The modern characteristic of biology and diagnostics prospect M. tuberculosis

Full Text

Одной из приоритетных задач отечественного здравоохранения является улучшение эпидемиоло- гической ситуации по туберкулезу. По данным Все- мирной организации здравоохранения, Российская Федерация (РФ) входит в список 22 стран с высоким бременем туберкулеза, на которые приходится около 80% случаев данного заболевания в мире. К сожале- нию, согласно ее оценке, до 20% новых случаев тубер- кулеза в России остаются не диагностированными в течение года [8, 16]. При этом каждый невыявленный больной с активной формой туберкулеза ежегодно может заразить до 15 человек, а риск возникновения заболевания у тубинфицированных лиц составляет от 15 до 50% уже в течение первых двух лет после контакта с больным [13, 28]. Таким образом, проблема туберкулеза остается по-прежнему актуальной спустя многие годы. Это связано, в первую очередь, с особенностями био- логии возбудителя. Так род Mycobacterium включает около 160 видов. К тому же отдельные признаки микобактерий сопоставимы с грибами. Например, способность к образованию вегетативных форм, характерный медленный рост [5, 23]. M. tuberculosis относится к царству Bacteria, типу Actinobacteria, классу Actinobacteridae, подклассу Actinomycetales, отряду Firmicutes, подотряду Corynebacterineae, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium [2, 24]. M. tuberculosis - это вид микобактерий, которые вызывают хроническое инфекционное заболевание человека и животных - туберкулез, который разно- образен в клинических проявлениях, наиболее часто поражающий систему органов дыхания, но возможны поражения мочеполовой, нервной систем, желудочно- кишечного тракта, суставов, кожи и периферических лимфатических узлов [11]. M. tuberculosis отличаются особым строением клеточной стенки, что является одним из факторов, определяющих их устойчивость. Клеточная стенка содержит большое количество жирных микотиоловых кислот, ковалентно связанных с пептидогликаном и полисахаридом арабиногалак- таном, обеспечивая тем самым мощный липидный барьер. Отличительной особенностью M. tuberculosis является кислото-, спирто- и щелочеустойчивость, что так же обусловлено высоким содержанием липидов и восков в клеточной стенке бактерии [2]. Бактерии устойчивы и ко многим антисептическим и дегидра- тирующим веществам, средствам на основе четвер- тичного аммония, которые на другие микроорганизмы оказывают губительное влияние. Выраженная внешняя капсула отсутствует, но име- ется полисахаридная микрокапсула, отделенная от клеточной стенки осмиефобной зоной, которая обе- спечивает микобактериям высокую устойчивость к не- благоприятным воздействиям внешней среды [25]. Таким образом, среди основных антигенных структур M. tuberculosis содержатся белки, липиды, полисаха- 214 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры риды и фосфатиды. Преобладают среди них липидные фракции. Антигенные особенности M. tuberculosis, а также M. microti и M. bovis имеют значительное сход- ство. Антигенные связи у микобактерий установлены не только среди видов, но и у родов. В штаммах M. tuberculosis выделяется 10 антигенных компонентов. К ним относятся, например, корд-фактор, или тубер- кулиновые протеиды, который играет важнейшую роль в жизненном цикле туберкулёзной палочки. В состав молекулы корд-фактора входит невосстанавливаю- щийся дисахарид трегалоза, которая также является составной частью фосфоглюкана, а также миколовая и миколиновая жирные кислоты. Важнейшее свойство корд-фактора - высокая токсичность. Также в его функции входит и защита бактериальных клеток от окислительного фосфорилирования в макрофагаль- ных митохондриях, то есть корд-фактор необходим для предохранения микобактерии от фагоцитоза. Микобактерии туберкулёза являются внутриклеточ- ными микроорганизмами, и именно с этим связана их значительная способность персистировать. После первичного инфицирования макрофагов хозяина они организуют специфическую стратегию выживания и размножения в них. Микобактерии пользуются спо- собностью макрофагов образовывать специализи- рованные органеллы (фагосомы) и приспосабливают их для поддержания своей жизнедеятельности. При этом они получают ощутимые преимущества, которые используются для того, чтобы избежать действия защитных механизмов хозяина, например специфи- ческих антител и микробицидных эффектов системы комплемента [3, 11, 26, 32]. У микобактерий имеется специальный маннозный рецептор, а также рецепторы для компонентов систе- мы комплемента (CR1, CR3 и CR4), которые предна- значены для связывания с мембраной макрофага и фагоцитирования внутрь клетки. Внутри фагосомы происходит её ремоделинг, причём таким образом, что прерывается весь процесс её созревания, и в итоге нарушается образование фаголизосомы. Данные особенности корд-фактора делают его одним из основных факторов вирулентности тубер- кулёзных палочек. Туберкулиновый протеин (тубер- кулин) характеризуют ярко выраженные аллерген- ные свойства, заключающиеся в развитии реакции гиперчувствительности IV типа в ответ на попадание данного антигена в организм [4, 27]. Популяция M. tuberculosis обладает выраженной генетической неоднородностью, что объясняется разнообразием генетических характеристик штаммов возбудителя. Специфические для штаммов генети- ческие характеристики обусловливают различия в иммунном ответе хозяина на инфекцию, спектр лекар- ственной устойчивости возбудителей, клинические, патогенетические и эпидемиологические особенно- сти заболевания. Такими характеристиками являются: большое число повторяющихся последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), наличие в геноме микобактерий генов метаболизма жирных кислот, способность генов микобактерий синтезировать незаменимые аминокислоты, витамины, кофакторы и кодировать ферменты, участвующие в липолизе и липогенезе [1, 10, 18]. Благодаря сполиготипированию в настоящее время выделяют 36 генетических семейств M . tuberculosis. Сполиготипирование - методика типи- рования микобактерий туберкулеза, основанная на анализе полиморфизма хромосомного локуса DR (англ. direct repeat - прямой повтор), который содер- жит варьирующее число коротких прямых повторов, разделенных уникальными последовательностями (спейсерами). Продукты полимеразной цепной ре- акции (ПЦР), проводимой с помощью праймеров, комплементарных прямым повторам, гибридизуют с набором синтетических олигонуклеотидов, ковалент- но пришитых к нитроцеллюлозной мембране. Картина гибридизации является сполиготипом каждого штам- ма [19, 28]. Среди 36 генетических семейств выделяют девять суперсемейств микобактерий туберкулезного комплекса: M. Beijing (пекинское семейство), M. africanum, M. bovis, EAI (англ., East African-Indian - восточноафрикано-индийское семейство), CAS (англ., Central Asian - центрально-азиатское семейство), T (широко распространенное, но недостаточно изучен- ное семейство), Haarlem (европейское семейство с малым количеством копий IS6110, широко распро- страненное так же в Соединенных Штатах Америки и Великобритании), LAM (англ., Latin American and Mediterranean - латиноамерикано-средиземномор- ское семейство) [30, 34]. Генетическое семейство M. africanum (nAfri = 180 штаммов) является субклассом M. tuberculosis complex и характеризуется отсутствием 8-го, 9-го и 39-го сигналов в профиле гибридизации по данным сполиготипирования [34]. Данное генетическое семейство распространено преимущественно в За- падной Африке, а также в Сенегале, Мали. Генетическое семейство Т является наиболее фи- логенетически древним и наиболее многочисленным, включает более 1,5 тысяч штаммов M. tuberculosis. Оно характеризуется наличием 31-го, а также 9-го и 10-го сигналов гибридизации, по крайней мере, одного сигнала в 21-24 позициях и одновременным отсутствием 33-36-го сигналов в профиле гибриди- зации [29, 34]. Генетическое семейство EAI (nEAI = 907 штаммов) классифицируется по наличию, по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях и одновременно- му отсутствию 29-32-го и 34-го сигналов в профиле гибридизации [34]. Семейство Haarlem (nHaarlem = 1034 штаммов) характеризует наличие, по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях с и одно- временное отсутствие в профиле 31-й гибридизации, а также 33-36-го сигналов [13, 34]. Генетическое семейство LAM включает два подсемейства: LAM-1 (nLAM-1 = 819 штаммов) и LAM-2 (nLAM-2 = 294 штам- ма) и характеризуется одновременным отсутствием 21-24-го и 33-36-го сигналов, а также присутствием, ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 215 Обзоры по крайней мере, одного сигнала в 1-30-й позициях [10, 34]. Семейство X (nX = 1186 штаммов) имеет в профиле гибридизации одновременное отсутствие 18-го и 33-36-го сигналов или, иногда одновременное отсутствие 18-го и 39-42-го сигналов [10, 34]. На сегодняшний день наибольшее внимание ис- следователей во всем мире привлекает генетическая линия Beijing. Штаммы генотипа Beijing характе- ризуются сполиготипом SIT 1 (от англ. Spoligotype International Type - международный сполиготип), который определяется наличием в DR локусе 9 из 43 спейсеров (с 35-го по 43-й) [1, 10, 34]. Внутри гено- типа исследователи выделяют от 2 до более десятка групп. Чаще дифференциация носит условный харак- тер и зависит от выбранной методики типирования. Согласно данным спонгилотипирования, штамм Beijing обладает уникальным генотипом, в связи с чем в процессе эволюции он приобрел лекарственную устойчивость. Второе название семейства - пекинское, так как впервые оно было обнаружено в гистологических пре- паратах легочной ткани больных предместья Пекина. Отличительная особенность этого генетического семейства - повсеместная широкая распространен- ность, но при этом доминирующее положение оно за- нимает не во всех географических регионах. Наиболь- шая частота встречаемости штаммов M. tuberculosis вариант Beijing зафиксирована в странах Юго- Восточной Азии - 43,1% (Китай, Индонезия, Япония, Вьетнам), наименьшая - в Южной Америке - 0,65% (Бразилия, Аргентина). Для Европы характерен низкий уровень распространенности генотипа Beijing - 7,1%. Россия по данному показателю занимает первое место среди европейских стран [10, 29]. В структуре популяции возбудителей туберкулеза в России доля штаммов Beijing по различным данным составляет от 50 до 80%. На территории Санкт-Петербурга к генетическому семейству Beijing принадлежит 81,2% изученных штаммов [3, 10]. Кроме выраженной лекарственной устойчивости, штамм обладает уникальными свойствами, которые позволили ему распространиться по всему миру. Этими свойствами являются: способность «усколь- зать» от БЦЖ-вакцинирования; относительно быстро приобретать устойчивость к противотубер- кулезным препаратам [3, 11]. Если рассматривать эндемичные штаммы, то наибольший контраст про- является при сопоставлении данных из России, где около 20% представителей генотипа Beijing несут лекарственную устойчивость, и данных из Китая и Японии, где практически все штаммы являются чув- ствительными к проводимой противотуберкулезной терапии. Ветвь современных штаммов генотипа Beijinng несет мутаторный генотип. Объясняется это найденными мутациями в генах системы ре- парации mutT2, mutT4 и ogt. Это может приводить к изменению скорости накопления мутаций, в том числе в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью [11, 35]. Также большой интерес представляют иссле- дования вирулентности Beijing. Данному штамму свойственна гипервирулентность, что подтверждено большим количеством исследований как на уровне макрофагальных моделей, так и на эпидемиологиче- ском уровне [1, 10, 11]. С распространенной лекар- ственной устойчивостью M. tuberculosis связано фор- мирование «скрытого резервуара». После первичного инфицирования в организме пожизненно сохраняется очаг эндогенной инфекции, который способен к ре- активации. Этим же объясняется и невозможность полной ликвидации туберкулеза. Вторыми по распространенности на территории РФ генетическими семействами M. tuberculosis явля- ются штаммы латиноамерикано-средиземноморских семейств - LAM и Haarlem. На территории Северо-За- пада России доля данного генетического семейства составляет 14,5% в случае семейства LAM и 13,3% в случае Haarlem [6]. В Санкт-Петербурге преобладаю- щим генетическим семейством является LAM - 14,1% [1, 7, 10]. Кроме того, на территории РФ было выявлено такое генетическое семейство, как Ural, характерное в большей степени для Уральского региона, Саратов- ской и Омской областей. Таким образом, существует значительная неодно- родность штаммов M. tuberculosis, которая сочетается с разнообразием иммунного гомеостаза носителей заболевших, и тем самым существенно осложняет ла- бораторную диагностику туберкулеза. Для понимания этих сложностей необходимо рассмотреть некоторые особенности развития противотуберкулезного им- мунного ответа. Длительный период времени диагностика тубер- кулеза, основанная на факторах гуморального иммун- ного ответа, считалась неэффективной и неоправдан- ной, так как основной механизм защиты организма против M. tuberculosis - это клеточно-опосредованный иммунитет. Тем не менее, гуморальный иммунитет является достаточно ранним «свидетелем» инфициро- вания M. tuberculosis, и при активном туберкулезном процессе в сыворотке крови больных туберкулезом обнаруживается повышенный титр противотуберку- лезных антител [9, 14, 16]. Однако, несмотря на то, что M. tuberculosis явля- ется преимущественно внутриклеточным микроорга- низмом, ярко выраженной поляризации иммунного ответа в сторону Th1-типа не происходит. Это связано с тем, что дифференцировку «наивных» Т-хелперов в сторону Th1- или Th2 регулируют многие факторы: локальное цитокиновое микроокружение, наличие гормонов, тип антигенпрезентирующих клеток (АПК), стимулирующих Т-клетки, количество и природа анти- гена, плотность Т-клеточных рецепторов (TCR), сила сигнала - суммарная аффинность связи TCR с анти- геном. У человека, в отличие от инбредных мышей, нет строгого разделения профилей секретируемых цитокинов между Th1 и Th2. Например, Th1 могут се- кретировать интерлейкин (ИЛ)-10 и ИЛ-13. Главным 216 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры отличием между популяциями клеток является секре- ция γ-интерферона (γ-ИНФ), ИЛ-12 первым, а ИЛ-4 - вторым типами Т-хелперов. Экспериментальные исследования убедительно демонстрируют наличие взаимозависимости и синергии между клеточным и гуморальным иммунитетом [9, 25, 31]. В течении развития инфекционного процесса внутриклеточный патоген M. tuberculosis может быть локализован и внеклеточно, например в верхних от- делах респираторного тракта в начале заболевания или при разрушении гранулем, и доступен для спец- ифических антител. R. A. Brierley, G. R. Davis, G. C. Holtz [20], S. Guo [20] показали, что у контактных по туберкулезу Th1- ответ превалирует над Th2-ответом, при этом повышение активности Th2 у данной группы пациентов ассоци- ировано с высоким риском активации заболевания, при клиническом выздоровлении клеточное звено им- мунного ответа вновь преобладает над гуморальным. Антитела при туберкулезе играют важную роль в усилении иммунной защиты организма против M. tuberculosis. Они участвуют в нейтрализации токси- нов (например, нейтрализуют токсический эффект корд-фактора), в реакциях опсонизации, активации комплемента по классическому пути, антитело-за- висимой клеточной цитотоксичности, презентации антигена, способствуют фагосомально-лизосо- мальному слиянию, секреции провоспалительных цитокинов. Установлено, что антимикобактериальные антитела усиливают клеточный иммунитет против микобактерий, в том числе за счет стимулирования пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток и выброса ими γ-ИНФ [9, 14]. Кроме того, противотуберкулезные антитела препятствуют адгезии бактерий к клеткам тканей хозяина. В частности, обработка фильтрата культуры M. tuberculosis, интраназально вводимого лабораторным мышам, антителами к поверхностному гликопротеину, участвующему в адгезии микобакте- рий к эпителиальным клеткам, позволила уменьшить обсемененность селезенки микобактериями [21]. Так, в ряде исследований было продемонстрировано, что введение иммунокомпетентным мышам (дефицитным по В-клеткам или с тяжелым комбинированным имму- нодефицитом), инфицированным M. tuberculosis или M. bovis, моноклональных антител против некоторых антигенов M. tuberculosis (НВНА, 16 кДа белок, Ag85A, Ag85B, МРТ83, ЛАМ), способствует снижению обсеме- ненности тканей микобактериями и увеличению про- должительности жизни животных за счет уменьшения гранулематозного воспаления и некроза тканей [6, 17, 21, 27, 29]. Гуморальный иммунитет может играть большую роль в защите против туберкулеза, чем предполага- лось ранее. Например, в легких у больных туберку- лезом людей обнаруживаются фолликулоподобные агрегаты, состоящие из В-клеток, а у больных обезьян - даже активированные В-клетки. То есть В-клетки и специфические противотуберкулезные антитела мо- гут принимать участие в развитии локального иммунитета в очаге инфекции и в стимуляции системного иммунитета в организме больного туберкулезом [18, 30]. В формировании гуморального иммунного ответа при туберкулезе наблюдается тенденция к нараста- нию титра и повышению аффинности противотубер- кулезных иммуноглобулинов (Ig) изотипов - G и A при усилении активности туберкулезного процесса. При развитии вторичного туберкулеза титр данных антител и их аффинность значительно увеличиваются в связи с активацией механизма иммунологической памяти [9]. Противотуберкулезные IgM антитела при актив- ном туберкулезном процессе определяются редко. Вероятно, это связано с тем, что IgM синтезируются на ранних этапах развития инфекции, присутствуют в крови непродолжительное время и, как правило, в меньшей концентрации, чем IgG и IgA. Существу- ет предположение о том, что IgM могут связывать широкий спектр антигенов с низкой аффинностью, а зрелые IgG, напротив - узкий круг антигенов, но с более высоким сродством к ним. Поэтому большин- ство исследований гуморального иммунитета при туберкулезе сосредоточено на определении антител класса G или А [9, 33]. Нами [9] было показано, что при туберкулезе повы- шен титр и антител класса IgE, однако они находятся в сыворотке крови в основном в связанном состоянии в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). После проведенного лечения антительный ответ на M. tuberculosis, как правило, угасает, однако противоту- беркулезные антитела могут персистировать в крови еще некоторое время [30]. Так, установлено, что формируется угасание антительного ответа к белкам фильтрата культуры M. tuberculosis в течение 3 лет, а к белкам менее 20 кДа - в течение двух лет после начала химиотерапии [29, 30]. Чаще всего противо- туберкулезные антитела обнаруживаются в сыворотке больных до 3 месяцев после начала лечения, однако уже через 9-12 месяцев они полностью исчезают [30]. Характер иммунного ответа при туберкулезе зави- сит от природы антигенов M. tuberculosis и их свойств. Например, гуморальный иммунный ответ формирует- ся преимущественно на высокомолекулярные белки (38 кДа, 81 кДа, 309 кДа (Rv3347), а Т-клеточный от- вет - на низкомолекулярные белки (ESAT-6, CFP-10, TB7.7) [16, 19]. Антителообразование при туберкулезе могут стиму- лировать и выявлять различные компоненты микобакте- рий: белки, липиды, полисахариды. Считается, что при определенных вариантах туберкулеза на гликолипидные антигены M. tuberculosis формируется более выражен- ный гуморальный ответ, чем на белковые антигены [30]. Липидные и полисахаридные антигены M. tuberculosis относятся к тимуснезависимым антигенам, которые презентируются незрелыми дендритными и В-клетками, тимоцитами TCRγδ и TCRαβ∕CD4-CD8- Т-лимфоцитами, а также Т-клетками, натуральными киллерами (НКТ) в комплексе с молекулой CD1. При этом одни антигены, такие как ЛАМ и глюкоза мономиколат, презентируются ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 217 Обзоры в комплексе с белками CD1 1-й группы (CD1a, CD1b, CD1c), а другие с CD1 2-й группы (CD1d). Активирован- ные антигеном CD1-рестрицированные Т-клетки могут секретировать как Th2-цитокины (ИЛ-4, ИЛ-13), стиму- лирующие активацию В-клеток, так и непосредственно взаимодействовать с CD1∕CD21 - экспрессирующими В-клетками маргинальной зоны селезенки, способствуя усилению антительного ответа на небелковые антигены [4, 16, 20, 31]. Повышенная экспрессия CD1 на незрелых дендрит- ных клетках предполагает, что CD1-рестрицированные Т-клетки могут функционировать в более раннюю фазу иммунного ответа, чем главный комплекс гистосов- местимости (ГКГС), а значит, CD1 - опосредованная презентация антигенов служит основанием для воз- можности детекции микобактериальной инфекции вне зависимости от состояния Т-клеточного иммунитета [31, 33]. В течение туберкулезного процесса происходит изменение спектра антигенов, синтезируемых ми- кобактериями в зависимости от стадии и степени распространенности заболевания. Следовательно, и антитела к разным антигенам микобактерий имеют разную динамику [30] Например, антитела к 16 кДа белку определяют- ся еще в латентную фазу заболевания, а антитела к 38 кДа белку характерны для активного прогресси- рующего туберкулезного процесса с деструктивным поражением тканей легких. Антитела к антигенам M. tuberculosis детектируют не только в сыворотке кро- ви, но и в других биологических средах организма: в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), плевральной, асцитической жидкостях и моче [22, 28]. Отсутствие противотуберкулезных антител в сыво- ротке больных туберкулезом может быть обусловлено включением этих антител в состав ЦИК. В ЦИК могут входить иммуноглобулины всех классов, присутству- ющих в повышенных титрах у больных туберкулезом (IgG, IgA, IgM, IgE), что может повлиять на эффектив- ность серодиагностики при туберкулезе [9]. Гуморальный ответ на антигены M. tuberculosis при туберкулезе гетерогенен. В зависимости от этниче- ских и индивидуальных генетических особенностей организма, стадии и формы туберкулеза, сопутству- ющих заболеваний, а также региона проживания па- циента выраженность гуморального ответа на одни и те же антигены может быть различна [6, 16]. Прежде всего, гетерогенность гуморального иммунного от- вета при туберкулезе обуславливают иммуногенети- ческие различия больных туберкулезом. Например, полиморфизм системы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) определяет различия в степени ре- зистентности иммунной системы против туберкулеза. Так, установлено, что фенотип HLA-DR2 ассоциирован с повышенной восприимчивостью к туберкулезу и из- мененными антительным и клеточным ответами при легочном туберкулезе [5, 13]. Установлено, что наличие в генотипе у больного од- ного из трех вариантов сочетаний генов (HLA-DRB1*04 и HLA-DQB1*02, HLA-DRB1*16 и HLA-DQB1*03 (или HLA-DQB1*05)) предрасполагает к тяжелому про- грессирующему течению туберкулеза с доминиро- ванием гуморального иммунитета, а генотип только HLA-DQB1*03, напротив, ассоциирован с ограни- ченными формами туберкулеза и незначительным возрастанием титра противотуберкулезных антител в крови. Сниженная восприимчивость к туберкулезу обнаружена, например, у афроамериканцев с HLA- DR6 [10, 18]. Таким образом, при оценке гуморального иммунного ответа на антигены M. tuberculosis необ- ходимо использовать сыворотки больных и здоровых доноров (в качестве отрицательных контролей) из одного региона. Иммунный ответ на M. tuberculosis различается у пациентов разного пола и возраста. Например, уста- новлено наличие повышенной восприимчивости к туберкулезу у лиц женского пола до, а у лиц мужского пола после полового созревания. Данные наблюдения в литературе объясняются возможной протективной ролью женских половых гормонов, однако истинная причина данного наблюдения пока не установлена [30]. Известно, что чувствительность серодиагности- ческих проб на туберкулез у детей варьирует от 14 до 85%, а специфичность - от 86 до 100%. Широ- кая вариабельность данных значений обусловлена многими факторами. Так, точность диагностики зависит от возраста ребенка, времени проведения вакцинации против туберкулеза вакциной Bacillus Calmette - Guérin (BCG) (БЦЖ), формы туберкулеза, изотипа антител, определяемого в исследовании, способом определения значения «cutoff». Тем не менее многие авторы [15, 19] отмечают перспективы применения серодиагностики туберкулеза у детей, так как в сыворотках детей больных туберкулезом определяются повышенные, по сравнению со здо- ровыми детьми, титры антител против некоторых гликолипидных (PGL-Tb1, диацилтрегалоза (ДАТ)) и белковых (А60, 38 кДа, антигены комплекса Ag85) антигенов M. tuberculosis. С возрастом реактивность специфического противотуберкулезного иммунитета (клеточного и гуморального) угасает. У лиц старше 60 лет вы- раженность реакции на туберкулин ниже, чем у лиц молодого и среднего возраста. Реактивность пробы Манту в 65-74 года падает с 50 до 10%, а старше 95 лет - до 5% [10]. Надо понимать, что особенности развития им- мунного ответа связаны не только с состоянием иммунного гомеостаза, но и с вирулентностью M. tuberculosis. В настоящее время для изучения ви- рулентности штаммов M. tuberculosis используют макрофаги, которые позволяют количественно опре- делить гибель контаминированных клеток. Штаммы M. tuberculosis, так же как и другие микроорганизмы могут отличаться по способности к адгезии, инвазии, адаптации к условиям макроорганизма, агрессии, продукции токсинов. 218 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры Один из основных генетических локусов вирулент- ности RD1 (Region of Difference 1) играет ключевую роль в патогенности микобактерий. Его делеция приводит к потере вирулентности, а внедрение в геном BCG, повышает вирулентность вакцинного штамма. Компоненты клеточной стенки, такие как «корд-фактор», липоарабиноманнан (LAM), феноль- ные гликолипиды, сульфатиды подавляют продукцию активных форм кислорода, синтез γ-ИФН. А LAM, кро- ме того, препятствует образованию фаголизосомы, пролиферации Т-лимфоцитов и способствует инги- бированию активности макрофагов. Препятствует образованию фаголизосомы, а в итоге - развитию микробицидных эффектов со стороны макрофагов и фермент микобактерий - липидная фосфатаза (SapM). Вирулентные микобактерии имеют гомолог гена Rv0394c, который кодирует белок со свойствами ги- алуронидазы и хондросульфатазы, способствующие инвазии и распространению микобактерий в макроор- ганизме, а у непатогенных микроорганизмов данный гомолог отсутствует [12, 15, 18, 20]. Другим важным аспектом является наличие гена МТ2175 и гена, кодирующего белок SecA2, отсутствие которых снижает темп размножения и скорость роста микобактерий, то есть M. tuberculosis способны изме- нять темп размножения внутри хозяина в зависимости от сложившихся условий и оптимальной адаптации в организме хозяина. У микобактерий, в отличие от других бактерий, выделена система ESX, которая секретирует небольшие белковые молекулы вирулент- ности. В частности, ESAT-6, CFP10, которые считаются главными белковыми факторами вирулентности M. tuberculosis. Кодируют секрецию данных белков гены Rv3875 и Rv3874, находящиеся в локусе RD1. Эти белки инактивируют макрофаги, дендритные клетки, препятствуют слиянию фагосомы с лизосомальными гранулами. Секреция ESAT-6 микобактериями приво- дит к дестабилизации и лизису липосомы [17, 21, 26]. Таким образом, рассмотренные особенности вирулентности и иммунопатогенеза M. tuberculosis обуславливают естественные трудности диагностики туберкулезной инфекции. Кожные пробы (Манту, «Диаскин-тест», проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным) хороши для скрининговой диагностики, но каждый имеет свои недостатки, снижающие их специфичность [24, 27]. Культуральная методика диагностики туберкулеза высокоспецифична, является «золотым стандартом диагностики», и помимо этого, она позволяет опреде- лять чувствительность возбудителя к антибиотикам. Однако эта методика требует длительного ожидания (занимает 4-12 недель, а окончательный ответ дается не ранее 8 недель), в части случаев оказывается без- результатной и является небезопасной для здоровья медицинского персонала [29]. Полуавтоматизированная радиометрическая культуральная методика с использованием таких си- стем, как BACTEC TB-460, BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD) и MB/BacT (Organon Teknika), позволяет обнаружить возбудителя в более короткие сроки (10-20 дней), однако, достаточно дорога для повсеместного применения [34]. Рентгенологическое обследование неспецифично и не является экономически оправданной методикой скрининга населения на туберкулез. При сочетании туберкулеза с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекцией) эта методика часто дает атипичную картину, и в 10-20% изменения на рентге- нограмме остаются в пределах нормы [8]. Методики диагностики, основанные на ПЦР (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test, Gen-Probe; Amplicor, Roche; ProbeTec ET, BD Becton Dickinson, Sparks, MD) имеют высокую специфич- ность. В то же время чувствительность их, как правило, невысокая, что обусловлено трудностями амплифика- ции олигобациллярных образцов, влияния ингибито- ров, присутствующих в образцах, на течение реакции и другими факторами. С помощью ПЦР сложно диффе- ренцировать M. tuberculosis от других представителей комплекса M. tuberculosis из-за высокого сходства их геномов. Также применение этих методик ограничено относительно высокой стоимостью анализа, необхо- димостью наличия дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов [8]. Поэтому в перспективе основными методиками лабораторной диагностики туберкулезной инфекции должны стать иммунологические. Для оптимизации туберкулезной инфекции необходимо рассмотреть наиболее эффективные серодиагностические мар- керы туберкулеза при различных формах и стадиях заболевания. Во-первых, эти антигены должны быть специфичны для комплекса M. tuberculosis, во-вторых, специфические антитела против данных антигенов должны определяться при активном туберкулезном процессе в значительно более высоком титре, чем при латентной инфекции. В-третьих, сыворотки здоровых БЦЖ-вакцинированных людей, а также пациентов с ложноположительной реакцией на туберкулин должны проявлять минимальную реактивность в отношении выбранных антигенов. Важным критерием выбора антигенных препаратов является возможность вы- явления с помощью них случаев «мазок-негативного» легочного, внелегочного туберкулеза, а также тубер- кулеза у ВИЧ-инфицированных людей. Понятно, что такую идеальную картину диагностики туберкулеза практически сконструировать на современном уров- не биотехнологии практически нереально, однако повысить диагностическую ценность исследования вполне можно. Достаточно высокую диагностическую ценность имеют секретируемые белки MPT70, MPT64 и белки комплекса Ag85. Это было связано, прежде всего, с обнаружением этих антигенов в фильтрате культуры в большом количестве, а также с тем, что секрети- руемые белки стимулируют выраженную ответную реакцию иммунной системы. Среди внутриклеточных белков наибольшее значение имеют белки теплового шока, такие как HSP60, HSP70, HSPX. Среди мем- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 219 Обзоры бранных антигенов - это 19 и 38 кДа липопротеины, а также ЛАМ [6, 15]. После расшифровки генома M. tuberculosis в 1998 г, стало возможным изучение струк- туры и свойств многих неизвестных ранее антигенов. Методом сравнительной геномики идентифицирова- но несколько «регионов различий» (RD1-16) между M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG [21]. Существующие данные свидетельствуют о том, что RD1 отсутствует также в геномах большинства нетуберкулезных ми- кобактерий. Для серодиагностики туберкулеза наиболее важно определение заболевания на начальных этапах акти- вации туберкулезного процесса. Спектр синтезиру- емых антигенов M. tuberculosis и антительный ответ на них меняется в зависимости от стадии и формы заболевания. Так, например, повышенный титр анти- 14 кДа антител ассоциирован с хронической формой заболевания в большей степени, чем с активным ту- беркулезным процессом, антитела к ESAT-6 определя- ются уже в латентном периоде заболевания, но их титр существенно нарастает при активации туберкулеза. Высокий уровень анти-32кДа антител определяется на ранних стадиях прогрессирования заболевания до фазы распада и диссеминирования, а антител про- тив 38кДа белка - при активном прогрессирующем кавернозном туберкулезе легких [14, 18, 19]. Антитела изотипа IgG к корд-фактору (трегалоза- 6,6-димиколат) были детектированы путем иммуно- ферментного анализа (ИФА) от 81 до 91,5% мазок- позитивных больных туберкулезом и только у 4% здоровых доноров [19]. Также были выявлены антитела и к 6 производным трегалозы у 91,5% из 924 госпитализированных и у 93,3% из 210 вновь выявленных туберкулезных боль- ных [17]. При сравнении в ИФА серодиагностической эффективности четырех липидных антигенов M. tuberculosis (корд-фактора, ДАТ, TAT и SL I), наилучшие показатели чувствительности (81% при детекции IgG, 66% - IgА) и специфичности (77,6% -IgG и 87% - IgА) были получены для SL I [19]. Анти-PGL-Tb1 антитела класса А были выявлены у 88% больных (независимо от результатов бакте- риоскопии мазка мокроты) и ни у одного здорового пациента из контрольной группы, при этом в ходе лечения титры данных антител снижались [14]. Многие данные свидетельствуют о высокой эффективности серологических проб, основанных на гликолипидных антигенах M. tuberculosis, при выявлении туберкулеза у ВИЧ-инфицированных. ИФА, детектирующий антитела к двум антигенам M. tuberculosis, ЛАМ и 38кДа белку, показывает чув- ствительность до 71% при специфичности 100% [14, 16, 30]. Одним из способов усовершенствования серо- диагностических проб, способствующих повышению чувствительности серодиагностики туберкулеза, яв- ляется создание полиэпитопных химерных антигенов путем химической конъюгации белков с углеводными молекулами. Такой структурой могут быть олигосахаридные фрагменты арабиноманнана, выделенные из ЛАМ штамма M. tuberculosis H37Rv, ковалентно конъюгированные с белками фильтрата культуры M. tuberculosis штамма Harlingen (Ag85B и 75кДа), а также с тетанус-токсином (в качестве контроля для углевод- ного компонента конъюгатов) [22, 27]. Также одним из путей повышения эффективности серодиагностики туберкулеза является создание ком- позиции (коктейля) из нескольких иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis. При включении в него анти- генов M. tuberculosis только с высокой специфичностью можно достичь увеличения чувствительности диагно- стики при минимальном числе ложноположительных результатов. Таким вариантом может быть коктейль, включающий антигены Rv3425, ЛАМ и 38 кДа белок. Комбинация трех данных антигенов в одной пробе по- зволила повысить чувствительность серодиагностики с одним антигеном с 20,6-35,3 до 61,8% для легочного и внелегочного туберкулеза, специфичность при этом снизилась только на 3,5-7% [35]. В настоящее время рассматривается коктейль из 5 антигенов (Rv2031c, Rv2185c, Rv2537c, Rv2785c, Rv3354) со специфично- стью 100% и чувствительностью 76%. Однако объ- единение различных антигенов в единый коктейль может повлиять на их стабильность в смеси и, сле- довательно, на эффективность взаимодействия со специфическими антителами. Возможным вариантом решения этой проблемы является создание гибрид- ных белков, состоящих из наиболее иммуногенных белков M. tuberculosis, либо только из иммунодоми- нантных эпитопов этих белков [28]. Химерные белки, содержащие только высоко- специфичные пептиды иммунодоминантных белков M. tuberculosis, имеют перспективы стать лучшими серомаркерами туберкулеза [26, 28]. В недавнем ис- следовании с помощью 2 химерных белков, состоящих из 3 (38кДа-ESAT6-CFP10) и 4 (Mtb8.4-MPT64-TB16.3- Mtb8) антигенов M. tuberculosis было выявлено более 85% случаев легочного и около 75% внелегочного туберкулеза (при специфичности 90%) [30]. Одним из вариантов генетической конъюгации микобактериальных антигенов является слитый белок Ag85B-ESAT-6, он включает в себя последователь- ности двух высокоиммуногенных секретируемых белков M. tuberculosis. Антиген Ag85B-ESAT-6 имеет перспективы для использования его в качестве вак- цины у людей [6, 17]. В настоящее время на территории РФ разрешены к применению в клинической практике Министерства здравоохранения РФ несколько серологических проб на туберкулез: TB-Spot ver.2.0 (Span Diagnostics Ltd, Индия), iCHECK-TB (IND, Канада) и Иммунохром- анти-МТ-экспресс (общество с ограниченной от- ветственностью Прогрессивные биомедицинские технологии, Россия). TB-Spot ver.2.0 позволяет обна- руживать антитела к антигенам M. tuberculosis (ЛАМ и 38кДа белку) в 80-85% случаев туберкулеза и имеет специфичность 95%. Другие две пробы основаны на определении антител к антигенному комплексу M. 220 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры tuberculosis А60 - их чувствительность составляет 70-80%, а специфичность - 80-100% среди различ- ных групп туберкулезных больных на территории РФ [4, 13]. На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что серодиагностика является перспек- тивной методикой для выявления туберкулеза, однако для утверждения ее в качестве стандарта необходимо значительное повышение чувствительности и спец- ифичности существующих серологических проб. Наибольшей эффективностью для обнаружения ту- беркулеза будут обладать серопробы, основанные на мультиантигенных композициях, включающих имму- нодоминантные белковые и гликолипидные антигены M. tuberculosis. Иммунодиагностика предоставляет новые возможности для улучшения диагностики туберкулеза. Она позволяет обнаружить активный туберкулезный процесс в организме на основании иммунологических признаков инфекции. Иммунодиагностика имеет перспективы для выявления туберкулеза в короткие сроки вне зависимости от локализации инфекции и формы заболевания.

About the authors

A V Moskalev

Email: vmeda-nio@mil.ru

V B Sboychakov

Email: vmeda-nio@mil.ru

A V Apchel

Email: vmeda-nio@mil.ru

V N Cygan

Email: vmeda-nio@mil.ru

References

Supplementary files