Morphological substantiation of clinical efficacy of platelet rich plasma in males with androgenic alopecia

Full Text

Введение. В последнее десятилетие богатая тромбоцитами плазма (БоТП) широко применяется в лечении заболеваний волосистой части головы, сопровождающихся выпадением волос, - гнездной [8], рубцовой [14], а также андрогенетической ало- пеции (АГА) [6]. В лечении АГА применение БоТП в виде монотерапии также представляется высокоэф- фективной методикой [2]. Z.J. Li et al. [5] указывают на то, что БоТП способствует пролиферации и про- должительности жизни клеток дермального сосочка во время цикла роста волос в результате экспрессии фактора роста фибробластов и β-катенина вместе с активацией внеклеточной сигнал-опосредованной киназы и Akt-сигнального пути, продлевая фазу анагена. БоТП увеличивает длительность суще- ствования клеток за счет ингибирования апоптоза, повышает уровень антиапоптотических белков Bcl-2, что клинически проявляется в снижении интенсивности выпадения волос (доли телогена). C.O. Uebel et al. [10] предполагают, что факторы роста, содержащиеся в тромбоцитах, связываются с чувствительными к ним рецепторами и активируют пролиферативную фазу волос, что дает возможность росту новых фолликулярных юнитов. M.A. Gkini et al. [3] провели систематический обзор 14 опубликованных исследований о применении БоТП в лечении АГА, среди которых основными клинически- ми результатами являлось увеличение плотности и снижение выпадения волос. Однако при имеющихся положительных результатах влияния БоТП на рост волос на моделях в пробирке и высокой клиниче- ской эффективности при лечении АГА ее эффекты на морфофункциональное состояние волосяных фолликулов (ВФ) отсутствуют. Цель исследования. Морфологически обосно- вать клиническую эффективность БоТП в лечении пациентов, страдающих АГА. Материалы и методы. Под наблюдением на- ходилось 22 пациента в возрасте от 20 до 43 лет (средний возраст 30,5±2,7 лет). У 20 пациентов диагностирована II-IV степень тяжести АГА по шкале Hamilton - Norwood [4], у 2 пациентов - I степень. Средняя длительность заболевания составляла 3,3±0,91 года. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 67 Клинические исследования Для получения БоТП у каждого пациента путем венопункции забирали 18 мл крови в 2 пробирки с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта исполь- зовался 3,8% цитрат натрия в соотношении 1:9. Про- водили двукратное центрифугирование крови с ис- пользованием центрифуги «GT 416» фирмы «Glotech Co., Ltd» (Корея), имеющей горизонтальный ротор и режим «софт-старт». Первое центрифугирование проводили в течение 5 мин на скорости 1800 об/мин, после чего отделяли эритроцитарную массу. Плаз- ма, содержащая лейкоцитарный и тромбоцитарный слои, подвергалась второму центрифугированию на скорости 2500 об/мин в течение 10 мин. В качестве БоТП использовали 2 мл нижней части супернатанта из каждой пробирки, отделение плазмы производили вручную. В качестве активатора применяли офици- нальный раствор хлористого кальция в соотношении 1:20. Поверхность кожи головы обрабатывалась раствором хлоргексидина, местную анестезию не применяли. Полученную БоТП вводили в кожу во- лосистой части головы путем микроинъекций ин- традермально, приблизительно по 0,15 мл на одну инъекцию. Процедуры проводили 1 раз в 4 недели, курс состоял из 4 процедур. От всех пациентов полу- чено информированное согласие на обследование и лечение. Клиническую эффективность терапии оценивали по динамике морфометрических показателей роста волос. Трихологическое исследование выполняли с помощью цифровой видеокамеры «Aramo S» фирмы «Аram HuvisCo., Ltd.» (Корея) и компьютерной про- граммы TrichoSciencePro v1.3RUS. Плотность волос определяли на 1 см2, долю веллусных и телогеновых волос - в %, средний диаметр всех волос - в мкм, соотношение волос в стадии телогена/анагена - как количество анагеновых волос на 1 телогеновый. Точки контроля были помечены татуажной меткой и находи- лись в теменной зоне, приблизительно на 2 см ближе к центру от границы поредения волос. Биоптаты кожи для гистологического исследо- вания были получены от 11 пациентов до и после лечения. Биопсию кожи проводили под местной анестезией 1% раствором лидокаина с эпинеф- рином для достижения анальгезии и уменьшения кровотечения. Забор материала проводили панчем для биопсии диаметром 4 мм [11, 12]. Кусочки кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2), обезвоживали в спиртах возрастающей кон- центрации и заливали в парафин по стандартной методике. При приготовлении срезов проводили один горизонтальный разрез на глубине около 1 мм ниже поверхности эпидермиса. Обе отрезанные стороны образца заливали в кассете, ориентируя срезанным краем в одну сторону. При приготов- лении горизонтальных срезов по мере того, как микротом делал более глубокие срезы блока, они становились все более поверхностными с одного конца образца и более глубокими с другого. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологический анализ включал оценку пока- зателей на горизонтальных срезах и проводился на 4 уровнях: на уровне подкожной жировой клетчат- ки (ПЖК), потовых желез, сальных желез и устьев ВФ. Плотность волос оценивали на всех уровнях. Диаметр стержней волос, количество веллусных и миниатюризированных волос рассчитывали на уровне сальных желез ВФ. Веллусными считали во- лосы, диаметр стержня которых был равен толщине внутренней оболочки фолликула или меньше ее и составлял ≤0,03 мм. Волосы в стадиях анагена, ката- гена и телогена подсчитывались на уровне сальных желез. К телогеновым относили волосы, у которых отсутствовала внутренняя оболочка или на стадии позднего телогена определялось нерегулярное скопление базалеоидных звездчатых клеток в форме островков с ядрами, расположенными по перифе- рии. К волосам в фазе анагена относили волосы, характеризующиеся наличием внутренней оболочки корня волоса и отсутствием некроза клеток. Гисто- логическое исследование выполнялось с помощью сканирующей системы «3DHistech Pannoramic» и компьютерной программы Pannoramic Viewer 1.15.4 фирмы «3DHISTECH Ltd», (Венгрия). Статистическая обработка и визуализация ре- зультатов осуществлялась при помощи программы Microsoft Office Excel (версия 15.0.50.31.1000, 2013) и стандартных средств языка программирования R (версия 3.4.37). Для отображения центра распре- деления использовалось среднеарифметическое с указанием доверительного интервала. Рассчиты- вали p-value - вероятность ошибки при отклонении нулевой гипотезы (вероятность ошибки первого рода), значение p<0,05 считалось статистически значимым [1]. Результаты и их обсуждение. В ходе лечения пациентов БоТП отмечена выраженная клиническая эффективность, которая состояла в достоверном увеличении плотности волос (D11%; p=0,00025) и среднего диаметра волос (D10%; p=0,00766), а также в достоверном снижении доли веллусных волос (D14%; p=0,00959), таблица 1, рисунок 1. Таблица 1 Динамика показателей фототрихологического исследования 68 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Клинические исследования а б Рис. 1. Фототрихограмма: а - до лечения; б - через 4 месяца после лечения, ув.×60 а б Рис. 2. Горизонтальный срез кожи на уровне ПЖК: а - до лечения; б - через 4 месяца после лечения. Окраска гематоксилином и эозином, ув. ×120 а б Рис. 3. Горизонтальный срез кожи на уровне сальных желез: а - до лечения, б - через 4 месяца после лечения. Окраска гематоксилином и эозином, ув. ×100 Клинически определяемое увеличение плотности волос сопровождалось достоверным увеличением количества ВФ на уровне ПЖК (D148%; p=0,0034) и на уровне потовых желез (D65%; p=0,0326), также наблюдалась тенденция к росту их числа на уровне сальных желез. Это может быть следствием пере- хода некоторого количества волос из состояния веллусных в состояние терминальных, которые имеют большую глубину залегания ВФ. Подтверж- дением этого является достоверное снижение доли телогеновых волос (D -47%; p=0,0153), тенденция к увеличению количества волос в фазе анагена по отношению к количеству волос в стадии телогена (соотношение анаген/телоген, D103%; p=0;0562), таблица 2, рисунок 2, 3. Разница в клиническом и гистологическом иссле- дованиях показателей доли веллуса и телогена может быть связана с малым объемом выборки и различием размера участка для клинической оценки и размером биоптата. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 69 Клинические исследования Динамика показателей морфологического исследования Таблица 2 Показатель До лечения После лечения P-value Уровень луковицы ВФ (подкожной жировой клетчатки) Количество ВФ, M±m 49±36,8 121,3±37,2 0,0034 Уровень потовых желез Количество ВФ, M±m 93,4±34,1 154,5±56,8 0,0326 Уровень сальных желез Количество ВФ, M±m 157,1±43,1 197,2±36,3 0,0959 Доля веллуса, %, M±m 48,1±14 37,2±26 0,3286 Средний диаметр, мкм, M±m 30,1±4,1 38,7±10,7 0,0752 Доля телогена, %, M±m 30,4±8,8 16,2±9,6 0,0153 Количество анагена на один телоген, M±m 2,82±1,2 5,73±3,2 0,0562 Количество телогеновых волос, M±m 49,2±18,5 32,3±20,9 0,1355 Уровень устья ВФ Количество ВФ, M±m 209,3±36,5 207±21,6 0,8912 Полученные нами результаты согласуются с данными о молекулярных и биологических эффек- тах БоТП на ВФ, предположительно связанных с факторами роста, содержащимися в тромбоцитах. N. Takakura et al. [9] указывают на то, что сигна- лы тромбоцитарного фактора роста вовлечены в эпидермально-мезенхимальное взаимодействие, необходимое для формирования канала волос и роста мезенхимальной ткани. В 2001 г. K. Yano [13] обозначил фактор роста эндотелия сосудов, со- держащийся в тромбоцитах, как важный медиатор роста ВФ и доказал, что анаген-ассоциированный ангиогенез способствует росту волос и увеличению фолликула в размерах. Также важную роль в раз- витии ВФ и поддержании цикла роста волос играет сигнальный путь Wnt/β-catenin. Белок Wnt10b (кано- нический Wnt) способствует росту стержня волоса в культуре волосяного фолликула и пролиферации клеток волосяного матрикса. БоТП способствует формированию эпителия волос и дифференциров- ке стволовых клеток ВФ посредством повышающей регуляции β-катенина, сильно выраженной в области сосредоточения стволовых клеток ВФ («балдж»-зоне) [7]. Совокупность этих эффектов БоТП на ВФ клини- чески проявляется в увеличении плотности волос, увеличении их толщины и переходе из состояния веллуса в терминальное, а гистологически - в увели- чении количества волос в более глубоких слоях кожи и снижении доли телогеновых волос. Заключение. Положительный клинический эф- фект терапии БоТП у мужчин, страдающих АГА, об- условлен достоверными морфофункциональными изменениями волосяных фолликулов. Данные эффек- ты БоТП на ВФ возможны при условии обратимости патоморфологических процессов и не являются специфичными для АГА, что делает актуальными дальнейшие исследования о возможном влиянии БоТП на экспрессию специфичных белков, запускающих патологические сигнальные пути.

About the authors

E E Pakhomova

Email: spbclv@mail.ru

I O Smirnova

I N Telichko

References

Supplementary files