Quality control of batches of bacteriological examination kits «Selective differential-diagnostic medium for recovery of Bacillus anthracis and closely related bacilli of Bacillus cereus group»

Full Text

Введение. Сибирская язва как особо опасная инфекция животных и людей продолжает ежегодно регистрироваться на территории Российской Фе- дерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья [7]. Возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis) относится к группе Bacillus cereus рода Bacillus, включающей, наряду с B. anthracis, наиболее близко- родственные B. Cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B.weichen-stephanensis и B. manliponensis [9], от которых, в первую очередь, не- обходимо дифференцировать B. anthracis. В Российской Федерации для выделения возбу- дителя сибирской язвы методическими указаниями МУК 4.2.2413-08 [2] регламентировано использование селективной дифференциально-диагностической среды, содержащей в качестве селективных агентов триметоприм и полимиксин М, а также дифференци- ально-диагностический компонент - 0,01% натрия фенолфталеинфосфат, являющийся субстратом для действия фермента щелочной фосфатазы. Продукция данного фермента определяется по освобождению фенолфталеина, что сопровождается изменением цвета выросших колоний микроорганизмов (окраши- вание в розовый цвет). Максимальная ферментативная активность щелочной фосфатазы проявляется при щелочных значениях рН, что достигается обработкой посевов парами водного аммиака. Данная среда была разработана в Ставропольском противочумном институте Роспотребнадзора [1] и выпускалась на протяжении ряда лет в Научно-производственном объединении «Аллерген» (г. Ставрополь), после чего ее коммерческое производство было прекращено. В настоящее время в Российской Федерации налажено производство среды «Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая», в состав которой входит селективная добавка для по- давления роста посторонней микрофлоры (Государ- ственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, г. Оболенск). Однако данная среда не включает в себя дифферен- циально-диагностический компонент, что не позво- ляет проводить одновременную дифференциацию морфологически схожих колоний представителей группы Bacillus cereus. Всемирной организацией здравоохранения для выделения возбудителя сибирской язвы рекомен- дована среда PLET [8]. Данная среда не лишена недостатков: достаточно высокая токсичность, об- 144 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования условленная наличием в ее составе ацетата таллия, отсутствие роста некоторых штаммов B. anthracis, нетипичная морфология выросших колоний сибиреяз- венного микроба [10, 11]. Учет результатов проводят через 36-40 ч инкубации посевов при температуре (37±1) °С. С целью совершенствования селективной дифференциально-диагностической среды, регла - ментированной к использованию методическими указаниями МУК 4.2.2413-08 [2], в Ставропольском противочумном институте Роспотребнадзора был сконструирован набор реагентов для бактериоло- гических исследований «Селективная дифференци- ально-диагностическая среда (далее - селективная среда) для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus». Данная плотная питательная среда содержит в качестве основы питательный агар для культиви- рования микроорганизмов, готовый к применению (агар Хоттингера). В качестве селективных добавок использованы цефтазидим и амфотерицин В. Поли- еновый антибиотик амфотерицин В характеризуется высокой антимикотической активностью и подавляет рост грибов. Цефтазидим обладает активностью в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, подавляет рост со- путствующей микрофлоры и не оказывает влияния на рост бацилл группы Bacillus cereus. Дифференциально-диагностическим компонен- том в селективной среде является динатриевая соль пара-нитрофенил фосфата (p-NPP). Предлагаемая методика основана на гидролизе щелочной фосфа- тазой р-NPP с последующим образованием пара- нитрофенола (р-NP), обладающего ярко-желтым цветом. Использование данной селективной среды не требует дополнительной обработки выросших на ней колоний микроорганизмов парами аммиака для выявления ферментативной активности щелочной фосфатазы, что исключает раздражающее действие паров аммиака на слизистые оболочки глаз и носо- глотки персонала, выполняющего исследования; упрощает и ускоряет учет результатов (через 18-24 ч при температуре (37±1°С), подтверждая этим пре- имущество предлагаемого набора реагентов. Возбудитель сибирской язвы не образует щелоч- ную фосфатазу, поэтому не происходит гидролиз р-NPP до p-NP, и цвет селективной среды вокруг его колоний не изменяется. В то же время спорообразу- ющие сапрофиты группы Bacillus cereus, как правило, обладают фосфатазной активностью, в результате чего образуется р-NP, придающий толще селектив- ной среды вокруг колоний желтое окрашивание. С целью дальнейшей идентификации колоний, подо- зрительных на возбудитель сибирской язвы, отбирают колонии с характерной для B. anthracis морфологией, цвет агара вокруг которых не изменился. Данный набор реагентов предназначен для бакте- риологических исследований для выделения возбуди- теля сибирской язвы из биологического материала, объектов окружающей среды, для дифференциации B. anthracis от культур других представителей груп- пы B. cereus, а также для исследования материала, содержащего или подозрительного на содержание близкородственных бацилл группы B. cereus в кли- нической и санитарной микробиологии. Цель исследования. Проведение контроля ка- чества экспериментальных серий набора реагентов для бактериологических исследований «Селективная дифференциально-диагностическая среда для вы- деления возбудителя сибирской язвы и близкород- ственных бацилл группы Bacillus cereus» на их соот- ветствие требованиям разработанной нормативной документации. Материалы и методы. Проведены испытания трех серий данного набора (серии 1-16, 2-16, 3-16). В состав набора входят четыре компонента: - питательный агар для культивирования микро- организмов, готовый к применению (агар Хоттинге- ра), выпускаемый Ставропольским противочумным институтом Роспотребнадзора; - цефтазидим, выпускаемый Акционерным Курган- ским обществом медицинских препаратов и изделий «Синтез»м, (г. Курган); - амфотерицин В, выпускаемый Акционерным Курганским обществом медицинских препаратов и изделий «Синтез»м, (г. Курган); - динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (р-NРР) производства «Himedia» (Индия). Селективную среду готовили согласно ее инструк- ции по применению. Препаратом сравнения служил агар Хоттингера. Испытания выполнялись с учетом соблюдения требований противоэпидемического режима работы с микроорганизмами II-IV групп патогенности [6-4], методических указаний по лабораторной диагности- ке сибирской язвы [2], методических указаний по контролю питательных сред по биологическим по- казателям [3]. Для контроля качества ростовых, дифференциаль- но-диагностических и селективных свойств питатель- ной среды использовали микроорганизмы II-IV групп патогенности: пять вирулентных штаммов (В. аnthracis 81/1, B. anthracis 1(CO), B. anthracis 1193, B. anthracis И-363, B. anthracis 1283) и пять вакцинных штаммов (В. anthracis СТИ-1, B. anthracis Ихтиман, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis 55, B. anthracis 71/12 - II вак- цина Ценковского). Для контроля ингибиторов посто- ронней микрофлоры использовали три штамма гете- рологичных микроорганизмов (Staphylococcus aureus ATTCC 25923, Escherichia coli ATTCC 25922, Proteus vulgaris HX-19). Дифференцирующие свойства селек- тивной среды определяли с использованием десяти штаммов близкородственных сапрофитов рода Bacillus (B. cereus 8, B. cereus 96, B. cereus 104, B. cereus 183, B. thuringiensis Ser. 1, B. thuringiensis Ser. 5, B. thuringiensis Ser. 8, B. subtilis PY-313, B. megaterium 1, B. mesentericus B1-1024). Штаммы получали из лаборатории «Коллек- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 145 Экспериментальные исследования Рис. Рост гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов на испытуемой питательной среде ция патогенных микроорганизмов» Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора. При исследовании ростовых и дифференциально- диагностических характеристик питательной среды бактериологические посевы инкубировали в течение 18-24 ч при температуре (37±1)°С. Критериями ростовых и дифференциально-диагностических пара- метров испытуемых образцов служили количество, размер, морфология выросших колоний, цвет толщи агара вокруг колоний. Ингибирующие свойства испытуемых серий селективной среды определяли по их пригодности подавлять рост штаммов гетерологичных микроор- ганизмов. Для статистической обработки исследований ис- пользовали пакет прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 7,0 for Windows. Результаты и их обсуждение. Анализ данных, полученных при межлабораторных комиссионных испытаниях, показал, что все апробированные серии плотной селективной среды были прозрачными и стерильными. Серия 1-16 имела светло-желтый цвет, серии 2-16 и 3-16 - желтый цвет; рН, соответственно, составил 7,2, 7,2 и 7,3. Изучение ростовых свойств апробированных серий селективной среды выявило, что колонии как вакцинных, так и вирулентных штаммов сибиреязвенного микроба во всех трех сериях селективной среды и на агаре Хоттингера были серовато-белого цвета. Цвет питательных сред вокруг колоний сибиреязвенного микроба, выросших на трех сериях селективной среды и на агаре Хоттингера, не изменился. Во всех случаях наблюдали морфологию колоний, типичную для штам- мов сибиреязвенного микроба: круглые, матовые, шероховатые. Края колоний были с волнистыми от- ростками, напоминающими локоны волос (R-форма). Диаметр колоний выросших микроорганизмов состав- лял от 1 до 5 мм в сериях разработанной селективной среды и от 1 до 12 мм - на агаре Хоттингера. У колоний штаммов близкородственных бацилл диаметр варьировал от 3 до 12 мм. Они имели схожую типичную морфологию: серовато-белый цвет, кру- глые, матовые, шероховатые, извитые нити по краям (R-форма). При этом цвет селективной среды вокруг колоний близкородственных бацилл приобретал яр- ко-желтую окраску, за исключением штамма B. cereus 96. Селективная среда вокруг его колоний во всех трех сериях была желтого цвета. В то же время цвет агара Хоттингера вокруг колоний близкородственных микроорганизмов оставался серовато-белым. На всех сериях селективной среды и на агаре Хот- тингера отмечен типичный рост колоний как штаммов сибиреязвенного микроба, так и колоний близкород- 146 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования ственных бацилл в R-форме, что свидетельствует о сохранении стабильности основных биологических свойств гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов на испытуемой питательной среде (рисунок). Контроль ингибирующих свойств селективной сре- ды показал отсутствие роста взвесей монокультур S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. vulgaris HX-19 во всех испытуемых сериях питательной среды. На агаре Хоттингера во всех случаях отмечен сплошной рост гетерологичных культур. В то же время во всех сериях селективной среды наблюдался типичный рост штамма B. anthracis CТИ-1 и неизмененный цвет питательной среды вокруг его колоний. Колонии штамма B. cereus 8 имели типичную мофологию и ярко-желтое окрашивание питатель- ного агара вокруг них. На агаре Хоттингера на фоне сплошного роста гетерологичных микроорганизмов регистрировались единичные колонии штаммов рода Bacillus. При посеве на испытуемую среду микробной смеси, включающей споровые взвеси B. anthracis СТИ-1 и B. cereus 8 концентрацией 100 спор/мл, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. vulgaris HX-19 концентрацией 100 м.к./мл было отмечено, что колонии бациллярных штаммов имели типичную морфологию. Цвет агара вокруг колоний B. anthracis СТИ-1 не изменился. Толща агара вокруг колоний B. cereus 8 приобрела ярко-желтое окрашивание. Рост штаммов S. aureus 209-P, E. coli 11, P. vulgaris HX-19 на агаровых пластинах испытуемой среды отсутствовал. На агаре Хоттингера отмечен типичный рост колоний всех тестируемых штаммов. Заключение. Результаты проведенного контроля качества набора реагентов «Селективная диффе- ренциально-диагностическая среда для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных ба- цилл группы Bacillus cereus» свидетельствуют о том, что все испытуемые серии селективной среды обеспечивают селективный рост колоний бациллярных штаммов с типичной морфологией, ингибируя одно- временно рост посторонней микрофлоры (S. aureus, E. coli, P. vulgaris), а также позволяют дифференциро- вать колонии штаммов возбудителя сибирской язвы от близкородственных сапрофитов рода Bacillus. Полученные данные являются основанием для про- ведения дальнейших испытаний селективной среды с целью ее последующего внедрения в практическое здравоохранение.

About the authors

A G Ryazanova

Email: stavnipchi@mail.ru

L Yu Aksenova

A A Zuenco

T M Gridina

N P Buravtseva

E I Eremenko

References

Supplementary files