой их экспрессии в строме (H-score PR в железах - 34,4±11,2 у. е. и PR в строме - 210±17 у. е.). Такая динамика изменений гормон-рецепторов в эндометрии наблюдалась при 64 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Клинические исследования нормальных референтных значениях половых гормо- нов в периферической крови: Е2 - 762,2±148,3 пмоль/л, P - 39,0±5,2 нмоль/л (соотношение E2/P - 18,3±1,7 у.е.). При таком гормон-рецепторном взаимодействии у всех женщин контрольной группы в эндометрии определя- лась полноценная секреторная трансформация желез и стромы, соответствующая средней стадии фазы секреции овуляторного менструального цикла, что позволило нам обозначить его как норморецепторный тип гормонального ответа (1-й тип) (табл. 1, 2). При анализе значений экспресии рецепторов эстрогенов и прогестерона в эндометрии у женщин основной группы было выделено 4 типа гормон-ре- цепторного ответа: норморецепторный (1-й тип), гипер-эстроген-прогестерон-рецепторный (2-й тип), гипер-эстроген-рецепторный (3-й тип) и гипер-про- гестерон-рецепторный (4-й тип). Гормон-рецепторный ответ 1-го типа, без достовер- ных отличий от контрольной группы, был обнаружен у 38 (81%) женщин с полноценной секреторной трансфор- мацией эндометрия и у 8 (13%) женщин с неполноцен- ной секреторной трансформацией слизистой матки. У 8 женщин с неполноценной секреторной транс- формацией эндометрия норморецепторный ответ сочетался с нормальными показателями уровней эстрадиола и прогестерона в крови (E2 -782,6±149 пмоль/л, и P - 55,8±6,4 нмоль/л) при достоверно более низком соотношении E2/P - 13,6±1,7 у. е. (p<0,05) в сравнении с контрольной группой и группой женщин с полноценной секреторной трансформацией. Воз- можно, достоверно более низкое соотношение Е2/Р объясняет несоответствие морфологической картины неполноценной секреторной трансформации желез и стромы и нормального гормон-рецепторного ответа, что позволяет исключить истинную недостаточность лютеиновой фазы менструального цикла. Гормон-рецепторный ответ 2-го типа наблюдался у 36 (60%) женщин с неполноценной секреторной трансформацией эндометрия и в 10 раз реже (у 3 (6%) женщин) с полноценной его секреторной транс- формацией. Уровни половых гормонов (эстрадиола и прогестерона) в крови не имели достоверных отличий в сравнении с контрольной группой. Гормон-рецепторный ответ 3-го типа встречался с одинаковой частотой как у женщин с полноценной се- креторной трансформацией эндометрия, так и у женщин с неполноценной стадией секреции (у 2 (4,2%) и 3 (5%) женщин соответственно). В сравнении с контрольной группой этот тип гормон-рецепторного ответа характе- ризовался достоверно высокими показателями рецеп- торов эстрогенов в железах (H-score 235±35 и 220±11,5 у.е. соответственно) при нормальных показателях ре- цепторов прогестерона в эндометрии и референтных значениях уровней гормонов (E2 и P) в крови. Уровень P в крови у 2 женщин с полноценной стадией фазы секреции при референтных его значениях был достоверно выше в сравнении с этим показателем у женщин контрольной группой (52,3±4,5 и 39,0±5,2 нмоль/л соответственно). Гормон-рецепторный ответ 4-го типа в 2,5 раза чаще был обнаружен у женщин с неполноценной ста- дией фазы секреции, чем у пациенток с полноценными секреторными изменениями эндометрия (13 (21,7%) и 4 (8,5%) соответственно). В сравнении с контрольной группой при данном гормон-рецепторном типе были обнаружены достоверно высокие показатели рецеп- торов прогестерона в железах (H-score 227,5±21,4 и 231,5±12 у.е.) при нормальных показателях рецеп- торов эстрогенов и достоверно высоких значениях прогестерона в крови (51,4±10,1 и 60,8±6,6 нмоль/л), а также относительно низком соотношении Е2/Р (8,7±1,6 и 11,7±1,5 у.е.). Заметим, что выявленные три варианта гиперре- цепторного ответа в эндометрии у 9 женщин с полно- ценной секреторной трансформацией наблюдались на фоне выраженного фиброза стромы как проявления хронического эндометрита. Уровни E2 и P в крови, рецепторы эстрогенов и прогестерона (H-score) в эндометрии при овуляторном цикле женщин с нарушением репродуктивной функции c полноценной секреторной трансформацией эндометрия, M±m Таблица 1 Показатель Контрольная группа Основная группа Тип гормон-рецепторного ответа р 1-й, n=38 2-й, n=3 3-й, n=2 4-й, n=4 Е2, пмоль/л 762,2±148,3 622,7±50,7 471±64 764±84 520,7±176,3 >0,05 Р, нмоль/л 39,0±5,2 39,6±3.9 30,0±8,6 52,3±4,5 51,4±10,1 КГ-3=0,04* КГ-4=0,03* E2/P, у. е. 18,3±1,7 17,6±1,4 17,0±2,3 14,5±0,3 8,7±1,6 ER в железах, у. е. 72,2±13,6 104,2±7,5 240±17,3 235±35 92,5±17 1-4=0,03* КГ-2=0,014* КГ-3=0,04* 1-2=0,005** ER в строме, у. е. 88,9±12,9 107,9±11,1 190±58,6 220±10 115±37,1 >0,05 КГ-2=0,014* 226,7±21,9 30±3 227,5±21,4 КГ-5=0,006** 1-2=0,004** 1-4=0,001** Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01. 276,7±6,7 285±5 240,0±20,4 КГ-1=0,004** ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 65 Клинические исследования Уровни E2 и P в крови, рецепторы эстрогенов и прогестерона в эндометрии (H-score) Таблица 2 при овуляторном цикле у пациенток с нарушением репродуктивной функции c неполноценной секреторной трансформацией эндометрия, M±m Показатель Контрольная группа Основная группа р Показатель Контрольная группа Тип гормон-рецепторного ответа р Показатель Контрольная группа 1-й, n=8 2-й, n=36 3-й, n=3 4-й, n=13 р Е2, пмоль/л 762,2±148,3 782,6±149,1 697,3±51,5 637,5±51,3 727,2±127,5 >0,05 Р, нмоль/л 39±5,2 55,8±6,4 40,5±2,7 48,7±13,4 60,8±6,6 КГ-4=0,02* 1-2=0,03* 2-4=0,01** E2/P, у. е. 18,3±1,7 13,6±1,7 19±1,9 15,7±5,3 11,7±1,5 КГ-1=0,02* КГ-4=0,02* 2-4=0,02* ER в железах, у. е. 72,2±13,6 91,2±15,2 256,1±7,4 220±11,5 108,5±5,9 КГ-2=0,000002** КГ-3=0,014* КГ-4=0,01** 1-2=0,00001** 1-3=0,02* 2-4=0,000000001** 3-4=0,01** ER в строме, у. е. 88,9±12,9 140±21.4 196,7±13,4 213,3±8,8 84,6±14,5 КГ-2=0,003** 2-4=0,0001** 3-4=0,02* PR в железах, у. е. 34,4±11,2 98,7±22,3 276,9±4,8 56,7±17,6 231,5±12 КГ-1=0,02* КГ-2=0,000001** КГ-4=0,0001** 1-2=0,00002** 1-4=0,0003** 2-3=0,005** 2-4=0,001* 3-4=0,01** PR в строме, у. е. 210±17 236,2±22,7 276,1±3,7 276,7±6,7 256,1±10,3 КГ-2=0,001** 1-2=0,03* 2-4=0,04* Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01. Установлено, что более чем у половины женщин (60 (56%)) с репродуктивными неудачами в анам- незе, с овуляторным менструальным циклом при референтных уровнях эстрадиола и прогестерона в крови определяется неполноценная секреторная трансформация эндометрия, т. е. вариант недоста- точности лютеиновой фазы (НЛФ) менструального цикла. Полученные данные согласуются с результа- тами исследований В.М. Сидельниковой и др. [3], А.Г. Давудовой [1] о частоте НЛФ у женщин с репро- дуктивными дисфункциями, хотя указанные авторы применяли только гистологическое, но не проводили иммуногистохимическое исследование эндометрия. Комплексный клинико-лабораторно-морфоло- гический подход при оценке горомон-рецепторного взаимодействия в эндометрии позволил выделить у 46 (43%) женщин основной группы нормальный (норморецепторный) гормон-рецепторный ответ эндометрия и у 61 (57%) пациентки нарушенный гормон-рецепторный ответ эндометрия трех типов. Гипер-эстроген-прогестерон-рецепторный ответ с синхронно высокими рецепторами обоих гормонов в эндометрии был обнаружен у 39 (36%) женщин, гипер-прогестерон-рецепторный с высокими только PR - у 17 (16%) и гипер-эстроген-рецепторный ответ с высокими рецепторами только эстрогенов был обнаружен у 5 (5%) женщин. У пациенток с неполноценной секреторной трансформацией эндометрия (n=60) все три типа нарушений гормон-рецепторного ответа (52 (87%)) наблюдались достоверно чаще (р<0,01). Выявлено, что у 9 (19%) пациенток с овуляторным менструальным циклом при полноценной секреторной трансформации эндометрия и референтных уровнях P в крови были определены гипер-гормон-рецепторные типы ответов слизистой матки на фоне перенесенного хронического эндометрита, что, вероятно, явилось причиной изменения гормон-рецепторного ответа на ранней клеточно-молекулярной стадии [6]. Выявленные нарушения рецептивности эндоме- трия независимо от морфологических изменений (фи- броз стромы, неполноценная стадия фазы секреции при НЛФ) характеризуются сходством и проявляются в виде гиперэкспрессии ER и PR как в железах, так и в строме. При этом наиболее значимым показателем гормон-рецепторного ответа являются PR в железах эндометрия, достоверное снижение которых на 6-8-й день после овуляции отражает полноценный гормон- прогестерон-рецепторный ответ. Нами выделены иммуногистохимические критерии нормальной ре- цепторности эндометрия в лютеиновую фазу овари- ального цикла: 1) синхронное достоверное снижение экспрессии PR в железах эндометрия при постоянстве 66 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Клинические исследования их гиперэкспрессии в строме; 2) тенденция к сниже- нию экспрессии эстрогеновых рецепторов как в же- лезах, так и в строме эндометрия. Полученные нами данные соотносятся с физиологическими эффектами P в среднюю секреторную фазу менструального цикла на эндометрий, которые заключаются в торможении экспрессии ER и PR в железах [2, 7, 8]. В целом, по данным гормонального, ультразву- кового исследований, морфологической оценки образцов эндометрия, полученных на 6-8-й день по- сле овуляции, выявлено, что у более чем у половины женщин с репродуктивными неудачами в анамнезе при овуляторном овариальном цикле имели место неполноценные секреторные изменения эндометрия и снижение его рецепторности. При этом у 76 (71%) пациенток основной группы в анамнезе были внутри- маточные вмешательства, из них у 46 (60,5%) было два и более выскабливаний полости матки. В группе из 61 женщины с выявленными патологическими ги- перрецепторными вариантами гормон-рецепторного ответа эндометрия два и более выскабливаний поло- сти матки в анамнезе были у 36 (59%) пациенток. Ве- роятно, травматическое воздействие на эндометрий в анамнезе является одним из факторов снижения рецептивности эндометрия. Следовательно, каждой второй женщине с отя- гощенным репродуктивным анамнезом при наличии овуляторного менструального цикла необходимо проведение терапии гестагенами на предгравидар- ном этапе. Выводы 1. Овуляторный уровень P в периферической крови не является однозначным фактором, обеспечиваю- щим полноценные фазовые секреторные преобра- зования эндометрия. 2. Сочетанный анализ соотношений значений уровня P в крови и показателей морфологического (гистологического и иммуногистохимического) ис- следования эндометрия у женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе позволяет более точно определить полноценность секреторных преоб- разований эндометриальной ткани, выявить признаки снижения рецепторности эндометрия, определить контингент пациенток, которым требуется дополни- тельная терапия гестагенами на предгравидарном этапе.

About the authors

S S Aganezov

V N Ellinidi

K Yu Ponomarenko

Email: dr.k.ponomarenko@gmail.com

A V Morotskaya

N V Aganezova

References

Supplementary files