Taxonomic and applied value of profiles utilization of protein amino acids of bacteria Acinetobacterbaumannii, Acinetobacterpittii, Acinetobacternosocomialis

Full Text

Введение. Приоритетные для раневых и госпи- тальных инфекций бактерии A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis объединяют при лабораторной диагно- стике в «комплекс A. calcoaceticus-A. baumannii» ввиду их сходства. Видовая идентификация ацинетобакте- ров еще несовершенна и достоверно осуществляется матрично-активированной лазерной десорбцией/ ионизацией с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS) и молекулярно-генетическими мето- диками. В систематике ацинетобактеров применялись пробы утилизации аминокислот как единственных ис- точников углерода только в ограниченном диапазоне - от трех [5] до семи [3] аминокислот. Ранее нами была выявлена существенная таксономическая значимость профилей утилизации всех 20 белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода для псевдомонад [7] и клебсиелл [2]. Представляет интерес использование этого методического подхода для изучения бактерий наиболее актуальных видов ацинетобактеров. Цель исследования. Определить значение про- филей утилизации всех белковых аминокислот в ка- честве единственного источника азота и углерода для видовой и внутривидовой идентификации ацинето- бактеров, разработки селективных питательных сред и видовой идентификации методом MALDI-TOF MS. Материалы и методы. Объектами исследования были 134 штамма бактерий рода Acinetobacter, в том числе A. baumannii - 118, A. pittii - 9, A. nosocomialis - 7 штаммов. Все штаммы были выделены в 2017-2018 гг. из клинического материала в клинико-бактери- ологической лаборатории Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Штаммы идентифициро- вали традиционными биохимическими пробами. До- полнительно осуществляли видовую идентификацию всех штаммов, используя методику MALDI-TOF масс- спектрометрии в Научно-исследовательском институ- те эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Все указанные штаммы находятся в рабочей коллекции культур Е.П. Сиволодского. Использовали 20 ами- нокислот, входящих в состав белков, производства фирм «Merck» (Соединенные Штаты Америки - США), «Reanal» (Венгрия), «Реахим» (Россия): L-аспарагин (Asn), L-аспарагиновая кислота (Asp), L-глютамин (Gln), L-глютаминовая кислота (Glu), L-аланин (Ala), глицин (Gly), L-лизин гидрохорид (Lys), L-аргинин гидрохлорид (Arg), L-гистидин гидрохлорид (His), L-метионин (Met), L-цистеин гидрохлорид (Cys), L-треонин (Thr), L-тирозин (Tyr), L-триптофан (Try), L-фенилаланин (Phe), L-лейцин (Leu), L-изолейцин (Ile), L-валин (Val), L-серин (Ser), L-пролин (Pro). Бактерии выращивали на питательной среде ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 113 Экспериментальные исследования «Колумбийский агар сухой» производства Научно-ис- следовательского центра фармакотерапии (г. Санкт- Петербург). Для изучения профилей утилизации аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода использовали минимальный агар, приготовленный на дистиллированной воде, содер- жащей (г/л): NaCl - 5, Na2SO4 - 2, KH2PO4 - 1, K2HPO4 - 2,5; MgSO4 - 0,1; агар бактериологический фирмы «Difco» (США) - 15, 1,6% водный раствор бромтимолового синего 4 мл, рН 7,2; стерилизация при 120оС 20 мин. Каждую из исследуемых аминокислот вносили в отдельную колбу с 50 мл горячей среды в количестве 0,1 г (L-тирозин 0,05 г), корректировали рН до 7,2 по окраске индикатора в среде, разливали в чашки Петри. В контроле применяли минимальный агар без аминокислоты. В качестве инокулята использовали культуры бактерий, выросших на питательном агаре при 37оС в течение 18-24 ч, которые отбирали по полной петле (d=2мм) и суспендировали в 0,2 мл сте- рильного 0,85% раствора NaCl в лунках стерильного полимерного планшета. Чашки сред с аминокислотой и контрольную среду разделяли на 8 секторов и марки- ровали по номерам штаммов. Засевали исследуемую культуру по полной петле взвеси из лунки (посевная доза 1×107 колониеобразующих единиц (КОЕ) ради- альным штрихом на сектор чашек с аминокислотами и контроля. Посевы выращивали при 37оС в течение 3 суток, просматривая ежедневно. Положительным результатом утилизации аминокислот считали на- личие четко выраженного газона бактерий по следу посева при отсутствии роста на контрольной среде без аминокислоты. Профили утилизации различных видов ацинетобактеров сравнивали, используя коэф- фициент сходства Жаккарда: Sj=a/a+b, где а - число совпадающих положительных результатов утилизации аминокислот; b - число несовпадающих результатов, выявленных при сопоставлениях профилей утилиза- ции аминокислот штаммов каждого варианта профиля по отношению к профилю с большинством штаммов (среди профилей всех видов ацинетобактеров). Для идентификации видов ацинетобактеров согласно методике MALDI-TOF MS использовали настольный MALDI-TOF масс-спектрограф «Microflex» с базой данных MALDI Biotyper фирмы «Bruker Daltonics» (Гер- мания). Подготовку к исследованию чистых культур бактерий и проведение исследований осуществляли в соответствии с инструкцией к прибору. Уровень идентификации бактерий трактовали по критериям, указанным в инструкции: ранг 2,300 - 3,000 высокая вероятность идентификации вида; 2,000 - 2,299 на- дежная идентификация рода, вероятная идентифи- кация вида; 1,700 - 1,999 вероятная идентификация рода; 0.000 - 1,699 ненадежная идентификация. Результаты и их обсуждение. При изучении 118 штаммов вида A. baumannii были выявлены 14 вариан- тов профилей утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственных источников азота и углерода (табл.). A. baumannii утилизировали от 2 до 12 аминокислот. Преобладал профиль № 1 (утилизация только Ala, Glu, Gln, Asp, Pro, Arg, His, Try, Tyr, Phe), выявленный у 35 (29,6%) штаммов. Профили № 1-6 в совокупности имели 103 (87,3%) штаммов. Штаммы остальных про- филей выявлялись редко (по 1-5 штаммов). Показа- тель видового сходства по коэффициенту Жаккарда, обоснованный нами ранее [7], имели большинство вариантов профилей, кроме № 7 (Sj - 0,54) и № 14 (S j - 0,18). Штаммы профилей № 7 и № 14 были определены с помощью методики MALDI-TOF MS как вид A. baumannii с рангом 2,300, но требуют дополнительно- го молекулярно-генетического изучения. Нами впервые выявлена необычно высокая ча- стота штаммов A. baumannii, которые не утилизи- руют L-гистидин (His-) - 56 (47,4%) штаммов. Они входят в шесть вариантов профилей (№ 3-8) и часто сопряжены с утратой утилизации L-аспарагина и L-триптофана. Признаки утилизации L- гистиди- на или отсутствия его утилизации очень четкие и стабильные. При утилизации L-гистидина наблю- дается пышный газон роста бактерий через 18-24 ч инкубации при 37оС; при отсутствии утилизации L-гистидина наблюдается полное отсутствие роста бактерий через 18-24 ч, которое сохраняется более 3 суток. Утилизация L-аспарагина и L-триптофана у многих штаммов A. baumannii замедленная: через 24 ч нет роста бактерий, однако через 48-72 ч появ- ляется газон роста бактерий, что трактуется как по- ложительная утилизация. В отношении L-гистидина отсутствие роста A.baumannii через 18-24 ч уже достаточно, чтобы трактовать результат как оконча- тельно отрицательный. У пациентов и умерших при ацинетобактер инфекции повторные штаммы со- храняют исходный фенотип утилизации L-гистидина. Предлагаем подразделить все штаммы A. baumannii на два трофовара: гистидинположительный трофо- вар (His+), который утилизирует L- гистидин в каче- стве единственного источника азота и углерода, и гистидинотрицательный трофовар (His-), который не утилизирует L-гистидин в качестве единственного источника азота и углерода. Определение указанных трофоваров может быть полезным для эпидемиоло- гического надзора ацинетобактер инфекции. По дан- ным A. Nemec et al. [6], утилизируют L- гистидин 96% штаммов A. baumannii, по данным E.L. Carr et al. [3], P.Gerner-Smidt et al. [5], - 100% штаммов. Эти данные были получены на малом количестве исследованных штаммов (по 25 штаммов). При этом L-гистидин из- учали как единственный источник только углерода. Установлено, что 95,8±1,8% штаммов A. baumannii утилизируют L-фенилаланин в качестве единствен- ного источника азота и углерода. Этот показатель свидетельствует о потенциально высокой диагности- ческой чувствительности селективной питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар», разрабо- танной нами ранее для выделения и идентификации бактерий «комплекса A. calcoaceticus-A. baumannii» [1]. У бактерий A. pittii выявлены три варианта про- 114 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Профили утилизации белковых аминокислот бактериями Acinetobacter Таблица Номер профиля Профиль утилизации аминокислот Число штаммов профиля Sj Номер профиля Ala, Glu, Gln, Pro, Asp Arg His Asn Try Tyr Phe Leu Lys, Ser, Gly, Val, Ile, Thr, Cys, Met Число штаммов профиля Sj Acinetobacter baumannii ( n=118) 1 + + + + + + + - - 35 1 2 + + + + + + + + - 11 0,91 3 + + - + + + + - - 22 0,91 4 + + - + + + + + - 8 0,91 5 + + - - - + + - - 12 0,72 6 + + - + - + + - - 12 0,82 7 + + - - - - - - - 1 0,54 8 + + - + + - + - - 1 0,82 9 + + + + - + + - - 2 0,90 10 + + + + - + + + - 5 0,83 11 + + + + + + - - - 2 0,91 12 + + + + - + - - - 1 0,82 13 + - + + - + + + - 2 0,75 14 - + + - - - - - - 1 0,18 Acinetobacter pittii (n=9) 1 + + + + + + + - - 6 1 11 + + + + + + - - - 1 0,91 12 + + + + - + - - - 2 0,82 Acinetobacter nosocomialis (n=7) 1 + + + + + + + - - 4 1 9 + + + + - + + - - 2 0,90 15 + + + + - - + - - 1 0,82 Примечание : + - утилизация аминокислоты; - - нет утилизации аминокислоты; Sj - коэффициент Jaccard. филей утилизации аминокислот, которые полностью соответствуют профилям № 1, 11, 12 A. baumannii. У них также преобладает профиль № 1. Утилизируют L-фенилаланин 66,7% штаммов. У бактерий A. nosocomialis выявлены три профиля утилизации аминокислот № 1, 9, 15, из которых № 1 и № 9 соответствуют A. baumannii; профиль № 15 оригинальный, только у A. nosocomialis. Утили- зируют L- фенилаланин 100% штаммов A. nosoco- mialis. Полученные данные указывают на близкое фенотипическое сходство по утилизации белковых аминокислот бактерий A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis и подтверждают правомерность объ- единения этих видов в «комплекс A. calcoaceticus-A. baumannii» [5, 6]. У бактерий видов A. nosocomialis, A. pittii отсут- ствует трофовар His-, что отличает их от A. baumannii. Применение методики MALDI-TOF MS для иденти- фикации бактерий A. baumannii выявило высокую ве- роятность идентификации вида у 55 (46,6%) штаммов; вероятную идентификацию вида у 47 (39,9%) штам- мов; вероятную идентификацию рода у 16 (13,5%) штаммов. У бактерий A. pittii только один штамм имел высокую вероятность идентификации вида, 6 штам- мов имели вероятную идентификацию вида, 2 штамма - вероятную идентификацию рода. Среди бактерий A. nosocomialis имел высокую вероятность иденти- фикации вида 1 штамм, вероятную идентификацию вида - 5 штаммов, вероятную идентификацию рода - 1 штамм. Следовательно, этой методикой надежно идентифицирован вид 86,5% штаммов A. baumannii и большинства штаммов A, pittii, A. nosocomialis. Однако у 13,5% штаммов A. baumannii идентификация вида недостаточно надежная. Вероятно, это обусловлено отсутствием в используемой нами базе данных MALDI Biotyper представителей новых видов, входящих в комплекс A. calcoaceticus-A. baumannii: A. dijkshoor- niae, A. seiferti [4] Заключение. У A. baumannii обнаружены 14 про- филей утилизации белковых аминокислот в качестве единственных источников азота и углерода. Они утилизируют от 2 до 12 аминокислот, у них преоб- ладет профиль с утилизацией 11 аминокислот. Ви- довое сходство по коэффициенту Жаккарда имеют ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 115 Экспериментальные исследования бактерии 12 профилей. Впервые выявлено широкое распространение штаммов A. baumannii, которые не утилизируют L-гистидин - 47,4%. Признаки ути- лизации L-гистидина или отсутствия его утилизации стабильно сохраняются у повторных штаммов, вы- деленных у пациентов с ацинетобактер инфекцией. Предлагается подразделять штаммы A. baumannii на 2 трофовара: гистидинположительный трофовар (His+), который утилизирует L-гистидин в качестве единственного источника азота и углерода, и гисти- динотрицательный трофовар (His-), который его не утилизирует. Установлено, что 95,8±1,8% штаммов A. baumannii утилизируют L-фенилаланин в каче- стве единственного источника азота и углерода, что определяет потенциально высокую диагностическую чувствительность селективной питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса A. calcoaceticus- A. baumannii. У бактерий видов A. pittii и A. nosoco- mialis обнаружено близкое фенотипическое сходство с A. baumannii по профилям утилизации белковых аминокислот, что подтверждает правомерность объ- единения этих видов в комплекс A. calcoaceticus-A. baumannii. У бактерий видов A. pittii, A. nosocomialis нет гистидинотрицательного трофовара His-, что от- личает их от A. baumannii.

About the authors

E P Sivolodskii

Email: vmeda-nio@mil.ru

E V Zueva

References

Supplementary files