The use of efferent therapy techniques in the complex treatment of patients suffering from chronic Epstein – Barr virus infection

Full Text

Введение. Хронические вирусные инфекции приводят к циркуляции вируса в периферической крови в течение длительного периода времени с неблагоприятными последствиями, ослабляющими иммунную систему. Одним из подходов к решению этой проблемы является поиск новых адсорбентов для связывания и удаления вирусных частиц из крови. Современные сорбционные технологии определяют возможности для снижения риска заражения различными вирусными агентами. Однако ни одна из используемых в настоящее время методик сорбционного афереза не инактивирует все типы вирусных патогенов. Включение сорбционных методик афереза с целью обеспечения вирусной безопасности является неотъемлемой частью процесса производства биологических препаратов, полученных из плазмы. Наиболее перспективной методикой удаления вирусов является плазмосорбция [5]. За последние 15 лет были разработаны и внедрены эффективные методики инактивации вирусных агентов и усовершенствованы технологии производства [6]. В результате риск передачи вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусов гепатита B (ВГВ) и C (ВГС) от любых продуктов, полученных из плазмы, изготовленных в соответствии с современными процедурами, практически исключен. Сохраняется остаточный риск передачи менее патогенных вирусов, в частности вируса гепатита A (ВГА) и парвовируса B19 (B19) [21]. Одним из новых подходов является фильтрация растворов плазмопротеинов через коммерчески доступные мембраны, способные удерживать вирусы на основе просеивающего механизма. Большинство этих мембран являются многослойными, характери- зуются средним размером пор в несколько нанометров (от 15 до 75 нм) и специально предназначены для удаления вирусов главным образом с помощью просеивающего механизма, поэтому технология называется нанофильтрацией (НФ), что отличает данную процедуру от других методик фильтрации с использованием мембран с большим размером пор, не предназначенных для удаления вирусов [7]. Фильтрацию невозможно проводить, если присутствуют белки, размер которых сопоставим или больше, чем вирусы или поры фильтра.

В промышленном масштабе НФ плазменных продуктов была внедрена в начале 1990-х годов для повышения вирусной безопасности продукта. НФ получила очень быстрое признание и распространение, так как это относительно простой производственный этап, который заключается в фильтрации белкового раствора через мембраны с очень маленьким размером пор (обычно 15–40 нм) в условиях, которые удерживают вирусы с помощью механизма, в значительной степени основанного на исключении размера. В настоящее время НФ является надежным способом уменьшения вирусных заболеваний, который может применяться практически ко всем плазменным продуктам, позволяющим эффективно удалять вирусы с оболочкой и без оболочки в условиях восстановления 90–95% активного белка. На рынке имеется четыре типа мембранных устройств для удаления вирусов. Эффективность удаления вируса и проницаемости белка зависит в большой степени от структуры мембран.

Фильтры фирмы «Vall Pall Ultipor» (Соединенные штаты Америки (США)) класса DV50 и DV20 представляют собой гидрофильные модифицированные PVDF микропористые плиссированные мембраны, которые работают в режиме прямой фильтрации потока, их производит фирма «Pall Corporation» (США). DV50 может удалять более 6 log вирусов размером более 50 нм. Было продемонстрировано 5-кратное снижение ВГВ и 2-3-кратное снижение ВГС. Показано, что фильтр пригоден для фильтрации растворов иммуноглобулина G и альбумина с выходом более 95% [5, 9, 20]. Фильтр DV20 может удалить более 3 logs вирусов размером более 20 нм [23]. Использование фильтра с размером пор 35 нм или 15 нм приводит к удалению как вирусов с оболочкой (ВИЧ и вирус псевдобешенства), так и вирусов без оболочки (ВГА и парвовирус). Апробация нанофильтрационных мембран фирмы «Planovace» (США) с размером пор 15 нм и 35 нм показала, что мембраны удаляли 6–7 log10 фокусообразующих очагов мышиного ксенотропного ретровируса, обезьяньего вируса и вируса псевдобешенства [18].

Проведение фильтрации с использованием фильтра BMM-15 уменьшает содержание парвовируса B19 более чем на 6 log10 [1]. Однако из белковых препаратов с высокой молекулярной массой, таких как иммуноглобулин G, трудно удалить небольшие вирусы, так как размер белка подобен размеру вирусов. Чтобы отделить вирусы от этих белков с помощью НФ, необходимо изменить размер одного из них. При агрегации человеческого парвовируса B19 в 0,3 М растворе глицина вирусная нагрузка снижается до 1:10 (7,5) (7,5-log) путем НФ с помощью фильтра с размером пор 35 нм. Точно так же B19 снижается при суспензировании в растворах других аминокислот. То есть вирусы в присутствии определенных видов аминокислот могут быть агрегированы и эффективно удалены с помощью фильтра, размер пор которого больше размера вирусов. Этот эффект также был подтвержден с другими небольшими вирусами человеческого энцефаломиокардита и свиного парвовируса [26].

Исследование продуктов иммуноглобулинов проводят с помощью НФ с использованием мембран «Planova» с контролируемым размером пор для удаления вируса. Для этих исследований очищенные препараты иммуноглобулинов (Ig) G и M проверяли с нанофильтрационными мембранами «Planovace» с диаметром пор 15 нм и 35 нм соответственно. Результаты исследований с четырьмя модельными вирусами показали, что мембраны «Planova» 15 и 35 нм удаляли 6–7 log10 бляшек или очагов, формирующих единицы мышиного ксенотропного ретровируса, обезьяньего вируса 40 и вируса псевдобешенства. Мембрана «Planova» 15 нм удаляла полиовирус. Эксперименты по НФ проводились с концентрациями белка до 12 мг/мл для Ig G и 1–2 мг/мл для Ig M, при этом отмечалось превосходное извлечение белка.

Механизм просеивания особенно эффективен для вирусов, размер которых превышает средний размер пор мембраны. При меньшем или близком к среднему размере пор на степень удаления могут влиять такие факторы, как состояние агрегации вируса, образование комплекса с антителами, содержание белка в растворе и адсорбция вирусов на поверхности мембраны, обусловленная эффектом заряда. В отличие от методик вирусной инактивации, которые убивают вирусы, но оставляют вирусные маркеры, такие как антигены и нуклеиновые кислоты с белковой смесью, НФ может полностью удалять эти маркеры.

На сегодняшний день не существует другой методики, подобной НФ с использованием мембран с маленьким размером пор, способной обеспечить степень уменьшения количества вирусов с оболочкой и без оболочки.

Учитывая эффективность данной методики в инактивации вирусных агентов, мы предположили, что ее применение можно использовать в лечении пациентов, страдающих хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна – Барр.

Цель исследования. Оценка клинико-лабораторных эффектов курсового применения плазмообмена и плазмосорбции (ПО+ПС) с использованием лейкоцитарных фильтров для свежезамороженной или нативной плазмы в комплексном лечении пациентов, страдающих хронической вирусной Эпштейн – Барр инфекцией.

Материалы и методы. Обследованы 29 пациентов, страдающих хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна – Барр (ХВЭБИ). Средний возраст пациентов составлял 35,57±1,41 года. Женщин было 16, мужчин – 13 человек. Средняя длительность ХВЭ- БИ от момента появления у пациентов первых жалоб до момента лабораторного подтверждения ХВЭБИ и постановки диагноза составила 2,25±0,18 года. У всех пациентов отсутствовали какие-либо иммунологические нарушения или другие инфекции, которые могли бы объяснить наличие жалоб на момент начала исследования, а также сопутствующая хроническая патология, заболевания печени или почек, которые могли повлиять на результаты исследования. В исследование не были включены пациенты, которые за последние 3 месяца получали противовирусную или иммуномодулирующую терапию.

Клинические методики исследования включали в себя сбор анамнеза, данные о ранее проводимой противовирусной терапии, наличии сопутствующих заболеваний. Клиническое состояние пациентов оценивалось по общепринятой методике, включающей объективные данные и жалобы пациента на момент осмотра. Клинический осмотр включал оценку местных признаков воспаления (наличие и степень гиперемии слизистой оболочки задней стенки глотки, миндалин, наличие слизисто-гнойных налетов, фолликулов на задней стенке глотки и отечности язычка), оценку состояния всех групп периферических лимфатических узлов и измерение температуры тела. Регистрация жалоб пациента проводилась с использованием 3-балльной шкалы субъективной оценки (0 – отсутствие симптомов, 1 – слабая выраженность симптомов, 2 – умеренная выраженность симптомов, 3 – значительная выраженность симптомов). Аллергологическое обследование пациентов включало сбор аллергологического, фармакологического и пищевого анамнезов, исследование специфических иммуноглобулинов Е на аллергены. Пациенты с выявленным аллергологическим анамнезом в исследование не включались.

Ранее все обследуемые пациенты по назначению врача или самостоятельно (часто неоднократно) получали терапию препаратами группы ациклических естественных нуклеозидов, ацикловиром или валтрексом короткими курсами (7–10 дней). Выраженного клинико-лабораторного эффекта от проводимой ранее терапии у пациентов не было. Именно поэтому всем больным был проведен курс эфферентной терапии, который включал 5 процедур ПО+ПС на аппарате «Haemоnetics PCS-2» (США) с использованием лейкоцитарных фильтров для свежезамороженной или нативной плазмы типа LPS2KLE фирмы «PALL GmbH» (Великобритания). Фильтры разработаны для профилактики трансфузионной передачи цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции.

При выполнении процедуры ПО+ПС были учтены технические характеристики фильтров данного типа и их механизм фильтрации, включающий механический, адгезивный и адсорбционный путь элиминации вирусных частиц из нативной плазмы. При проведении процедуры ПО+ПС использовались аппарат фирмы «Haemоnetics PCS-2» (США), контейнер для сбора плазмы (удвоенный типа КП 692-2 500/500 мл), колокол центрифужный, магистраль для сбора плазмы, цитрат натрия 4% – 250 мл, устройство для удаления лейкоцитов из эритроцитной массы и цельной консервированной крови ПК 02-01, лейкоцитарный фильтр для свежезамороженной или нативной плазмы LPS2KLE фирмы «PALL GmbH» (Великобритания).

Предоперационная подготовка включала гемодилюцию с применением 0,9% раствора натрия хлорида в объеме 400 мл, системную гепаринизацию из расчета 70–100 Ед гепарина/кг массы тела, забор крови во время процедуры и элиминации плазмы со скоростью 60–80 мл/мин, скорость возврата составляла 55–75 мл/мин (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема процедуры плазмообмена

 

С учетом технических характеристик данного типа фильтра дополнительного оборудования для возврата аутоплазмы не требовалось. Аутоплазма возвращалась самотеком после переворачивания пакета и установки в штатив аппарата одновременно с циклом реинфузии клеточной массы (рис. 2).

 

Рис. 2. Схема процедуры плазмосорбции

 

Временной интервал на элиминацию и возврат 250–300 мл плазмы за цикл составил 15–25 мин. Общее время проведения операции с учетом предоперационной гемодилюции, времени проведения самой операции и послеоперационной заместительной терапии составило от 3,5 до 5 ч.

С учетом производительности данного типа фильтров в зависимости от массы тела пациента и объема циркулирующей плазмы (ОЦП) в процессе операции проводилась замена адаптивного фильтра к устройству для удаления лейкоцитов из эритроцитарной массы ПК 02-01 (производительность лейкоцитарных фильтров для свежезамороженной или нативной плазмы LPS2KLE составляет 1600 мл за процедуру). Таким образом, во время операции ПО+ПС обработке подвергалось от 2100 до 3200 мл аутоплазмы (100–120% ОЦП). Расход антикоагулянта (4% цитрат натрия) в среднем составлял от 150–200 мл.

Данная методика позволяет проводить процедуры сорбционного афереза в условиях дневного стационара в амбулаторном режиме и имеет следующие преимущества:

1) операции ПО+ПС проводятся по одноигольной схеме подключения (контуру), что не требует дополнительной венепункции;

2) фильтрующий элемент не требует предварительной подготовки (увлажнения), фильтр заполняется путем стерильного удаления воздуха из системы через специальный воздушный фильтр;

3) отсутствует необходимость дополнительного оборудования (насоса для возврата аутоплазмы);

4) имеется специальный коннектор с интегрированным фильтром для стерильного подсоединения, обеспечивающего сохранение «закрытой системы»;

5) отсутствует необходимость послеоперационной заместительной терапии коллоидными и плазмозамещающими растворами и донорской свежезамороженной плазмой;

6) при необходимости возможно завершение операции в комбинированном виде в сочетании с операциями плазмафереза (ПФ), малообъемного ПФ, а также экстракорпорального введения противовирусных и иммунопрепаратов;

7) отсутствуют противопоказания для проведения послеоперационной фармакотерапии по рекомендациям профильных специалистов.

С целью подтверждения вирусной этиологии заболевания у пациентов проводилось выявление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вируса путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах слюны с учетом того, что при хронических формах инфекции исследование ПЦР в образцах крови не дает положительного результата.

Количественное определение ДНК вируса Эпштейна – Барр (ВЭБ) в образцах слюны проводили используя ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Для этого использовали тест-системы «Ампли Сенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL», разработанные Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии (Россия). Единицы измерения, используемые для оценки вирусной нагрузки при экстракции ДНК из слюны, – количество копий ДНК ВЭБ на мл образца (КПДНК). Этот показатель рассчитывается по формуле из инструкции к набору: КПДНК=КДНК×100 (копий/ мл), где КДНК – количество копий ДНК ВЭБ в пробе ДНК. Аналитическая чувствительность тест-системы составляет 400 копий/мл.

Количественное определение антител класса Ig G к ядерному антигену вируса Эпштейна – Барр (аntibodies to Epstein – Barr Virus Nuclear Antigen – anti-EBNA-1 Ig G) проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Euroimmun» (Германия) согласно инструкции фирмы-производителя. Поскольку в настоящее время не существует международного стандарта (референтной сыворотки с антителами EBNA-1), набор откалиброван в относительных единицах (оЕд/мл). Тест-системы сохраняют линейность в интервале измерения 12–126 оЕд/мл. Аналитическая чувствительность тест-систем – 0,9 оЕд/мл. При концентрации антител в исследуемой сыворотке более 200 оЕд/мл проводилось повторное исследование с дополнительным разведением образца.

Количественное определение антител класса Ig G к капсидному белку вируса Эпштейна – Барр (аnti-Epstein – Barr viral capsid antigens – anti-VCA Ig G) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «Euroimmun» (Германия) согласно инструкции фирмы-производителя. Поскольку в настоящее время не существует международного стандарта (референт- ной сыворотки с anti-EBNA-1), набор откалиброван в относительных единицах оЕд/мл. Линейность тест-систем сохраняется в интервале измерения 2–200 оЕд/мл. Аналитическая чувствительность тест-систем – 1 оЕд/мл. При концентрации антител в исследуемой сыворотке более 200 оЕд/мл проводилось повторное исследование с дополнительным разведением образца.

Для оценки эффектов проводимого лечения через месяц после окончания курса терапии был проведен анализ динамики количества ДНК ВЭБ в образцах слюны и клинических жалоб в обеих группах.

Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью статистического пакета программного обеспечения IBM SPSS Statistics, версия 26. Групповые результаты представлены в виде средней ± стандартная ошибка от средней (М±Standard Error). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (метод Пирсона) и непараметрических (метод Спирмена, тау(τ) Кендалла) критериев. Критический уровень значимости различия показателей принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение. Из анамнеза известно, что у 18 (62,06%) пациентов в детстве было неоднократное обострение хронического тонзиллита, 10 (34,48%) пациентов перенесли острый инфекционный мононуклеоз, 15 (51,72%) – жаловались на частые острые респираторные вирусные инфекции (от 6 до 10 раз в год), 22 (75,86%) – связывали появление клинических жалоб с длительным стрессом. У 19 (67,85%) пациентов выявлена патология желудочно-кишечного тракта (хронический гастродуоденит и холецистит, синдром раздраженного кишечника).

До начала терапии колебания количества копий ДНК ВЭБ на мл образца слюны в группе пациентов, страдающих ХВЭБИ (29 пациентов), составили от 1×103 до 9,68×105 копий. Через 10 дней количество копий ДНК ВЭБ в группе пациентов, получавших ПО+ПС, уменьшилось на 314160,33 (табл. 1).

 

Таблица 1. Динамика количества копий ДНК ВЭБ через 10 дней после окончания курса ПО+ПС у пациентов, страдающих ХВЭБИ

Количество копий/мл		р-
до терапии	после терапии
327483,33±87070,83 (n-29) 95% CI: 193613,07 - 537417,37	13323,00±3789,96 (n-16) 95% CI: 6563,77 - 20632,43 У 13 (44,83%) пациентов - 0,00 копий	0,001

 

Однако исходное количество копий ДНК ВЭБ в 1 мл слюны до проведения курса ПО+ПС у пациентов было различное. Поэтому был проведен анализ динамики количества копий ДНК ВЭБ в зависимости от исходного уровня. Пациенты были разделены на три группы. 1-я группа – 20 пациентов с количество копий 105, 2-я группа – 6 пациентов с количество копий 104 и 3-я группа – 3 пациента с количеством копий 103.

Установлено, что при исходно высоком содержании количества копий ДНК (1-я и 2-я группы) отрицательный результат ПЦР в образцах слюны был получен у 50% пациентов, а у 50% пациентов было обнаружено достоверное снижение количества копий ДНК. При низком количестве копий ДНК ВЭБ отмечалась тенденция к увеличению содержания количества копий ДНК после проведения курса ПО+ПС (табл. 2).

 

Таблица 2. Динамика количества копий ДНК ВЭБ через 10 дней после окончания курса ПО+ПС у пациентов, страдающих ХВЭБИ, в зависимости от исходного уровня количества копий ДНК ВЭБ

Группа	Количество копий/мл		р=
	до терапии	после терапии
1-я	335490,00±42337,1 (n=20) Ме=282500,00 95% CI: 257076,35 - 419486,02	12879,00±4675,49 (n=10) Ме=1040,00 95% CI: 4503,53 - 22640,89 У 10 (50%) пациентов - 0 копий	0,0001
2-я	39116,67±9242,55 (n=6) Ме=28900 95% CI: 24300 - 58781,64	17016,67±9066,67 (n=3) Ме=8000 95% CI: 2666,67 - 35183,33 У 3 (50%) пациентов - 0 копий	0,025
3-я	2600±1135,23 (n=3) Ме=2610,00 95% CI: 1000 - 5400	3870±1976,54 Ме=2610 95% CI: 400 - 8600	0,367

 

Далее был проведен анализ динамики уровня антител IgG EBNA-1 и IgG VCA после проведения курса ПО+ПС. Выявлено, что достоверное снижение уровня IgG VCA отмечается после курса ПО+ПС (табл. 3).

 

Таблица 3. Динамика уровня антител IgG EBNA-1 и IgG VCA через 10 дней после окончания курса ПО+ПС у пациентов, страдающих ХВЭБИ

Показатель	Уровень антител		р=
	до терапии, ЕД/мл	после терапии, ЕД/мл
IgG EBNA-1	163,74±39,35 95% CI: 91,29 - 207,66	135,23±29,06 95% CI: 114,79 - 211,30	0,401
IgG VCA	316,56±110,96 95% CI: 187,10 - 523,45	128,67±33,94 95% CI: 91,31 -162,8	0,028

 

Через 10 дней после курса ПО+ПС у пациентов достоверно уменьшились жалобы на субфебрильную температуру, боли в горле и суставах, озноб, потливость и проявления стоматита. Остальные жалобы имели тенденцию к уменьшению проявлений. Все пациенты отмечали выраженное улучшение общесоматического состояния после окончания курса (табл. 4).

 

Таблица 4. Частота клинических жалоб у пациентов до начала терапии и через 10 дней после ее окончания, %

Жалобы	До проведения курса ПО+ПС	После про­ведения курса ПО+ПС	р=
Субфебрильная температура	71,4	35,7	0,009
Лимфаденит	57,14	35,7	0,062
Боли в горле	85,71	57,14	0,001
Слабость	92,86	71,42	0,052
Озноб	75,00	28,57	0,001
Потливость	92,85	60,71	0,001
Стекание слизи	64,28	42,86	0,058
Стоматит	39,28	21,43	0,005
Боли в суставах	57,14	25,00	0,011
Раздражительность и плаксивость	85,71	67,86	0,057
Высыпания на коже	46,43	32,14	0,054

 

Таким образом, нами показано, что свободные вирионы ВЭБ элиминируются в общей группе ХВЭБИ только у 44,83% пациентов. Но процент элиминации зависит от исходного количества копий ДНК ВЭБ до начала курса ПО+ПС. Терапия одинаково эффективна при количестве копий 104 и 105 (50% и 50% соответственно). У пациентов с низким количеством копий наблюдается обратный эффект, то есть после курса терапии количество копий ДНК ВЭБ имеет тенденцию к увеличению, что подтверждается в реакции ПЦР в образцах слюны. Возможно, это обусловлено выходом свободных вирусных частиц из зон депо за счет диффузии увеличенного объема циркулирующей крови в процессе проведения процедуры ПО+ПС. Учитывая нежелательное проведение более длительного курса (более 5 операций на курс) ПО+ПС у пациентов с исходно низким количеством копий ДНК ВЭБ, целесообразно проведение повторного курса экстракорпоральной терапии после использования противовирусных препаратов. Тем не менее в общей группе пациентов уровень anti-EBNA-1 IgG в сыворотке имеет тенденцию к снижению, а уровень anti-VCA IgG достоверно значимо уменьшается после проведения курса процедур. Содержание общего белка в сыворотке крови до и после курса ПО+ПС достоверно не менялось.

Изначально мы предполагали, что схожесть размера генома ВЭБ и ЦМВ позволит получить аналигичные результаты, то есть приблизительно 100% адсорбцию ВЭБ при использовании LPS2KLE фильтров. Однако полученные результаты исходную предпосылку не подтвердили. Возможно, это обусловлено тем, что геном ВЭБ может интегрироваться в хромосомы человека [13, 14, 17]. Тем не менее, согласно полученным нами данным, проведение курса ПО+ПС можно использовать в качестве дополнительной терапии в сочетании с традиционными противовирусными препаратами, что позволяет повысить эффективность стандартной противовирусной терапии, так как количество вирусных копий будет поддерживаться на стабильно минимальном уровне.

Выводы

1. Курсовое применение ПО+ПС рекомендовано для лечения пациентов, страдающих ХВЭБИ, в качестве дополнительной терапии.
2. Курс ПО+ПС повышает эффективность стандартной противовирусной терапии.

About the authors

I. A. Rakityanskaya

City Polyclinic No. 112

Author for correspondence.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

T. S. Ryabova

City Polyclinic No. 112; S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

U. A. Todzhibaev

City Polyclinic No. 112

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. A. Kalashnikov

A.M. Nikiforov All-Russian Center for Emergency and Radiation Medicine

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. N. Belskich

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mil.ru
Pakistan, St. Petersburg

M. V. Zakharov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. S. Manuilov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. V. Savateev

1477th Naval Clinical Hospital

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files