The modern characteristic of biology and diagnostics prospect M. tuberculosis

Abstract


Features of biology M. tuberculosis are considered the including modern data about features of morphology, the antigen structures of the various nature defining virulence of activators of tuberculosis. Based on the method data spoligothipirovanie genetic distinctions of families Mycobacteriaceae, and among them strains genotype Beijing, different by wide prevalence in the Russian Federation and high medicinal stability are especially characterised. Based on difficult antigens structure M. tuberculosis features of the development of the immune answer which allow predicting a current of the infectious process are reflected. The presented characteristics reflect considerable heterogeneity strains M. tuberculosis which is combined with a variety of an immune homeostasis of the carriers which were ill and by that essentially complicates laboratory diagnostics of tuberculosis. Among the considered modern methods of diagnostics of a tubercular infection, the most perspective can be immunologic. One of the ways of improvement serodiagnostic the tests promoting an increase of sensitivity serodiagnostic of tuberculosis is creation polyepitopes chimeric antigens by chemical synapsis fibres with carbohydrate molecules. Creation of a composition from several immunodominant antigens M. tuberculosis can become other direction of increase of sensitivity. that will allow lowering considerably number false-positive results. Creation of hybrid fibers will allow avoiding an inevitable decrease in affinity of antibodies of the way of the blood, arising at the use of several antigens simultaneously.

Full Text

Одной из приоритетных задач отечественного здравоохранения является улучшение эпидемиоло- гической ситуации по туберкулезу. По данным Все- мирной организации здравоохранения, Российская Федерация (РФ) входит в список 22 стран с высоким бременем туберкулеза, на которые приходится около 80% случаев данного заболевания в мире. К сожале- нию, согласно ее оценке, до 20% новых случаев тубер- кулеза в России остаются не диагностированными в течение года [8, 16]. При этом каждый невыявленный больной с активной формой туберкулеза ежегодно может заразить до 15 человек, а риск возникновения заболевания у тубинфицированных лиц составляет от 15 до 50% уже в течение первых двух лет после контакта с больным [13, 28]. Таким образом, проблема туберкулеза остается по-прежнему актуальной спустя многие годы. Это связано, в первую очередь, с особенностями био- логии возбудителя. Так род Mycobacterium включает около 160 видов. К тому же отдельные признаки микобактерий сопоставимы с грибами. Например, способность к образованию вегетативных форм, характерный медленный рост [5, 23]. M. tuberculosis относится к царству Bacteria, типу Actinobacteria, классу Actinobacteridae, подклассу Actinomycetales, отряду Firmicutes, подотряду Corynebacterineae, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium [2, 24]. M. tuberculosis - это вид микобактерий, которые вызывают хроническое инфекционное заболевание человека и животных - туберкулез, который разно- образен в клинических проявлениях, наиболее часто поражающий систему органов дыхания, но возможны поражения мочеполовой, нервной систем, желудочно- кишечного тракта, суставов, кожи и периферических лимфатических узлов [11]. M. tuberculosis отличаются особым строением клеточной стенки, что является одним из факторов, определяющих их устойчивость. Клеточная стенка содержит большое количество жирных микотиоловых кислот, ковалентно связанных с пептидогликаном и полисахаридом арабиногалак- таном, обеспечивая тем самым мощный липидный барьер. Отличительной особенностью M. tuberculosis является кислото-, спирто- и щелочеустойчивость, что так же обусловлено высоким содержанием липидов и восков в клеточной стенке бактерии [2]. Бактерии устойчивы и ко многим антисептическим и дегидра- тирующим веществам, средствам на основе четвер- тичного аммония, которые на другие микроорганизмы оказывают губительное влияние. Выраженная внешняя капсула отсутствует, но име- ется полисахаридная микрокапсула, отделенная от клеточной стенки осмиефобной зоной, которая обе- спечивает микобактериям высокую устойчивость к не- благоприятным воздействиям внешней среды [25]. Таким образом, среди основных антигенных структур M. tuberculosis содержатся белки, липиды, полисаха- 214 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры риды и фосфатиды. Преобладают среди них липидные фракции. Антигенные особенности M. tuberculosis, а также M. microti и M. bovis имеют значительное сход- ство. Антигенные связи у микобактерий установлены не только среди видов, но и у родов. В штаммах M. tuberculosis выделяется 10 антигенных компонентов. К ним относятся, например, корд-фактор, или тубер- кулиновые протеиды, который играет важнейшую роль в жизненном цикле туберкулёзной палочки. В состав молекулы корд-фактора входит невосстанавливаю- щийся дисахарид трегалоза, которая также является составной частью фосфоглюкана, а также миколовая и миколиновая жирные кислоты. Важнейшее свойство корд-фактора - высокая токсичность. Также в его функции входит и защита бактериальных клеток от окислительного фосфорилирования в макрофагаль- ных митохондриях, то есть корд-фактор необходим для предохранения микобактерии от фагоцитоза. Микобактерии туберкулёза являются внутриклеточ- ными микроорганизмами, и именно с этим связана их значительная способность персистировать. После первичного инфицирования макрофагов хозяина они организуют специфическую стратегию выживания и размножения в них. Микобактерии пользуются спо- собностью макрофагов образовывать специализи- рованные органеллы (фагосомы) и приспосабливают их для поддержания своей жизнедеятельности. При этом они получают ощутимые преимущества, которые используются для того, чтобы избежать действия защитных механизмов хозяина, например специфи- ческих антител и микробицидных эффектов системы комплемента [3, 11, 26, 32]. У микобактерий имеется специальный маннозный рецептор, а также рецепторы для компонентов систе- мы комплемента (CR1, CR3 и CR4), которые предна- значены для связывания с мембраной макрофага и фагоцитирования внутрь клетки. Внутри фагосомы происходит её ремоделинг, причём таким образом, что прерывается весь процесс её созревания, и в итоге нарушается образование фаголизосомы. Данные особенности корд-фактора делают его одним из основных факторов вирулентности тубер- кулёзных палочек. Туберкулиновый протеин (тубер- кулин) характеризуют ярко выраженные аллерген- ные свойства, заключающиеся в развитии реакции гиперчувствительности IV типа в ответ на попадание данного антигена в организм [4, 27]. Популяция M. tuberculosis обладает выраженной генетической неоднородностью, что объясняется разнообразием генетических характеристик штаммов возбудителя. Специфические для штаммов генети- ческие характеристики обусловливают различия в иммунном ответе хозяина на инфекцию, спектр лекар- ственной устойчивости возбудителей, клинические, патогенетические и эпидемиологические особенно- сти заболевания. Такими характеристиками являются: большое число повторяющихся последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), наличие в геноме микобактерий генов метаболизма жирных кислот, способность генов микобактерий синтезировать незаменимые аминокислоты, витамины, кофакторы и кодировать ферменты, участвующие в липолизе и липогенезе [1, 10, 18]. Благодаря сполиготипированию в настоящее время выделяют 36 генетических семейств M . tuberculosis. Сполиготипирование - методика типи- рования микобактерий туберкулеза, основанная на анализе полиморфизма хромосомного локуса DR (англ. direct repeat - прямой повтор), который содер- жит варьирующее число коротких прямых повторов, разделенных уникальными последовательностями (спейсерами). Продукты полимеразной цепной ре- акции (ПЦР), проводимой с помощью праймеров, комплементарных прямым повторам, гибридизуют с набором синтетических олигонуклеотидов, ковалент- но пришитых к нитроцеллюлозной мембране. Картина гибридизации является сполиготипом каждого штам- ма [19, 28]. Среди 36 генетических семейств выделяют девять суперсемейств микобактерий туберкулезного комплекса: M. Beijing (пекинское семейство), M. africanum, M. bovis, EAI (англ., East African-Indian - восточноафрикано-индийское семейство), CAS (англ., Central Asian - центрально-азиатское семейство), T (широко распространенное, но недостаточно изучен- ное семейство), Haarlem (европейское семейство с малым количеством копий IS6110, широко распро- страненное так же в Соединенных Штатах Америки и Великобритании), LAM (англ., Latin American and Mediterranean - латиноамерикано-средиземномор- ское семейство) [30, 34]. Генетическое семейство M. africanum (nAfri = 180 штаммов) является субклассом M. tuberculosis complex и характеризуется отсутствием 8-го, 9-го и 39-го сигналов в профиле гибридизации по данным сполиготипирования [34]. Данное генетическое семейство распространено преимущественно в За- падной Африке, а также в Сенегале, Мали. Генетическое семейство Т является наиболее фи- логенетически древним и наиболее многочисленным, включает более 1,5 тысяч штаммов M. tuberculosis. Оно характеризуется наличием 31-го, а также 9-го и 10-го сигналов гибридизации, по крайней мере, одного сигнала в 21-24 позициях и одновременным отсутствием 33-36-го сигналов в профиле гибриди- зации [29, 34]. Генетическое семейство EAI (nEAI = 907 штаммов) классифицируется по наличию, по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях и одновременно- му отсутствию 29-32-го и 34-го сигналов в профиле гибридизации [34]. Семейство Haarlem (nHaarlem = 1034 штаммов) характеризует наличие, по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях с и одно- временное отсутствие в профиле 31-й гибридизации, а также 33-36-го сигналов [13, 34]. Генетическое семейство LAM включает два подсемейства: LAM-1 (nLAM-1 = 819 штаммов) и LAM-2 (nLAM-2 = 294 штам- ма) и характеризуется одновременным отсутствием 21-24-го и 33-36-го сигналов, а также присутствием, ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 215 Обзоры по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях [10, 34]. Семейство X (nX = 1186 штаммов) имеет в профиле гибридизации одновременное отсутствие 18-го и 33-36-го сигналов или, иногда одновременное отсутствие 18-го и 39-42-го сигналов [10, 34]. На сегодняшний день наибольшее внимание ис- следователей во всем мире привлекает генетическая линия Beijing. Штаммы генотипа Beijing характе- ризуются сполиготипом SIT 1 (от англ. Spoligotype International Type - международный сполиготип), который определяется наличием в DR локусе 9 из 43 спейсеров (с 35-го по 43-й) [1, 10, 34]. Внутри гено- типа исследователи выделяют от 2 до более десятка групп. Чаще дифференциация носит условный харак- тер и зависит от выбранной методики типирования. Согласно данным спонгилотипирования, штамм Beijing обладает уникальным генотипом, в связи с чем в процессе эволюции он приобрел лекарственную устойчивость. Второе название семейства - пекинское, так как впервые оно было обнаружено в гистологических пре- паратах легочной ткани больных предместья Пекина. Отличительная особенность этого генетического семейства - повсеместная широкая распространен- ность, но при этом доминирующее положение оно за- нимает не во всех географических регионах. Наиболь- шая частота встречаемости штаммов M. tuberculosis вариант Beijing зафиксирована в странах Юго- Восточной Азии - 43,1% (Китай, Индонезия, Япония, Вьетнам), наименьшая - в Южной Америке - 0,65% (Бразилия, Аргентина). Для Европы характерен низкий уровень распространенности генотипа Beijing - 7,1%. Россия по данному показателю занимает первое место среди европейских стран [10, 29]. В структуре популяции возбудителей туберкулеза в России доля штаммов Beijing по различным данным составляет от 50 до 80%. На территории Санкт-Петербурга к генетическому семейству Beijing принадлежит 81,2% изученных штаммов [3, 10]. Кроме выраженной лекарственной устойчивости, штамм обладает уникальными свойствами, которые позволили ему распространиться по всему миру. Этими свойствами являются: способность «усколь- зать» от БЦЖ-вакцинирования; относительно быстро приобретать устойчивость к противотубер- кулезным препаратам [3, 11]. Если рассматривать эндемичные штаммы, то наибольший контраст про- является при сопоставлении данных из России, где около 20% представителей генотипа Beijing несут лекарственную устойчивость, и данных из Китая и Японии, где практически все штаммы являются чув- ствительными к проводимой противотуберкулезной терапии. Ветвь современных штаммов генотипа Beijinng несет мутаторный генотип. Объясняется это найденными мутациями в генах системы ре- парации mutT2, mutT4 и ogt. Это может приводить к изменению скорости накопления мутаций, в том числе в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью [11, 35]. Также большой интерес представляют иссле- дования вирулентности Beijing. Данному штамму свойственна гипервирулентность, что подтверждено большим количеством исследований как на уровне макрофагальных моделей, так и на эпидемиологиче- ском уровне [1, 10, 11]. С распространенной лекар- ственной устойчивостью M. tuberculosis связано фор- мирование «скрытого резервуара». После первичного инфицирования в организме пожизненно сохраняется очаг эндогенной инфекции, который способен к ре- активации. Этим же объясняется и невозможность полной ликвидации туберкулеза. Вторыми по распространенности на территории РФ генетическими семействами M. tuberculosis явля- ются штаммы латиноамерикано-средиземноморских семейств - LAM и Haarlem. На территории Северо-За- пада России доля данного генетического семейства составляет 14,5% в случае семейства LAM и 13,3% в случае Haarlem [6]. В Санкт-Петербурге преобладаю- щим генетическим семейством является LAM - 14,1% [1, 7, 10]. Кроме того, на территории РФ было выявлено такое генетическое семейство, как Ural, характерное в большей степени для Уральского региона, Саратов- ской и Омской областей. Таким образом, существует значительная неодно- родность штаммов M. tuberculosis, которая сочетается с разнообразием иммунного гомеостаза носителей заболевших, и тем самым существенно осложняет ла- бораторную диагностику туберкулеза. Для понимания этих сложностей необходимо рассмотреть некоторые особенности развития противотуберкулезного им- мунного ответа. Длительный период времени диагностика тубер- кулеза, основанная на факторах гуморального иммун- ного ответа, считалась неэффективной и неоправдан- ной, так как основной механизм защиты организма против M. tuberculosis - это клеточно-опосредованный иммунитет. Тем не менее, гуморальный иммунитет является достаточно ранним «свидетелем» инфициро- вания M. tuberculosis, и при активном туберкулезном процессе в сыворотке крови больных туберкулезом обнаруживается повышенный титр противотуберку- лезных антител [9, 14, 16]. Однако, несмотря на то, что M. tuberculosis явля- ется преимущественно внутриклеточным микроорга- низмом, ярко выраженной поляризации иммунного ответа в сторону Th1-типа не происходит. Это связано с тем, что дифференцировку «наивных» Т-хелперов в сторону Th1- или Th2 регулируют многие факторы: локальное цитокиновое микроокружение, наличие гормонов, тип антигенпрезентирующих клеток (АПК), стимулирующих Т-клетки, количество и природа анти- гена, плотность Т-клеточных рецепторов (TCR), сила сигнала - суммарная аффинность связи TCR с анти- геном. У человека, в отличие от инбредных мышей, нет строгого разделения профилей секретируемых цитокинов между Th1 и Th2. Например, Th1 могут се- кретировать интерлейкин (ИЛ)-10 и ИЛ-13. Главным 216 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры отличием между популяциями клеток является секре- ция γ-интерферона (γ-ИНФ), ИЛ-12 первым, а ИЛ-4 - вторым типами Т-хелперов. Экспериментальные исследования убедительно демонстрируют наличие взаимозависимости и синергии между клеточным и гуморальным иммунитетом [9, 25, 31]. В течении развития инфекционного процесса внутриклеточный патоген M. tuberculosis может быть локализован и внеклеточно, например в верхних от- делах респираторного тракта в начале заболевания или при разрушении гранулем, и доступен для спец- ифических антител. R. A. Brierley, G. R. Davis, G. C. Holtz [20], S. Guo [20] показали, что у контактных по туберкулезу Th1- ответ превалирует над Th2-ответом, при этом повышение активности Th2 у данной группы пациентов ассоци- ировано с высоким риском активации заболевания, при клиническом выздоровлении клеточное звено им- мунного ответа вновь преобладает над гуморальным. Антитела при туберкулезе играют важную роль в усилении иммунной защиты организма против M. tuberculosis. Они участвуют в нейтрализации токси- нов (например, нейтрализуют токсический эффект корд-фактора), в реакциях опсонизации, активации комплемента по классическому пути, антитело-за- висимой клеточной цитотоксичности, презентации антигена, способствуют фагосомально-лизосо- мальному слиянию, секреции провоспалительных цитокинов. Установлено, что антимикобактериальные антитела усиливают клеточный иммунитет против микобактерий, в том числе за счет стимулирования пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток и выброса ими γ-ИНФ [9, 14]. Кроме того, противотуберкулезные антитела препятствуют адгезии бактерий к клеткам тканей хозяина. В частности, обработка фильтрата культуры M. tuberculosis, интраназально вводимого лабораторным мышам, антителами к поверхностному гликопротеину, участвующему в адгезии микобакте- рий к эпителиальным клеткам, позволила уменьшить обсемененность селезенки микобактериями [21]. Так, в ряде исследований было продемонстрировано, что введение иммунокомпетентным мышам (дефицитным по В-клеткам или с тяжелым комбинированным имму- нодефицитом), инфицированным M. tuberculosis или M. bovis, моноклональных антител против некоторых антигенов M. tuberculosis (НВНА, 16 кДа белок, Ag85A, Ag85B, МРТ83, ЛАМ), способствует снижению обсеме- ненности тканей микобактериями и увеличению про- должительности жизни животных за счет уменьшения гранулематозного воспаления и некроза тканей [6, 17, 21, 27, 29]. Гуморальный иммунитет может играть большую роль в защите против туберкулеза, чем предполага- лось ранее. Например, в легких у больных туберку- лезом людей обнаруживаются фолликулоподобные агрегаты, состоящие из В-клеток, а у больных обезьян - даже активированные В-клетки. То есть В-клетки и специфические противотуберкулезные антитела мо- гут принимать участие в развитии локального иммунитета в очаге инфекции и в стимуляции системного иммунитета в организме больного туберкулезом [18, 30]. В формировании гуморального иммунного ответа при туберкулезе наблюдается тенденция к нараста- нию титра и повышению аффинности противотубер- кулезных иммуноглобулинов (Ig) изотипов - G и A при усилении активности туберкулезного процесса. При развитии вторичного туберкулеза титр данных антител и их аффинность значительно увеличиваются в связи с активацией механизма иммунологической памяти [9]. Противотуберкулезные IgM антитела при актив- ном туберкулезном процессе определяются редко. Вероятно, это связано с тем, что IgM синтезируются на ранних этапах развития инфекции, присутствуют в крови непродолжительное время и, как правило, в меньшей концентрации, чем IgG и IgA. Существу- ет предположение о том, что IgM могут связывать широкий спектр антигенов с низкой аффинностью, а зрелые IgG, напротив - узкий круг антигенов, но с более высоким сродством к ним. Поэтому большин- ство исследований гуморального иммунитета при туберкулезе сосредоточено на определении антител класса G или А [9, 33]. Нами [9] было показано, что при туберкулезе повы- шен титр и антител класса IgE, однако они находятся в сыворотке крови в основном в связанном состоянии в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). После проведенного лечения антительный ответ на M. tuberculosis, как правило, угасает, однако противоту- беркулезные антитела могут персистировать в крови еще некоторое время [30]. Так, установлено, что формируется угасание антительного ответа к белкам фильтрата культуры M. tuberculosis в течение 3 лет, а к белкам менее 20 кДа - в течение двух лет после начала химиотерапии [29, 30]. Чаще всего противо- туберкулезные антитела обнаруживаются в сыворотке больных до 3 месяцев после начала лечения, однако уже через 9-12 месяцев они полностью исчезают [30]. Характер иммунного ответа при туберкулезе зави- сит от природы антигенов M. tuberculosis и их свойств. Например, гуморальный иммунный ответ формирует- ся преимущественно на высокомолекулярные белки (38 кДа, 81 кДа, 309 кДа (Rv3347), а Т-клеточный от- вет - на низкомолекулярные белки (ESAT-6, CFP-10, TB7.7) [16, 19]. Антителообразование при туберкулезе могут стиму- лировать и выявлять различные компоненты микобакте- рий: белки, липиды, полисахариды. Считается, что при определенных вариантах туберкулеза на гликолипидные антигены M. tuberculosis формируется более выражен- ный гуморальный ответ, чем на белковые антигены [30]. Липидные и полисахаридные антигены M. tuberculosis относятся к тимуснезависимым антигенам, которые презентируются незрелыми дендритными и В-клетками, тимоцитами TCRγδ и TCRαβ∕CD4-CD8- Т-лимфоцитами, а также Т-клетками, натуральными киллерами (НКТ) в комплексе с молекулой CD1. При этом одни антигены, такие как ЛАМ и глюкоза мономиколат, презентируются ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 217 Обзоры в комплексе с белками CD1 1-й группы (CD1a, CD1b, CD1c), а другие с CD1 2-й группы (CD1d). Активирован- ные антигеном CD1-рестрицированные Т-клетки могут секретировать как Th2-цитокины (ИЛ-4, ИЛ-13), стиму- лирующие активацию В-клеток, так и непосредственно взаимодействовать с CD1∕CD21 - экспрессирующими В-клетками маргинальной зоны селезенки, способствуя усилению антительного ответа на небелковые антигены [4, 16, 20, 31]. Повышенная экспрессия CD1 на незрелых дендрит- ных клетках предполагает, что CD1-рестрицированные Т-клетки могут функционировать в более раннюю фазу иммунного ответа, чем главный комплекс гистосов- местимости (ГКГС), а значит, CD1 - опосредованная презентация антигенов служит основанием для воз- можности детекции микобактериальной инфекции вне зависимости от состояния Т-клеточного иммунитета [31, 33]. В течение туберкулезного процесса происходит изменение спектра антигенов, синтезируемых ми- кобактериями в зависимости от стадии и степени распространенности заболевания. Следовательно, и антитела к разным антигенам микобактерий имеют разную динамику [30] Например, антитела к 16 кДа белку определяют- ся еще в латентную фазу заболевания, а антитела к 38 кДа белку характерны для активного прогресси- рующего туберкулезного процесса с деструктивным поражением тканей легких. Антитела к антигенам M. tuberculosis детектируют не только в сыворотке кро- ви, но и в других биологических средах организма: в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), плевральной, асцитической жидкостях и моче [22, 28]. Отсутствие противотуберкулезных антител в сыво- ротке больных туберкулезом может быть обусловлено включением этих антител в состав ЦИК. В ЦИК могут входить иммуноглобулины всех классов, присутству- ющих в повышенных титрах у больных туберкулезом (IgG, IgA, IgM, IgE), что может повлиять на эффектив- ность серодиагностики при туберкулезе [9]. Гуморальный ответ на антигены M. tuberculosis при туберкулезе гетерогенен. В зависимости от этниче- ских и индивидуальных генетических особенностей организма, стадии и формы туберкулеза, сопутству- ющих заболеваний, а также региона проживания па- циента выраженность гуморального ответа на одни и те же антигены может быть различна [6, 16]. Прежде всего, гетерогенность гуморального иммунного от- вета при туберкулезе обуславливают иммуногенети- ческие различия больных туберкулезом. Например, полиморфизм системы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) определяет различия в степени ре- зистентности иммунной системы против туберкулеза. Так, установлено, что фенотип HLA-DR2 ассоциирован с повышенной восприимчивостью к туберкулезу и из- мененными антительным и клеточным ответами при легочном туберкулезе [5, 13]. Установлено, что наличие в генотипе у больного од- ного из трех вариантов сочетаний генов (HLA-DRB1*04 и HLA-DQB1*02, HLA-DRB1*16 и HLA-DQB1*03 (или HLA-DQB1*05)) предрасполагает к тяжелому про- грессирующему течению туберкулеза с доминиро- ванием гуморального иммунитета, а генотип только HLA-DQB1*03, напротив, ассоциирован с ограни- ченными формами туберкулеза и незначительным возрастанием титра противотуберкулезных антител в крови. Сниженная восприимчивость к туберкулезу обнаружена, например, у афроамериканцев с HLA- DR6 [10, 18]. Таким образом, при оценке гуморального иммунного ответа на антигены M. tuberculosis необ- ходимо использовать сыворотки больных и здоровых доноров (в качестве отрицательных контролей) из одного региона. Иммунный ответ на M. tuberculosis различается у пациентов разного пола и возраста. Например, уста- новлено наличие повышенной восприимчивости к туберкулезу у лиц женского пола до, а у лиц мужского пола после полового созревания. Данные наблюдения в литературе объясняются возможной протективной ролью женских половых гормонов, однако истинная причина данного наблюдения пока не установлена [30]. Известно, что чувствительность серодиагности- ческих проб на туберкулез у детей варьирует от 14 до 85%, а специфичность - от 86 до 100%. Широ- кая вариабельность данных значений обусловлена многими факторами. Так, точность диагностики зависит от возраста ребенка, времени проведения вакцинации против туберкулеза вакциной Bacillus Calmette - Guérin (BCG) (БЦЖ), формы туберкулеза, изотипа антител, определяемого в исследовании, способом определения значения «cutoff». Тем не менее многие авторы [15, 19] отмечают перспективы применения серодиагностики туберкулеза у детей, так как в сыворотках детей больных туберкулезом определяются повышенные, по сравнению со здо- ровыми детьми, титры антител против некоторых гликолипидных (PGL-Tb1, диацилтрегалоза (ДАТ)) и белковых (А60, 38 кДа, антигены комплекса Ag85) антигенов M. tuberculosis. С возрастом реактивность специфического противотуберкулезного иммунитета (клеточного и гуморального) угасает. У лиц старше 60 лет вы- раженность реакции на туберкулин ниже, чем у лиц молодого и среднего возраста. Реактивность пробы Манту в 65-74 года падает с 50 до 10%, а старше 95 лет - до 5% [10]. Надо понимать, что особенности развития им- мунного ответа связаны не только с состоянием иммунного гомеостаза, но и с вирулентностью M. tuberculosis. В настоящее время для изучения ви- рулентности штаммов M. tuberculosis используют макрофаги, которые позволяют количественно опре- делить гибель контаминированных клеток. Штаммы M. tuberculosis, так же как и другие микроорганизмы могут отличаться по способности к адгезии, инвазии, адаптации к условиям макроорганизма, агрессии, продукции токсинов. 218 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры Один из основных генетических локусов вирулент- ности RD1 (Region of Difference 1) играет ключевую роль в патогенности микобактерий. Его делеция приводит к потере вирулентности, а внедрение в геном BCG, повышает вирулентность вакцинного штамма. Компоненты клеточной стенки, такие как «корд-фактор», липоарабиноманнан (LAM), феноль- ные гликолипиды, сульфатиды подавляют продукцию активных форм кислорода, синтез γ-ИФН. А LAM, кро- ме того, препятствует образованию фаголизосомы, пролиферации Т-лимфоцитов и способствует инги- бированию активности макрофагов. Препятствует образованию фаголизосомы, а в итоге - развитию микробицидных эффектов со стороны макрофагов и фермент микобактерий - липидная фосфатаза (SapM). Вирулентные микобактерии имеют гомолог гена Rv0394c, который кодирует белок со свойствами ги- алуронидазы и хондросульфатазы, способствующие инвазии и распространению микобактерий в макроор- ганизме, а у непатогенных микроорганизмов данный гомолог отсутствует [12, 15, 18, 20]. Другим важным аспектом является наличие гена МТ2175 и гена, кодирующего белок SecA2, отсутствие которых снижает темп размножения и скорость роста микобактерий, то есть M. tuberculosis способны изме- нять темп размножения внутри хозяина в зависимости от сложившихся условий и оптимальной адаптации в организме хозяина. У микобактерий, в отличие от других бактерий, выделена система ESX, которая секретирует небольшие белковые молекулы вирулент- ности. В частности, ESAT-6, CFP10, которые считаются главными белковыми факторами вирулентности M. tuberculosis. Кодируют секрецию данных белков гены Rv3875 и Rv3874, находящиеся в локусе RD1. Эти белки инактивируют макрофаги, дендритные клетки, препятствуют слиянию фагосомы с лизосомальными гранулами. Секреция ESAT-6 микобактериями приво- дит к дестабилизации и лизису липосомы [17, 21, 26]. Таким образом, рассмотренные особенности вирулентности и иммунопатогенеза M. tuberculosis обуславливают естественные трудности диагностики туберкулезной инфекции. Кожные пробы (Манту, «Диаскин-тест», проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным) хороши для скрининговой диагностики, но каждый имеет свои недостатки, снижающие их специфичность [24, 27]. Культуральная методика диагностики туберкулеза высокоспецифична, является «золотым стандартом диагностики», и помимо этого, она позволяет опреде- лять чувствительность возбудителя к антибиотикам. Однако эта методика требует длительного ожидания (занимает 4-12 недель, а окончательный ответ дается не ранее 8 недель), в части случаев оказывается без- результатной и является небезопасной для здоровья медицинского персонала [29]. Полуавтоматизированная радиометрическая культуральная методика с использованием таких си- стем, как BACTEC TB-460, BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD) и MB/BacT (Organon Teknika), позволяет обнаружить возбудителя в более короткие сроки (10-20 дней), однако, достаточно дорога для повсеместного применения [34]. Рентгенологическое обследование неспецифично и не является экономически оправданной методикой скрининга населения на туберкулез. При сочетании туберкулеза с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекцией) эта методика часто дает атипичную картину, и в 10-20% изменения на рентге- нограмме остаются в пределах нормы [8]. Методики диагностики, основанные на ПЦР (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test, Gen-Probe; Amplicor, Roche; ProbeTec ET, BD Becton Dickinson, Sparks, MD) имеют высокую специфич- ность. В то же время чувствительность их, как правило, невысокая, что обусловлено трудностями амплифика- ции олигобациллярных образцов, влияния ингибито- ров, присутствующих в образцах, на течение реакции и другими факторами. С помощью ПЦР сложно диффе- ренцировать M. tuberculosis от других представителей комплекса M. tuberculosis из-за высокого сходства их геномов. Также применение этих методик ограничено относительно высокой стоимостью анализа, необхо- димостью наличия дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов [8]. Поэтому в перспективе основными методиками лабораторной диагностики туберкулезной инфекции должны стать иммунологические. Для оптимизации туберкулезной инфекции необходимо рассмотреть наиболее эффективные серодиагностические мар- керы туберкулеза при различных формах и стадиях заболевания. Во-первых, эти антигены должны быть специфичны для комплекса M. tuberculosis, во-вторых, специфические антитела против данных антигенов должны определяться при активном туберкулезном процессе в значительно более высоком титре, чем при латентной инфекции. В-третьих, сыворотки здоровых БЦЖ-вакцинированных людей, а также пациентов с ложноположительной реакцией на туберкулин должны проявлять минимальную реактивность в отношении выбранных антигенов. Важным критерием выбора антигенных препаратов является возможность вы- явления с помощью них случаев «мазок-негативного» легочного, внелегочного туберкулеза, а также тубер- кулеза у ВИЧ-инфицированных людей. Понятно, что такую идеальную картину диагностики туберкулеза практически сконструировать на современном уров- не биотехнологии практически нереально, однако повысить диагностическую ценность исследования вполне можно. Достаточно высокую диагностическую ценность имеют секретируемые белки MPT70, MPT64 и белки комплекса Ag85. Это было связано, прежде всего, с обнаружением этих антигенов в фильтрате культуры в большом количестве, а также с тем, что секрети- руемые белки стимулируют выраженную ответную реакцию иммунной системы. Среди внутриклеточных белков наибольшее значение имеют белки теплового шока, такие как HSP60, HSP70, HSPX. Среди мем- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 219 Обзоры бранных антигенов - это 19 и 38 кДа липопротеины, а также ЛАМ [6, 15]. После расшифровки генома M. tuberculosis в 1998 г, стало возможным изучение струк- туры и свойств многих неизвестных ранее антигенов. Методом сравнительной геномики идентифицирова- но несколько «регионов различий» (RD1-16) между M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG [21]. Существующие данные свидетельствуют о том, что RD1 отсутствует также в геномах большинства нетуберкулезных ми- кобактерий. Для серодиагностики туберкулеза наиболее важно определение заболевания на начальных этапах акти- вации туберкулезного процесса. Спектр синтезиру- емых антигенов M. tuberculosis и антительный ответ на них меняется в зависимости от стадии и формы заболевания. Так, например, повышенный титр анти- 14 кДа антител ассоциирован с хронической формой заболевания в большей степени, чем с активным ту- беркулезным процессом, антитела к ESAT-6 определя- ются уже в латентном периоде заболевания, но их титр существенно нарастает при активации туберкулеза. Высокий уровень анти-32кДа антител определяется на ранних стадиях прогрессирования заболевания до фазы распада и диссеминирования, а антител про- тив 38кДа белка - при активном прогрессирующем кавернозном туберкулезе легких [14, 18, 19]. Антитела изотипа IgG к корд-фактору (трегалоза- 6,6-димиколат) были детектированы путем иммуно- ферментного анализа (ИФА) от 81 до 91,5% мазок- позитивных больных туберкулезом и только у 4% здоровых доноров [19]. Также были выявлены антитела и к 6 производным трегалозы у 91,5% из 924 госпитализированных и у 93,3% из 210 вновь выявленных туберкулезных боль- ных [17]. При сравнении в ИФА серодиагностической эффективности четырех липидных антигенов M. tuberculosis (корд-фактора, ДАТ, TAT и SL I), наилучшие показатели чувствительности (81% при детекции IgG, 66% - IgА) и специфичности (77,6% -IgG и 87% - IgА) были получены для SL I [19]. Анти-PGL-Tb1 антитела класса А были выявлены у 88% больных (независимо от результатов бакте- риоскопии мазка мокроты) и ни у одного здорового пациента из контрольной группы, при этом в ходе лечения титры данных антител снижались [14]. Многие данные свидетельствуют о высокой эффективности серологических проб, основанных на гликолипидных антигенах M. tuberculosis, при выявлении туберкулеза у ВИЧ-инфицированных. ИФА, детектирующий антитела к двум антигенам M. tuberculosis, ЛАМ и 38кДа белку, показывает чув- ствительность до 71% при специфичности 100% [14, 16, 30]. Одним из способов усовершенствования серо- диагностических проб, способствующих повышению чувствительности серодиагностики туберкулеза, яв- ляется создание полиэпитопных химерных антигенов путем химической конъюгации белков с углеводными молекулами. Такой структурой могут быть олигосахаридные фрагменты арабиноманнана, выделенные из ЛАМ штамма M. tuberculosis H37Rv, ковалентно конъюгированные с белками фильтрата культуры M. tuberculosis штамма Harlingen (Ag85B и 75кДа), а также с тетанус-токсином (в качестве контроля для углевод- ного компонента конъюгатов) [22, 27]. Также одним из путей повышения эффективности серодиагностики туберкулеза является создание ком- позиции (коктейля) из нескольких иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis. При включении в него анти- генов M. tuberculosis только с высокой специфичностью можно достичь увеличения чувствительности диагно- стики при минимальном числе ложноположительных результатов. Таким вариантом может быть коктейль, включающий антигены Rv3425, ЛАМ и 38 кДа белок. Комбинация трех данных антигенов в одной пробе по- зволила повысить чувствительность серодиагностики с одним антигеном с 20,6-35,3 до 61,8% для легочного и внелегочного туберкулеза, специфичность при этом снизилась только на 3,5-7% [35]. В настоящее время рассматривается коктейль из 5 антигенов (Rv2031c, Rv2185c, Rv2537c, Rv2785c, Rv3354) со специфично- стью 100% и чувствительностью 76%. Однако объ- единение различных антигенов в единый коктейль может повлиять на их стабильность в смеси и, сле- довательно, на эффективность взаимодействия со специфическими антителами. Возможным вариантом решения этой проблемы является создание гибрид- ных белков, состоящих из наиболее иммуногенных белков M. tuberculosis, либо только из иммунодоми- нантных эпитопов этих белков [28]. Химерные белки, содержащие только высоко- специфичные пептиды иммунодоминантных белков M. tuberculosis, имеют перспективы стать лучшими серомаркерами туберкулеза [26, 28]. В недавнем ис- следовании с помощью 2 химерных белков, состоящих из 3 (38кДа-ESAT6-CFP10) и 4 (Mtb8.4-MPT64-TB16.3- Mtb8) антигенов M. tuberculosis было выявлено более 85% случаев легочного и около 75% внелегочного туберкулеза (при специфичности 90%) [30]. Одним из вариантов генетической конъюгации микобактериальных антигенов является слитый белок Ag85B-ESAT-6, он включает в себя последователь- ности двух высокоиммуногенных секретируемых белков M. tuberculosis. Антиген Ag85B-ESAT-6 имеет перспективы для использования его в качестве вак- цины у людей [6, 17]. В настоящее время на территории РФ разрешены к применению в клинической практике Министерства здравоохранения РФ несколько серологических проб на туберкулез: TB-Spot ver.2.0 (Span Diagnostics Ltd, Индия), iCHECK-TB (IND, Канада) и Иммунохром- анти-МТ-экспресс (общество с ограниченной от- ветственностью Прогрессивные биомедицинские технологии, Россия). TB-Spot ver.2.0 позволяет обна- руживать антитела к антигенам M. tuberculosis (ЛАМ и 38кДа белку) в 80-85% случаев туберкулеза и имеет специфичность 95%. Другие две пробы основаны на определении антител к антигенному комплексу M. 220 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры tuberculosis А60 - их чувствительность составляет 70-80%, а специфичность - 80-100% среди различ- ных групп туберкулезных больных на территории РФ [4, 13]. На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что серодиагностика является перспек- тивной методикой для выявления туберкулеза, однако для утверждения ее в качестве стандарта необходимо значительное повышение чувствительности и спец- ифичности существующих серологических проб. Наибольшей эффективностью для обнаружения ту- беркулеза будут обладать серопробы, основанные на мультиантигенных композициях, включающих имму- нодоминантные белковые и гликолипидные антигены M. tuberculosis. Иммунодиагностика предоставляет новые возможности для улучшения диагностики туберкулеза. Она позволяет обнаружить активный туберкулезный процесс в организме на основании иммунологических признаков инфекции. Иммунодиагностика имеет перспективы для выявления туберкулеза в короткие сроки вне зависимости от локализации инфекции и формы заболевания.

References

  1. Беспятых, Ю.А. Геномная и протеомная характеристика штам- мов Mycobacterium tuberculosis кластера Beijing BO/W148: дис.. канд. биол. Наук / Ю.А. Беспятых. - М.: НИИБМХ им. В.Н. Ореховича РАМН. - 2016. - 377 с.
  2. Василенко, Н.В. Современные взгляды на генетические се- мейства M. tuberculosis / Н.В. Василенко, А.М. Будрицкий // Вестн. ВГМУ. - 2014. - Т. 13, № 5. - С. 16-22.
  3. Васильева, Н.Р. Генотипы штаммов Mycobacterium tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью и клинико-эпи- демиологические особенности туберкулеза легких / Н.Р. Васильева [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2016. - Т. 6, № 2. - С. 179-183.
  4. Жердев, А.В. Сравнительная характеристика рекомбинант- ных белков Mycobacterium tuberculosis в серодиагностике туберкулеза / А.В. Жердев [и др.] // Физиол. и патол. им- мунной системы. - 2006. - Т. 9. - C. 3-8.
  5. Капков, Л.П. Значение показателей резервуара бациллярных больных туберкулезом органов дыхания в оценке эпидеми- ческой ситуации по туберкулезу / Л.П. Капков // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2007. - № 1. - C. 17-22.
  6. Кравченко, Т.Б. Клонирование и экспрессия протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis Ag85 и ESAT-6 в клетках Francisella tularensis 15/10 / Т. Б. Кравченко [и др.] // Биохимия. - 2007. - Т. 72, № 7. - С. 905-914.
  7. Мокроусов, И.В. Высокоразрешающее типирование штаммов генотипа Beijing российской популяции Mycobacterium tuberculosis / И.В. Мокроусов, Д.А. Старкова, О.В. Нарвская // Туберкулез и болезни легких. - № 7. - С. 46-53.
  8. Москалев, А.В. Проблемы скрининговой диагностики тубер- кулезной инфекции / А.В. Москалев, В.Б. Сбойчаков, М.Н. Павлов // Мат. Всеросс. научн.о-практ. конф. «Микробио- логия: от микроскопа до геномного анализа», 17-18 мая 2018. - СПб., 2018. - С. 77-80.
  9. Москалев, А.В. Общая иммунология с основами клинической иммунологии / А.В. Москалев, В.Б. Сбойчаков, А.С. Рудой. - М.: Гэотар, 2015. - 351 с.
  10. Нарвская, О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе: автореф. дис… д-ра мед. наук / О. В. Нарвская. - СПб.: СПб НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2003. - 35 с.
  11. Пасечник, О.А. Генетическое разнообразие лекарственно- устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis в Омской области / О.А. Пасечник [и др.] // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2017. - Т. 95, № 7. - С. 33-39.
  12. Подвальный, Н.М. Циклизация 1,2-(метил) ортобензоата P-D-арабинофуранозы с помощью бромида магния / Н.М. Подвальный [и др.] // Известия академии наук. Серия хи- мическая. - 2009. - № 3. - С. 472-473.
  13. Салина, Т.Ю. Распространенность, региональные особен- ности генетической структуры и лекарственная устойчи- вость микобактерий туберкулеза семейства Haarlem среди больных туберкулезом Саратовской области / Т.Ю. Салина, Т.И. Морозова // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2017. - Т. 95, № 5. - С. 60-64.
  14. Abebe, F. The protective role of antibody responses during Mycobacterium tuberculosis infection / F. Abebe, G. Bjune // Clinical and experimental immunology. - 2009. - Vol. 157, № 2. - P. 235-243.
  15. Abronina, P.I. Formation of orthoester-linked D-arabinofuranose oligosaccharides and their isomerization into the corresponding glycosides / P.I. Abronina [et al.] // Tetrahedron Lett. - 2011. - Vol. 52. - P. 1794-1796.
  16. Achkar, J.M. Antibody responses to mycobacterial antigens in children with tuberculosis: challenges and potential diagnostic value / J.M. Achkar, A. Ziegenbalg // Clinical and Vaccine Immunology. - 2012. - Vol. 19, № 12. - P. 1898-1906.
  17. Achkar, J.M. Mycobacterium tuberculosis malate synthase - and MPT51-based serodiagnostic assay as an adjunct to rapid identification of pulmonary tuberculosis / J. M. Achkar [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2006. - Vol. 113. - P. 1291-1293.
  18. Bezerra, J.M. A Study of IgA antibody response to different Mycobacterium tuberculosis antigens in the diagnosis and monitoring of pulmonary tuberculosis / J. M. Bezerra [et al.] // The Brazilian journal of infectious diseases. - 2009. - Vol. 13, № 1. - P. 53-58.
  19. Boehme, C. Detection of mycobacterial lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis / C. Boehme [et al.] // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2005. - Vol. 99, № 12. - P. 893-900.
  20. Brierley, R.A. Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells / R.A. Brierley, G.R. Davis, G.C. Holtz // United States Patent 5324639-1994.
  21. Brusasca, P.N. Immunological characterization of antigens encoded by the RD1 region of the Mycobacterium tuberculosis genome / P.N. Brusasca [et al.] // Scand. J. Immunol. - 2001. - Vol. 54. - P. 448-452.
  22. Daley, P. Blinded evaluation of commercial urinary lipoarabinomannan for active tuberculosis: a pilot study / P. Daley [et al.] // The international journal of tuberculosis and lung disease. - 2009. - Vol. 13, № 8. - P. 989-995.
  23. Desikan, P. Sputum smear microscopy in tuberculosis: Is it still relevant? / P. Desikan // Indian. J. Med. Res. - 2013. - Vol. 137, № 3. - P. 442-444.
  24. Felber, A. Weakly positive tests and chronologic variation of the QuantiFERON assay: A retrospective appraisal of usefulness / A. Felber, W. Graninger // Tuberculosis. - 2013. - Vol. 93, № 6. - P. 647-653.
  25. Feng, X. Enhanced serodiagnostic utility of novel Mycobacterium tuberculosis polyproteins / X. Feng [et al.] // J. Infect. - 2013. - Vol. 66, № 4. - P. 366-375.
  26. Guo, S. The CFP10/ESAT6 complex of Mycobacterium tuberculosis may function as a regulator of macrophage cell death at different stages of tuberculosis infection / S. Guo [et al.] // Med. hypotheses. - 2012. - Vol. 78, № 3. - P. 389-392.
  27. He, X.Y. Assessment of five antigens from Mycobacterium tuberculosis for serodiagnosis of tuberculosis / X.Y. He [et al.] // Clinical and vaccine immunology. - 2011. - Vol. 18, № 4. - P. 565-570.
  28. Kashyap, R. S. Diagnosis of tuberculosis infection based on synthetic peptides from Mycobacterium tuberculosis antigen complex / R.S. Kashyap [et al.] // Clin. Neurol. Neurosurg. - 2013. - Vol. 115, № 6. - P. 678-683.
  29. Kumar, G. Whole cell & culture filtrate proteins from prevalent genotypes of Mycobacterium tuberculosis provoke better antibody & T cell - 2012. - Vol. 135. - P. 745-755.
  30. Kunnath-Velayudhan, S. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome / S. Kunnath- Velayudhan [et al.] // PNAS. - 2010. - Vol. 107, № 33. - P. 14703-14708.
  31. Maglione, P.J. How B cells shape the immune response against Mycobacterium tuberculosis / P.J. Maglione, J. Chan // Eur. J. Immunol. - 2009. - Vol. 39. - P. 676-686.
  32. Manivannan, S. Role of complement activation andantibody in the interaction between Mycobacterium tuberculosis and human macrophages / S. Manivannan, V.N. Rao, V.D. Ramanathan // Indian. J. Exp. Biol. - 2012. - Vol. 50, № 8. - P. 542-550.
  33. Phuah, J.Y. Activated B cells in the granulomas of nonhuman primates infected with Mycobacterium tuberculosis / J.Y. Phuah [et al.] // Am. J. Pathol. - 2012. - Vol. 181. - P. 508-514.
  34. Planatscher, H. Systematic reference sample generation for multiplexed serological assays / H. Planatscher [et al.] // Scientific reports. - 2013. - Vol. 3, № 3259. - P. 1-5.
  35. Raqib, R. Detection of antibodies secreted from circulating Mycobacterium tuberculosis-specific plasma cells in the diagnosis of pediatric tuberculosis / R. Raqib [et al.] // Clinical and vaccine immunology. - 2009. - Vol. 16, № 4. - P. 521-527.

Statistics

Views

Abstract - 104

PDF (Russian) - 111

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2018 Moskalev A.V., Sboychakov V.B., Apchel A.V., Cygan V.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies