Experimental evaluation of the effectiveness of local treatment of skin burns with сarbopol easier to disperse 2020 hydrogel with human leukemia differentiation factor-6 peptide

  • Authors: Zinoviev EV1, Tsygan VN1, Artsimovich IV1, Asadulayev MS1, Paneyakh MB1, Zubov VV1, Lukyanov SA1, Kostyakov DV1, Zhilin AA1, Lopatin IM1, Umanskaya AA1, Osmanov KF1, Kravtsov SN1, Apchel AV1, Zolotarev Y.A1, Dadayan AK1, Dadayan KA1
  • Affiliations:
  • Issue: Vol 37, No 3 (2018)
  • Pages: 148-152
  • Section: Articles
  • URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/12319
  • Cite item

Abstract


The results of experimental evaluation of the effectiveness of topical application of the peptide human leukemia differentiation factor-6 in carbopol hydrogel easier to disperse 2020 in thermal burns of skin of III degree are presented. It was found that local application of human leukemia differentiation factor-6 peptide in hydrogel carbopol in concentration from 0,01% to 0,00001% causes acceleration of wound epithelialization processes by 28 days by 71,11% (p<0,01) and reduces the incidence of purulent complications by 62,5% (p<0,05). Histological examination of biopsy specimens of wounds revealed essential features of morphometry, considering the chosen method of treatment and concentration of peptide of human leukemic factor-6 differentiation in carbopol hydrogel. The proposed method of local treatment of burn skin lesions is very promising for optimizing the flow of reparative regeneration processes. The low frequency of purulent complications in the group of animals treated with a minimum peptide content may be due to the combined action of carbopol hydrogel as determinants of wound healing in a wet environment, and the optimal concentration of the peptide human leukemia differentiation factor-6, providing anti-inflammatory effect in a minimum concentration. Analysis of the histological pattern in the studied groups of animals allows us to conclude about the acceleration of the formation of the extracellular matrix, and epithelialization of the wound surface on the background of an application of the peptide human leukemia differentiation factor-6 minimum concentration. On the 14th day of observation the number of microvessels in granulation tissue among animals treated with human leukemia differentiation factor-6 in carbopol hydrogel easier to disperse 2020 with minimum concentration (0,00001%) was 40,6-43,75% more than in the comparison groups. The use of biologically active peptides is one of the promising methods of wound process optimization. human leukemia differentiation factor-6 peptide can selectively stimulate proliferation by enhancing redox processes in cells.

Введение. По данным Росстата, в 2017 г. в Российской Федерации зарегистрировано 278,2 ты- сяч пациентов с диагнозом термический и химический ожог, при этом среди них 68,7 тысяч - дети [9]. Ожоги являются одной из основных причин инвалидности взрослого и детского населения развитых стран. Экономические затраты на лечение таких пострадав- ших представляют значительную проблему. Сводные данные свидетельствуют о снижении частоты тер- мических и химических поражений среди населения России за последнее десятилетие, однако проблема лечения таких пострадавших остается актуальной и дискутабельной [10]. Современная тактика лечения ожоговых пораже- ний является мультидисциплинарой и проводится с учетом особенностей патогенеза ожоговой болезни и её осложнений [3]. Благодаря прогрессу медицин- ской науки внедрены патогенетически обоснованные методики антибактериальной терапии, иммунокор- рекции и местного лечения ран [2]. Перспективным представляется разработка новых методик лечения поверхностных и глубоких ожоговых поражений биотехнологическими, в том числе клеточными про- дуктами, биополимерными раневыми покрытиями с живыми клетками - скаффолдами [1, 5]. Один из перспективных путей повышения эффек- тивности лечения ожоговых поражений предусма- тривает использование ростовых стимуляторов и факторов регенерации, в частности эпидермального, фибробластического, тромбоцитарных факторов ро- 148 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования ста: собственно тромбоцитарный фактор роста A+B, инсулиноподобные факторы роста I, II. Среди них привлекает внимание пептид человеческий лейкозный фактор дифференцировки (ЧЛФД), выделенный из культуральной среды клеток человеческого промие- лоцитарного лейкоза HL-60 в 1994 г. Установлено, что субстанция ЧЛФД вызывает дифференцировку клеток по гранулоцитарному пути [6]. В структуре обнаружен шестичленный фрагмент ЧЛФД-6, который обеспечивает способность полноразмерного факто- ра индуцировать дифференцировку и ингибировать пролиферацию клеток, в том числе HL-60 [10]. Кроме этого, пептид обладает способностью взаимодей- ствовать с липидами клеточных мембран, что сказы- вается на активности цитокинов, задействованных в пролиферации и дифференцировке клеток [6]. Е.Д. Даниленко и др. [4] показали, что ЧЛФД-6 усиливает окислительно-восстановительные процессы в клетках и повышает метаболическую активность макрофагов. В сыворотке крови определяются ЧЛФД-6 и антитела к этому пептиду, что позволяет предположить о гумо- ральной регуляции его синтеза. Так как пептид ЧЛФД- 6 не имеет специфических рецепторов на клеточной мембране, то его воздействие может распространять- ся на различные популяции клеток организма [10]. Основой для создания перспективных раноза- живляющих средств и рецептур на основе пептида ЧЛФД-6 может послужить гидрогель редкосшитых акриловых полимеров (карбополов), в частности легкодиспергируемый карбопол 2020. На их основе образуются стабильные гидрогели, они термически и химически устойчивы. Получены экспериментальные данные об эффективности применения гидрогелей для лечения обширных ран и ожогов [7]. Цель исследования. Оценить эффективность и влияние белка ЧЛФД-6 в гидрогеле легкодиспергиру- емого карбопола 2020 на репаративную регенерацию при ожогах кожи. Материалы и методы. В эксперименте уча- ствовало 48 самцов крыс линии Wistar-Kyoto массой 230-250 г. Все манипуляции выполнялись под общим ингаляционным наркозом в асептических условиях. Ожог воспроизводили по собственной оригинальной методике (рационализаторское предложение Во- енно-медицинской академии имени С.М. Кирова № 14287/1 от 19.01.2016). После подготовки операци- онного поля животное фиксировали к лабораторному столу. Площадь ожога составляла 16 см2 (около 10% от площади тела). На депилированную кожу спины животного помещали датчик электротермопары муль- тиметра «Electroline» (Китай), которым определяли температуру кожи и металлической нагревательной пластины. Время экспозиции - 10 с при температуре на поверхности кожи 95-97оС. Для возможности нанесения на раневую поверх- ность пептид ЧЛФД-6 в различных разведениях был растворен в гидрогеле редкосшитых акриловых полимеров, который представляет собой электрофизически обработанную частично модулированным сигналом электрического поля воду (99,55%) и поли- мер 0,45% акриловой кислоты легкодиспергируемого карбопола (рис. 1). Всем животным спустя 60 мин после ожога выпол- нялась некрэктомия до собственной фасции, края раны фиксировались к подлежащим тканям узловыми шва- ми. Гидрогель, содержащий пептид ЧЛФД-6, ежеднев- но наносили на поверхность раны в течение 7 суток. Животные были разделены на 6 групп - по 8 живот- ных в каждой с учетом концентрации пептида ЧЛФД-6 в геле. В 1-й группе концентрация пептида составила 0,01%, во 2-й группе - 0,001%, в 3-й группе - 0,0001%, в 4-й группе - 0,00001%, в 5-й группе гидрогель на- носился без пептида ЧЛФД-6, в 6-й группе выполня- лась только ранняя хирургическая некрэктомия без последующего лечения. Оценку эффективности лечения выполняли еже- дневно, осуществляли осмотр ран, отмечали характер отделяемого, а также оценку осложнений и летальные исходы. Планиметрически по методике Л.Н. Поповой [12] определяли площадь ожога и вычисляли индекс заживления по следующей формуле: Индекс заживления = , где S - площадь ожога при предыдущем измерении, мм2; Sn - площадь ожога при данном измерении, мм2, Т - интервал между измерениями, сут. Отбор биоптатов для гистологического исследо- вания осуществляли на 14-е и 28-е сутки, их фикси- ровали в 10% растворе формалина с последующей проводкой через спирты восходящей концентрации (30-96%) и заливкой в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, ис- следовали методами световой микроскопии. В ходе исследований соблюдались положения «Ру- ководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [12]. Полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики. Критерием достоверности считали величину p<0,05 при сравнении с группой кон- троля, в которой применялся гидрогель без пептида ЧЛФД-6, и величину p<0,2 при сравнении с группой контроля, в которой выполнялась некрэктомия без дополнительного лечения. Результаты и их обсуждение. Установлено, что выполнение ранней хирургической некрэктомии в зоне глубокого ожога кожи с последующим нанесе- нием гидрогеля с пептидом ЧЛФД-6 сопровождалось достоверным сокращением площади раны, при этом величина показателей определялась концентрацией пептида в гидрогеле. В частности, на 28-е сутки при концентрации пептида 0,01% площадь раны умень- шилась на 94,32% (до 0,91 см2), при концентрации 0,001% - на 74,44% (до 4,09 см2), при концентрации 0,0001% - на 91,32% (до 1,39 см2), при концентрации 0,00001% - на 94,38% (до 0,90 см2); в группе, в кото- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 149 Экспериментальные исследования рой наносился гидрогель без ЧЛФД-6, - на 93,04% (до 1,13 см2); в группе, в которой выполнялась только некрэктомия, - на 90,38% (до 1,54 см2), таблица 1. Частота нагноения ран в анализируемых группах составила: 1 животное в 1-й группе, 2 животных в 3-й и 5-й группах, 3 животных во 2-й группе, 5 животных в 6-й группе, в 4-й группе нагноения ран не наблюда- лось (рис. 2). При гистологическом исследовании биоптатов ран установлено, что на 14-е сутки морфологическая картина в зоне ожога имела ряд особенностей с учё- том выбора способа лечения. Послеоперационная рана в различных группах животных была различной площади, покрыта массами фибрина, густо инфиль- трированного нейтрофильными лейкоцитами (рис. 3). Дно раневого дефекта представлено грануля- ционной тканью, распространяющейся вплоть до мышечной фасции. Макрофаги и нейтрофилы рас- полагаются диффузно, наиболее густо инфильтри- рованы поверхностные слои. В прилежащих к фасции отделах отмечаются небольшие очаги инфильтрации лимфоцитами. В 4-й группе смешаноклеточная ин- фильтрация незначительно распространялась на окружающие ткани, в то время как в 1-й, 2-й и 3-й группах констатированы достаточно крупные очаги субэпидермальной лейкоцитарной инфильтрации. В 5-й группе нейтрофильные лейкоциты располагаются не только в дерме, но и в самом эпидермисе, форми- руя немногочисленные микроабсцессы. Кроме того, в грануляционной ткани определяются многочисленные пролиферирующие полнокровные сосуды капилляр- ного типа. Количество микрососудов в грануляцион- ной ткани в группах существенно различалось (рис. 4). На 28-е сутки дно дефекта было представлено грубоволокнистой соединительной тканью с большим количеством крупных фибробластов (рис. 5). В соединительной ткани сохраняется очаговая инфильтрация лимфоцитами и макрофагами: в 1-й и 4-й группах с незначительным числом нейтрофиль- ных лейкоцитов, в то время как в 2-й и 3-й группах их количество было умеренное. В 5-й группе число нейтрофильных лейкоцитов также умеренное, но в ряде наблюдений выявлены мелкие внутридермаль- ные абсцессы, лимфогистиоцитарная инфильтрация более выражена, очаги несколько крупнее, сливаются друг с другом. Кроме того, в 5-й группе лейкоцитар- ные инфильтраты распространяются на эпидермис по краям дефекта. Сосуды соединительной ткани представлены капиллярами и мелкими венулами. Эндотелиоциты этих сосудов крупные, пролифериру- ющие, с округлыми гиперхромными ядрами и скудной эозинофильной цитоплазмой. В этот же срок в биоптатах, отобранных у живот- ных 6-й группы, перенесших раннюю хирургическую некрэктомию без местного лечения, в отличие от других групп, на дне дефекта располагался слой гра- нуляционной ткани с крупноочаговой инфильтрацией преимущественно нейтрофильными лейкоцитами (рис. 6). Очаги локализовались непосредственно под фибринозным экссудатом, на поверхности дефекта. В отдельных участках отмечается формирование гру- боволокнистой соединительной ткани с многочислен- ными, достаточно крупными фибробластами. Сосуды в ткани на дне дефекта полнокровные, представлены множественными капиллярами и немногочисленными мелкими венулами с пролиферирующим эндотелием. Эпидермис по краям дефекта с выраженным аканто- зом, гиперкератозом и мелкоочаговой лейкоцитарной инфильтрацией. Заключение. Применение гидрогеля, содержа- щего пептид ЧЛФД-6, может являться перспективной методикой оптимизации течения процессов репара- тивной регенерации при ожогах кожи. На фоне его применения в различных концентрациях к 28-м суткам площадь ран сокращается на 94,38%, а частота раз- вития гнойных осложнений раневого процесса при этом снижается на 62,5%. Наилучшие результаты отмечаются при местном использовании гидрогеля с минимальным содер- жанием пептида ЧЛФД-6, разведенного 0,00001%. В данном случае у крыс площадь раневой поверх- ности на 28-е сутки сократилась с 16 см2 до 0,90 см2 (т. е. на 94,38%), при этом гнойных осложнений не отмечено. При местном применении гидрогеля с 0,01% концентрацией пептида ЧЛФД-6 наблюдалась схожая динамика уменьшения площади ран, одна- ко частота гнойных осложнений оказалась выше (12,5%) и отмечен один летальный исход. В группе, в которой наносился гидрогель без пептида ЧЛФД-6, Таблица 1 Результаты планиметрической оценки эффективности ранозаживляющих средств Группа Площадь раны в сроки (сутки), см2 Группа 7 14 21 28 1-я 8,78±1,34*, ** 3,78±1,49*, ** 1,80±0,82*, ** 0,91±1,02 *, ** 2-я 12,20±1,32*, ** 10,29±1,46*, ** 7,88±0,83*, ** 4,09±1,02*, ** 3-я 11,08±1,30*, ** 9,13±1,46*, ** 2,93±0,83*, ** 1,39±1,03 *, ** 4-я 11,68±1,31*, ** 6,24±1,47*, ** 0,94±0,81*, ** 0,90±1,00*, ** 5-я 9,02±1,31 4,63±1,47 1,42±0,84 1,13±1,01 6-я 12,68±1,79 8,49±2,45 3,00±0,14 1,54±0,18 Примечание: * - различия по сравнению с гидрогелем без ЧЛФД-6, p<0,05; ** - по сравнению с группой, в которой выполнялась ранняя хирургическая некрэктомия, p<0,2. 150 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Рис. 1. Структура гидрогеля легкодиспергируемого карбопола 2020. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. ×1000 Рис. 2. Частота развития гнойного воспаления в ранах, с учетом способа лечения Рис. 3. Массивная инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами грануляционной ткани, фибрин на ее поверхности, 1-я группа, 14-е сутки. Окраска гематоксилин-эозином, ув. ×50 Рис. 4. Среднее число микрососудов в грануляционной ткани Рис. 5. Грубоволокнистая соединительная ткань с очаговой инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами, 4-я группа, 28-е сутки. Окраска гематоксилином-эозином, ув. ×100 Рис. 6. Грануляционная ткань на дне дефекта, 6-я группа, 28-е сутки. Окраска гематоксилин-эозином, ув. ×150 площадь раневого дефекта на 28-е сутки наблюде- ния оказалась больше на 25,56% (1,13 см2), чем в группе с содержанием пептида ЧЛФД-6, равным 0,00001%, а частота гнойных осложнений составила 25%. В группе, в которой выполнялась только ранняя хирургическая некрэктомия, на 28-е сутки площадь раны оказалась больше на 71,11% (1,54 см2) по срав- нению с группой, где содержание пептида ЧЛФД-6 равнялось 0,00001%, а частота гнойных осложнений составила 62,5%. Отсутствие гнойных осложнений в группе с минимальным содержанием пептида можно связать с комбинированным действием ги- дрогеля карбопола как детерминанты заживления ран во влажной среде и оптимальной концентрацией пептида ЧЛФД-6, что обеспечивает его противовос- палительное действие.

E V Zinoviev

V N Tsygan

I V Artsimovich

Email: ilyaartsimovich@gmail.com

M S Asadulayev

M B Paneyakh

V V Zubov

S A Lukyanov

D V Kostyakov

A A Zhilin

I M Lopatin

A A Umanskaya

K F Osmanov

S N Kravtsov

A V Apchel

Yu A Zolotarev

A K Dadayan

K A Dadayan

  1. Алексеев, А.А. Комплексное лечение глубоких ожогов на основе применения хирургической некрэктомии и современных биотехнологических методов / А.А. Алексеев [и др.] // Анналы хирургии. - 2012. - № 6. - С. 41-45.
  2. Алексеев, А.А. Современные методы лечения ожогов и ожо- говой болезни / А.А. Алексеев // Мир без ожогов. - 1999. - № 1. - C. 1-7.
  3. Алексеев, А.А. Современные технологии местного консерва- тивного лечения пострадавших от ожогов / А.А. Алексеев, А.Э. Бобровников // Анналы хирургии. - 2002. - № 2. - С. 32-38.
  4. Даниленко, Е.Д. Модуляция пептидом HLDF-6 функциональ- ной активности макрофагов на фоне введения агонистов опиатных рецепторов / Е.Д. Даниленко [и др.] // Мед. иммунология. - 2005. - № 1. - С. 77-84.
  5. Зиновьев, Е.В. Экспериментальная оценка эффективности применения адипогенных мезенхимальных стволовых клеток для лечения ожогов кожи III степени / Е.В. Зиновьев [и др] // Вестн. Росс. воен.-мед. акад. - 2017. - № 1. - С. 137-141.
  6. Костанян, И.А. Биологически активный фрагмент фактора дифференцировки клеток линии HL-60. Идентификация и свойства/ И.А. Костанян [и др.] // Биоорган. хим. - 2000. - Т. 26, № 7. - С. 505-511.
  7. Лагвилава, Т.О. Ранозаживляющие средства на основе кар- бополов / Т.О. Лагвилава [и др.] // Известия СПбГТИ (тех. ун-та). - 2013. - № 18. - С. 47-52.
  8. Оксенойт, Г.К. Здравоохранение в России. 2017 / Г.К. Оксе- нойт [и др.] // Здравоохранение в России. 2017: стат. сб. / Росстат. - М., 2017. - С. 49.
  9. Попова, Л.Н. Как изменятся границы вновь образующегося эпидермиса при заживлении ран: дис. … д-ра мед. наук / Л.Н. Попова. -Воронеж: Воронеж. мед. акад., 1942. - 227 с.
  10. Соснина, А.В. Классы и субклассы антител к фактору диф- ференцировки HLDF и пептидам гапонина, взаимосвязь их уровня с патогистологическими параметрами аденокарци- ном толстой кишки / А.В. Соснина [и др.] // Иммунология. - 2012. - № 2. - С. 92-93.
  11. Сысоева, Г.М. Влияние пептида HLDF-6 на пролиферативную активность спленоцитов в культуре клеток на фоне введения агонистов опиатных рецепторов / Г.М. Сысоева [и др.] // Сиб. мед. журн. - 2009. - № 4. - С. 55-59.
  12. Хабриев, Р.Ю. Руководство по экспериментальному (докли- ническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.Ю. Хабриев. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.

Views

Abstract - 44

PDF (Russian) - 56

Cited-By



Copyright (c) 2018 Zinoviev E.V., Tsygan V.N., Artsimovich I.V., Asadulayev M.S., Paneyakh M.B., Zubov V.V., Lukyanov S.A., Kostyakov D.V., Zhilin A.A., Lopatin I.M., Umanskaya A.A., Osmanov K.F., Kravtsov S.N., Apchel A.V., Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Dadayan K.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies