Possibilities of biological control of extracorporeal photochemotherapy

Full Text

Введение. Терапия «будущего» представляет со- бой воздействие на клеточные механизмы внутренней среды организма и регуляцию системы гомеостаза [2]. Недостаточная эффективность применяемых ле- карственных средств, выраженные побочные эффекты и их непереносимость способствуют поиску новых подходов лечения, основанных не только на введении в организм лекарств, но и их выведения, замещения и обработки крови больных [1]. Одним из современных и перспективных направ- лений экстракорпоральной гемокоррекции является экстракорпоральная фотохимиотерапия или экстра- корпоральный фотоферез (ЭКФ) [13]. Впервые ЭКФ применил Эдельсон в 1987 г. для ле- чения Т-клеточной лимфомы кожи [8]. Предшествен- ником фотофереза была PUVA-терапия (Psoralens and Ultra Violet А-терапия), активно применявшаяся в дер- матологии в XX в. Но данная методика используется только при поражении кожных покровов и неэффек- тивна при системной патологии [12]. На сегодняшний день ЭКФ представляет собой неагрессивную имму- номодулирующию терапию с низким спектром токсич- ности [5]. ЭКФ уменьшает реактивность иммунной системы, способствуя развитию иммунологической толерантности к собственным клеткам и тканям [7]. В то же время это позволяет поддерживать иммунную целостность как гуморального, так и Т-клеточного ответа на внешние патогены [26]. ЭКФ применяется при синдромах и заболеваниях, в патогенетической основе которых основную роль играют Т-лимфоциты [19]. Кроме того, ЭКФ входит в состав комбинированной терапии некоторых аутоим- мунных заболеваний с преимущественным вовлече- нием клеточного звена приобретенного иммунитета - вульгарная пузырчатка [21], системный склероз [14], ревматоидный артрит [15], болезнь Крона [4] и рассеянный склероз [6]. Более того, ЭКФ был рекомендован Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых про- дуктов и медикаментов в Соединенных Штатах Аме- рики (США) для купирования отторжения трансплан- тата сердца, почек, легких [3, 16, 17, 24, 25], лечения острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина» после аллогенной стволовой пересадки гемопоэтических клеток резистентной к обычной иммуносупрессивной терапии [11, 20]. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 123 Экспериментальные исследования ЭКФ является методикой терапевтического афере- за, которая включает в себя сепарацию мононуклеар- ных клеток из сосудистого русла, экстракорпоральное облучение их ультрафиолетовыми лучами в присут- ствии фотосенсибилизирующего агента и реинфузию обработанных клеток обратно пациенту [18]. Одним из главных механизмов действия ЭКФ на мононуклеарные клетки периферической крови явля- ется активация внутриклеточных каспаз, отвечающих как за индукцию апоптоза, так и за синтез некото- рых цитокинов [27]. Активация каспаз в цитоплазме клетки возможна по рецептор-зависимому или по митохондриальному сигнальным путям. Так, в случае рецептор-зависимого пути запуска апоптоза ключевая роль отводится активации инициирующей каспазы-8, в составе продомена которой имеются повторы DED для взаимодействия с белком FADD. При митохон- дриальном сигнальном пути индукции апоптоза клю- чевое место отводится каспазе-9, в составе которой находится домен CARD, отвечающий за связывание с аналогичным доменом белка APAF-1, что, в конечном итоге, приводит к формированию апоптосомы. Оба эти пути направлены на активацию каспазы-3 - ключе- вую эффекторную каспазу эукариотических клеток. До настоящего времени точно не исследовано, какой из путей активации каспаз имеет место при проведении ЭКФ, но увеличение уровня апоптоза в клетках после данной процедуры отмечается в немногочисленных работах по данной проблематике [10]. Хотя ЭКФ на- ходится в клиническом применении более 25 лет и широко используется в терапии многих заболеваний и синдромов с нарушением иммунореактивности, механизм лечебного действия остается до конца не изученным. Известно, что активированный 8-метоксопсора- лен (8-MOP) образует ковалентные связи с пирими- диновыми основаниями дезоксирибонуклеиновой кислоты, ингибируя пролиферацию мононуклеаров и вызывает апоптоз лимфоидных клеток, особенно естественных киллеров и Т-клеток [9]. В настоящее время нет общего соглашения по протоколу, принятому для биологического контроля ЭКФ. В качестве маркеров биологического контроля ЭКФ нами оценивалась кинетика апоптоза посред- ством определения раннего и позднего апоптоза в облученных лимфоцитах, мембранный потенциал митохондрий, а также проницаемость клеточной мем- браны при помощи проточной цитометрии. Цель исследования. Исследовать кинетику апоп- тоза in vitro в ходе проведения экстракорпорального фотофереза. Материалы и методы. Апоптоз исследовали в мононуклеарных клетках после введения фотосенси- билизатора и облучения ультрафиолетовым светом. Выделение мононуклеарных клеток осуществляли с помощью клеточного сепаратора «Spectra Optia» фирмы «Terumo BTL» (США) по протоколу выделения мононуклеарных клеток с контролем общего клинического анализа крови перед проведением процедуры ЭКФ на границе раздела клеточных масс. Через сепа- ратор центрифугировали 2-3 объема циркулирующей крови. В качестве антикоагулянта использовался 4% раствор цитрата натрия в количестве 500-1000 мл. Для профилактики цитратной интоксикации при- меняли 10% раствор глюконата кальция количестве 10-20 мл. За одну процедуру выделяли от 100 до 150 мл концентрата мононуклеарных клеток, к которым добавляли физиологический раствор, доводя общий объем до 300 мл. В качестве фотосенсибилизирующего препарата использовали раствор 8-МОР в дозе 200 нг/кг. После 15-минутной инкубации в темном помеще- нии клеточную суспензию подвергали ультрафиоле- товому воздействию на аппарате для фотофереза «Macogenic G2» фирмы «Macopharma» (Франция) при испускаемой длине волн 315-400 нанометров (нм) с максимумом на 350 нм и интенсивностью облучения 10 мВ/cм2. Общее время облучения от 10 до 15 минут. Общая доза экспозиции составляла 2,0 Дж/см2. По- сле облучения из клеточной суспензии забирали 5 мл мононуклеаров для изучения апоптоза, а остальные клетки реинфузировали пациенту в течение 30 мин в соответствии с протоколом проведения фотофереза. При изучении апоптоза полученную суспензию клеток дважды отмывали полной культуральной сре- дой (ПКС), приготовленной на основе «RPMI-1640» фирмы «Биолот» (Санкт-Петербург) с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина в течение 7 мин при 300 g. Концентрацию клеток определяли при помощи гемоцитометра. Для постановки экспериментов в лунки 24-луночных план- шетов фирмы «Sarstedt» (Германия) вносили по 1000 мкл клеточной суспензии (2,5×106 клеток в мл) в ПКС и инкубировали 24, 48 и 72 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. По завершении инкубации клетки ресуспендировали в охлажденном забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР), со- держащем 2% ЭТС, переносили в пробирки для про- ведения проточной цитометрии на аппарате фирмы «Beckman Coulter Inc.» (США) и дважды отмывали избытком ЗФР (300 g в течение 8 мин). Полученную суспензию клеток использовали для постановки экс- периментов. Для оценки мембранного потенциала митохон- дрий к 100 мкл клеточной суспензии (1×106 клеток/ мл) добавляли 20-кратный рабочий раствор DiOC6(3) фирмы «Invitrogen» (США), получая конечную концентрацию красителя равную 20 нМ. После внесения красителя образцы тщательно перемешивали и ин- кубировали в течение 20 мин при 37°С в атмосфере 5% СО2 в защищенном от света месте. По заверше- нии инкубации образцы отмывали избытком ЗФР, содержащим 2% ЭТС (7 мин при 330 g). После чего надосадок удаляли, а клеточный осадок переводили в 100 мкл свежего ЗФР. В полученную клеточную суспензию вносили 10 мкл раствора йодистого про- 124 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования пидия (PI) фирмы «Sigma-Aldrich» (США), получая финальную концентрацию PI, равную 1 мкг/мл. По- сле этого образцы инкубировали еще в течение 10 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. По завершении инкубации в образцы вносили по 200 мкл ЗФР и проводили цитометриче- Обработку результатов проточной цитометрии (рис. 1) проводили с использованием программ Navios Software v.1.2 и Kaluza™ v.1.5а фирмы «Beckman Coulter Inc.» (США). Живые клетки обладали яркой флуоресценцией по каналу, предназначенному для детекции DiOC6(3), но не накапливали PI (фенотип кий учет. Для каждого из образцов анализировали DiOC6(3) PI ). Клетки, находившиеся на ранних стаbright - не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от слипшихся и в последующем дискриминировать агрегаты из анализа, использодиях апоптоза (митохондриальный потенциал снижен, но плазматическая мембрана еще сохраняет свою целостность - не проницаема для PI) определялись вали следующие сочетания сигналов по прямому как DiOC6(3) PI ). Тогда как лимфоциты, находивdim-to-neg - (величина, пропорциональная размеру клеток) и боковому (величина, характеризующая структуру шиеся на поздних стадиях апоптоза или уже погибшие (некроз), не эффективно накапливали DiOC6(3), но ярко клеток) светорассеянию. окрашивались PI - фенотип DiOC6(3) PI (рис. 1). dim-to-neg + Рис. 1. Определение уровня апоптоза в лимфоцитах в ходе проведения ЭФК при помощи проточной цитометрии. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции липофильного катионного красителя DiOC (3); по оси ординат - интенсивность флуоресценции ДНК-связывающего красителя PI. «Alive» - живые клетки с фенотипом DiOC (3)brightPI-, «early Ap» - клетки на ранних стадиях апоптоза (DiOC (3)dim-to-negPI-), «late Ap/N» - поздний апоптоз/некроз (фенотип DiOC (3)dim-to-negPI+). Относительное содержание клеток приведено в виде % от общего числа проанализированных клеток в образце. Гистограммы а, г, ж, к - свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови на сроках 0, 24, 48 и 72 ч инкубации in vitro; гистограммы б, д, з, л - мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК, на сроках 0, 24, 48 и 72 ч инкубации in vitro; гистограммы в, е, и, м - мононуклеарные клетки периферической крови, в ходе проведения ЭФК, на сроках 0, 24, 48 и 72 ч инкубации in vitro ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 125 Экспериментальные исследования Статистический анализ полученных данных осу- ществляли при помощи пакетов программ Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 4.00 for Windows (GraphPad Prism Software Inc., США). Результат выра- жали в % от общего числа одиночных клеток и приво- дили в виде среднего и ошибки среднего. Для срав- нения парных количественных значений использовали t-критерий Стьюдента. Длительность исследования составила 12 месяцев. Было обработано 100 проб мононуклеарных клеток. Результаты и их обсуждение. Установлено, что проведение ЭКФ не оказывает существенного вли- 85,64±0,8 (р<0,001) и 82,08±1,94% (р<0,001) через 24, 48 и 72 ч после начала эксперимента соответственно. При этом достоверных различий по относительному содержанию лимфоцитов, находящихся на ранних стадиях апоптоза, отмечено не было. Если в точке 0 часов содержание клеток с фенотипом DiOC6(3) to-negPI- составляло 5,19±0,69%, то через 24, 48 и 72 ч эта величина составляла 5,34±0,92% при р=0,899, 6,72±0,61% при р=0,132 и 7,42±0,93% при р=0,062 со- ответственно. Вместе с тем, снижение относительного содержания живых клеток в образцах сопровождалось увеличением уровня погибших клеток - лимфоцитов с фенотипом DiOC (3)dim-to-negPI+, который соответствуяния на жизнеспособность клеток непосредственно ет клеткам, 6 находящимся на терминальных стадиях после проведения облучения (рис. 2). Так, относительное содержание живых клеток в образцах после вы- деления мононуклеарной фракции периферической крови составляло 93,57±0,89%, что достоверно не отличалось как от образцов, подготовленных для ЭКФ, так и образцов после проведения ЭКФ (93,36±1,69 и 91,74±2,41% соответственно). Содержание клеток апоптоза или некроза. Так, по мере культивирования in vitro процентное содержание этих лимфоцитов досто- верно (р<0,001) увеличивалось (во всех случаях при сравнении с точкой 0 часов) с 1,22±0,52 до 3,96±0,3, 7,64±0,62 и 10,49±1,53% соответственно. Сходные тенденции были отмечены при исследо- вании динамики клеточной гибели in vitro в образцах, с фенотипом DiOC6(3) PI , свойственным лимподготовленных для проведения ЭКФ. Так, отмечаdim-to-neg - фоцитам находящимся на ранних стадиях апоптоза, также достоверно не различалось между исследо- ванными образцами и находилось в пределах 5% от общего числа проанализированных лимфоцитов (5,19±0,69, 4,31±0,89 и 5,24±1,05% соответственно). Что же касается клеток, утративших целостность полось постепенное снижение уровня живых клеток с 93,36±1,69 до 90,74±1,08 (р=0,255), 80,63±2,32 (р<0,001) и 72,11±4,8% (р<0,001) через 24, 48 и 72 ч после начала эксперимента соответственно. Вместе с тем, дополнительные манипуляции с образцами клеток при проведении пробоподготовки верхностной мембраны (фенотип DiOC6(3) PI ), для ЭКФ сопровождались индукцией апоптоза, что dim-to-neg + то их относительное содержание не превышало 1-3% и составляло 1,22±0,52, 2,33±1,33 и 3,00±1,99% соотвыражалось в достоверном увеличении уровня кле- ток с фенотипом DiOC (3)dim-to-negPI- с 4,31±0,89% в ветственно, от общего количества числа лимфоцитов, 6 точке 0 ч до 5,71±0,93 (р=0,297), 9,5±1,27 (р=0,001) содержавшихся в образцах после выделения мононуклеарной фракции клеток периферической крови до и после проведения ЭКФ (рис. 2). В ходе дальнейших исследований была проведена оценка уровня апоптоза в полученных образцах моно- нуклераных клеток периферической крови через 24, 48 и 72 ч культивирования в условиях in vitro. В случае свежевыделенных мононуклеаров относительное содержание живых клеток постепенно снижалось с 93,57±0,89% (в точке 0 часов) до 90,70±0,93 (р=0,037), и 11,08±1,33% (р<0,001) в точках 24, 48 и 72 ч после начала эксперимента соответственно. Достоверный прирост погибших клеток отмечался только спустя 48 ч (9,86±1,66% при р=0,001) и 72 (18,91±4,14% при р<0,001) часа после начала эксперимента, тогда как 24-часовая инкубация на данный показатель не влияла (3,54±0,35% против 2,33±1,33% в начале экс- перимента, р=0,471). Проведение ЭКФ оказывало существенно влияние на снижение жизнеспособно- Рис. 2. Относительное содержание живых лимфоцитов (а), лимфоцитов на ранних (б) и поздних (в) стадиях апоптоза перед началом культивирования в условиях in vitro. Белый цвет - свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови; вертикальная штриховка - мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК; горизонтальная штриховка - мононуклеарные клетки периферической крови в ходе проведения ЭФК. Результаты приведены в виде среднего и ошибки среднего; указана достоверность различий согласно t-критерию Стьюдента 126 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования сти мононуклераных клеток периферической крови уже на ранних сроках наблюдения. Так, уже через 24 ч после начала эксперимента уровень лимфоцитов Показано, что достоверные различие между све- жевыделенными мононуклеарами периферической крови и образцами, подготовленными для ЭКФ, нас фенотипом DiOC6(3) bright PI- достоверно (р=0,017) блюдаются лишь на третьи сутки после начала экспеснижался с 91,74±2,41 до 83,35±2,05%. Дальнейшее культивирование в условиях in vitro сопровождалось понижением данного показателя до 60,78±3,64% (р<0,001) и 40,72±4,45% (р<0,001) на вторые и тре- тьи сутки инкубации. Более того, принципиальным отличием образцов, подвергнутых ЭКФ, от образцов сравнения было достоверное увеличения доли клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, уже в пер- вые сутки после начала эксперимента, когда данный показатель достоверно (р=0,023) превысил значения точки 0 ч (9,67±1,68% против 5,24±1,05%). Через 48 и 72 ч также отмечалось увеличение процентного содерримента (рис. 3 а, г, ж). Вместе с тем, проведение ЭКФ приводит к снижению жизнеспособности лимфоцитов уже в первые сутки культивирования в условиях in vitro как при сравнении с интактными свежевыделенными клетками (рис. 3 б, д, з), так и лимфоцитами, под- готовленными для ЭКФ (рис. 3 в, е, и). Увеличение уровня лимфоцитов, находящихся на ранних стадиях апоптоза, отмечается на вторые сутки инкубации in vitro при сравнении свежевыделенных мононуклеа- ров периферической крови с образцами, подготов- ленными для ЭКФ (рис. 4 а, г, ж). С другой стороны, проведение ЭКФ сопровождалось приростами клеток жания лимфоцитов данной популяции (17±1,59% при с фенотипом DiOC6(3) PI при сравнении этих р<0,001 и 18,43±2,11% при р<0,001 соответственно). образцов с другими. dim-to-neg - Процентное содержание погибших клеток - фенотип Показано, что подготовка клеток для проведения DiOC6(3) PI - между точками 0 и 24 ч достоверно ЭКФ не оказывает существенного влияния на жизdim-to-neg - не различалось (3±1,99 и 6,99±1,08% соответственно). Дальнейшее культивирование in vitro сопровожданеспособность лимфоцитов, на что указывает отсут- ствие достоверных различий по клеткам с фенотипом лось резкими приростами доли погибших клеток до DiOC6(3) dim-to-neg PI+ между свежевыделенными монону- 22,22±2,81% (р<0,001) и 40,83±4,01% (р<0,001) через 48 и 72 ч соответственно. Для оценки влияния ЭКФ на жизнеспособность лимфоцитов in vitro было проведено парное сравнение образцов, полученных от каждого пациента, с исполь- зование критерия Вилкоксона для парных значений, результаты которого для популяции живых клеток приведены на рисунке 3. клеарами и лимфоцитами после проведения всех стадий подготовки для ЭКФ (рис. 5 а, г, ж). Вместе с тем, прирост погибших клеток в образцах отмечается уже через 24 ч после ЭКФ, а при дальнейшей инкубация - 48 и 72 ч - обнаруженные тенденции сохраняются. В целом проведение ЭКФ не приводит к быстрой гибели клеток, о чем свидетельствуют результаты, приведенные на рисунке 2. Сходные результаты Рис. 3. Относительное содержание живых лимфоцитов в ходе проведения ЭКФ на различных сроках культивирования в условиях in vitro. Слева направо - результаты попарного сравнения образцов после сепарации лимфоцитов и подготовки к ЭКФ; образцов после сепарации лимфоцитов и проведения ЭКФ, а также образцов после подготовки к ЭКФ и проведения ЭКФ. Сверху вниз - результаты, полученные после 24, 48 и 72 ч инкубации в условиях in vitro. Для каждой из пар образцов указаны различия согласно критерию Вилкоксона для парных значений ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 127 Экспериментальные исследования Рис. 4. Относительное содержание лимфоцитов, находящихся на ранних стадиях апоптоза, в ходе проведения ЭФК на различных сроках культивирования в условиях in vitro. Гистограммы а, г и ж - результаты попарного сравнения образцов, содержащих свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (слева), или мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч; гистограммы б, д и з - результаты попарного сравнения образцов, содержащих свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (слева), или мононуклеарные клетки периферической крови в ходе проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч; гистограммы в, е, и - результаты попарного сравнения образцов, мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК (слева), или мононуклеарные клетки периферической крови в ходе проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч. Для каждой из пар образцов указаны различия согласно критерию Вилкоксона для парных значений были получены F. Taverna et al. [23], показавшими, что через 4 ч после ЭКФ достоверных различий по отно- сительному содержанию живых лимфоцитов, а также клеток, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза, по сравнению с точной 0 ч, отмеченое не было. Вместе с тем, в рамках только что упомянутого исследования уровень живых лимфоцитов в начале эксперимента в среднем составлял около 80%, тогда как применяемый в ходе собственного исследования протокол выделения мононуклеарной фракции кле- ток периферической крови и дальнейшие манипу- ляции с ними в условиях in vitro позволили повысить процент живых клеток в образцах до 90% и более. Увеличение уровня клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, отмечено нами уже на первые сутки после начала эксперимента (см. рис. 3), что подтверждается данными других исследователей, указывающих на наличие достоверных различий по жизнеспособности клеток с начальной точкой в интервале 20-24 ч инкубации in vitro [22]. Запуск процессов программированной клеточной гибели в случае собственных экспериментов был связан не с подготовкой образцов для ЭКФ (о чем свидетельствует обнаруженное нами отсутствие значимых различий между свежевыделенными лимфоцитами и образцами, подготовленными для проведения ЭКФ, см. рис. 3, 4 и 5), а с самой процедурой ЭКФ. К сожалению, в большинстве опубликованных работ по данной тематике такие контрольные образцы от- сутствуют, что не позволяет оценить качество про- боподготовки при проведении ЭКФ. Заключение. Проточная цитометрия позволяет обоснованно раскрыть основной механизм действия экстракорпорального фотофереза на клеточном уровне, а именно индукцию апоптоза в лимфоцитах периферической крови. Полученные данные принци- пиально отличаются от образцов, подвергнутых экс- тракорпоральному фотоферезу, а также от образцов сравнения. Достоверное увеличение доли клеток, на- ходящихся на ранних стадиях апоптоза, возникает уже в первые сутки после начала эксперимента. Через 48 и 72 ч также отмечается увеличение относительного со- держания погибающих лимфоцитов с максимальными показателями раннего и позднего апоптоза. 128 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Рис. 5. Относительное содержание лимфоцитов, находящихся на поздних стадиях апоптоза, в ходе проведения ЭФК на различных сроках культивирования в условиях in vitro. Гистограммы а, г и ж - результаты по парного сравнения образцов, содержащих свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (слева) или мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч; гистограммы б, д и з - результаты по парного сравнения образцов, содержащих свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (слева) или мононуклеарные клетки периферической крови в ходе проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч; гистограммы в, е, и и - результаты по парного сравнения образцов, мононуклеарные клетки периферической крови, подготовленные для проведения ЭФК (слева) или мононуклеарные клетки периферической крови в ходе проведения ЭФК (справа) на сроках 24, 48 и 72 ч. Для каждой из пар образцов указаны различия согласно критерию Вилкоксона для парных значений

About the authors

A S Manuilov

Email: vmeda-nio@mil.ru

I V Kudryavtsev

M K Serebriakova

A S Trulev

S N Bardakov

Email: vmeda-nio@mil.ru

A V Apchel

Email: vmeda-nio@mil.ru

A N Belskih

Email: vmeda-nio@mil.ru

M V Zakharov

Email: vmeda-nio@mil.ru

V V Tishko

Email: vmeda-nio@mil.ru

A A Sokolov

Email: vmeda-nio@mil.ru

I A Vasylieva

References

Supplementary files