The effect of ingaron on the dynamics of copies of deoxyribonucleic acid Epstein – Barr virus in saliva samples and on the manifestation of clinical

Full Text

Введение. В середине 80-х годов прошлого века было показано, что у иммунокомпетентных индивидуумов вирус Эпштейна – Барр (ВЭБ) вызывает развитие хронической инфекции, характеризующейся хроническими или рецидивирующими инфекционными мононуклеозоподобными симптомами, которые сохраняются в течение длительного времени, сопровождаются высокой продукцией антител иммуноглобулина (Ig) G к капсидному (VCA) и раннему антигену (EA), а также очень низкой продукцией или отсутствием антител к ядерному антигену (ЕВNА) [19]. Однако у некоторых пациентов могут отсутствовать аномально высокие титры антител, связанные с ВЭБ [9]. В 1983 г. D. Hellman et al. [8] впервые предложили аббревиатуру для этого синдрома «хроническая активная ВЭБ-инфекция» (Chronic Active EBV infection – CAEBV).

Известно, что ВЭБ распространяется через контакт со слюной и проникает через эпителий, который выстилает носоглотку. Кольцо Пирогова – Вальдейера,включающее в себя аденоиды, миндалины и лимфоидную систему, окружающую носоглоточный регион, образует непрерывную структуру, называемую лимфоэпителием [17]. Вирус инфицирует эпителиальные клетки, реплицирует, далее высвобождается с последующим инфицированием покоящихся В-клеток в близлежащих областях посредством активации латентных белков, кодируемых программой роста, в результате клетка становится пролиферирующим лимфобластом (лимфобластный взрыв). Таким образом, В-клетки памяти являются местом длительной вирусной персистенции, где вирус может оставаться в течение всей жизни пациента, потому что формируется иммунологическая память, а вирус перестает быть патогенным для хозяина.

Показано, что уровень инфицированных В-клеток в популяции колеблется от 5 до 3000 в каждых 107 В-клеток памяти как в периферической крови (в среднем 110/107), так и в кольце Пирогова – Вальдейера (среднее значение – 175/107). Таким образом, уровень инфицированных клеток аналогичен в периферической крови и кольце Пирогова – Вальдейера, но в 20 раз ниже, чем в другой лимфоидной ткани [15]. Количество инфицированных В-клеток памяти исчисляется до 104–107 (в среднем 0,5/106), представляя собой небольшой, стабильный и наиболее критически «безопасный» пул инфицированных клеток, который гарантирует длительную персистенцию. В периферической крови находится около 1% этих клеток. Одна латентно инфицированная В-клетка памяти в миндалине может дифференцироваться в плазматическую клетку и посредством литической репликации выделять вирус, который поражает эпителиальные клетки. Вирус постоянно просачивается в полость рта, где в течение примерно 2 мин смешивается со слюной перед актом глотания. Следовательно, полость рта является резервуаром ВЭБ [14].

Реактивация ВЭБ у инфицированного пациента индуцируется либо химическими агентами, либо биологическими стимулами, включая В-клеточно- рецепторное взаимодействие (BCR), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) и гипоксию [10]. C.P. Fagundes et al. [6] показали, что хронический межличностный стресс (тревога, незащищенный тип отношений, беспокойство, отказ, неприятие) оказывает влияние на клеточный иммунитет и может стимулировать реактивацию и репликацию ВЭБ за счет ослабления контроля клеточной иммунной системы за вирусной латентностью через вегетативные и глюкокортикоидные пути. Взаимосвязь со стрессом может быть ключевой психологической особенностью между страданием и реактивацией ВЭБ. При этом лица с повышенной тревожностью имеют высокие уровни IgG VCA ВЭБ, что отражает у них более выраженный иммунный ответ в борьбе с латентным вирусом. Таким образом, впервые была продемонстрирована связь между латентной реактивацией ВЭБ и выраженной принадлежностью к тревожности.

Для хронической ВЭБ-инфекции характерно длительное течение и частые рецидивы с клиническими и лабораторными признаками вирусной активности [12]. Больных беспокоят длительный субфебрилитет (37,1–37,3°С), слабость, немотивируемая утомляемость, повышенная потливость, чувство дискомфорта и/или боли в области горла, лимфаденит, отек слизистой носа с обильным стеканием слизи, стоматит, кожные высыпания, артралгии, боли в мышцах туловища и конечностей, неврологические расстройства (головные боли, нарушения памяти и сна, снижение концентрации внимания, раздражительность, плаксивость, склонность к депрессиям). По данным ультразвукового исследования брюшной полости, у части больных выявляется увеличение селезенки и/или печени, может беспокоить чувство тяжести в правом подреберье. В клиническом анализе крови у больных наблюдается лимфоцитоз и моноцитоз, реже может быть лимфопения и лейкопения, тромбоцитоз.

Интерферон-γ (IFN-γ) является наиболее мощным плейотропным цитокином, продуцируемым многими иммунными клетками в ответ на интерлейкин-12 (IL-12), а также микробные стимулы. Он стимулирует иммунный ответ путем регуляции продукции нескольких цитокинов и хемокинов. Во время вирусной инфекции IFN-γ стимулирует клеточный антивирусный механизм, индуцируя экспрессию нескольких противовирусных белков, а также экспрессию dsRNA-специфической аденозиндезаминазы (ADAR), которая ингибирует репликацию вируса путем редактирования или вызывая нарушение синтеза вирусных белков. IFN-γ может индуцировать апоптоз, регулируя Fas-лиганд (FasL) для устранения вирус-инфицированных клеток. Кроме того, IFN-γ усиливает экспрессию IFN 1-го типа, играет важную роль в передаче противовирусных сигналов от врожденного до адаптивного иммунного ответа с целью активации антивирусного иммунитета.

У больных герпес-вирусной инфекцией при введении рекомбинантного IFN-γ через 3–4 дня после инфицирования происходит уменьшение ВЭБ- индуцированной пролиферации В-клеток и секреции иммуноглобулинов, а эффективность введения IFN- α/β продолжается не более 24 ч. На ранней стадии ВЭБ-инфицированные клетки могут регулироваться всеми IFN, а далее развивается промежуточный период, когда только IFN-γ способен непосредственно влиять на ВЭБ-индуцированный ответ В-клеток. В период третьей фазы В-лимфоциты становятся нечувствительными к прямым воздействиям всех интерферонов и регулируются только цитотоксическими клетками [16]. В 1993 г. были опубликованы положительные результаты лечения тяжелой ВЭБ- инфекции введением рекомбинантного IFN-γ [7]. В 1996 году были опубликованы результаты эффективности терапии рекомбинантным IFN-γ в сочетании с введением иммуноглобулинов и ацикловира у больных с ВЭБ-инфекцией [5].

В Российской Федерации зарегистрирован единственный препарат IFN-γ под торговым названием «Ингарон», разработанный научно-производственным предприятием «Фармаклон» путем микробиологического синтеза в рекомбинантном штамме E. Coli и очищенный колоночной хроматографией. Ингарон состоит из 144 аминокислотных остатков, кроме первых трех из них – Cys-Tyr-Cys, замененных на Met.

Цель исследования. Оценить эффективность терапии ингароном на количества копий дезоксирибонуклеиновой кислоты ВЭБ в образцах слюны и на динамику клинических жалоб через месяц после ее окончания у больных хронической ВЭБИ.

Материалы и методы. Обследованы 60 больных, страдающих хронической ВЭБ-инфекцией. Средний возраст больных составлял 36,54±2,14 лет. Женщин было 38, мужчин – 22 человека. Длительность хронической ВЭБ-инфекции от момента появления первых жалоб у больного до момента лабораторного подтверждения ВЭБ-инфекции и постановки диагноза составила 2,15±0,23 лет. У всех больных отсутствовали какие-либо иммунологические нарушения или другие инфекции, которые могли бы объяснить жалобы на момент начала исследования, а также любые хронические заболевания, которые могли повлиять на результаты исследования. В исследование не были включены больные, которые за последние 3 месяца получали противовирусную или иммуномодулирующую терапию.

Клинические методы исследования включали в себя сбор анамнеза, данные о ранее проводимой противовирусной терапии, наличии сопутствующих заболеваний. Клиническое состояние пациентов оценивалось по общепринятой методике, включающей объективные данные и жалобы пациента на момент осмотра. Регистрация жалоб пациента проводилась с использованием шкалы субъективной оценки по 3-балльной шкале (0 – отсутствие симптомов, 1 – слабая выраженность симптомов, 2 – умеренная выраженность симптомов, 3 – значительная выраженность симптомов).

Все больные были разделены на 2 группы для проведения разных схем терапии. В 1-ю группу вошли 34 больных (от 22 до 52 лет), которые получали терапию ингароном (10 инъекций внутримышечно по 500000 МЕ через день), во 2-ю группу вошли 26 больных (от 19 до 58 лет), получавших пролонгированную терапию синтетическим нуклеозидным аналогом гуанозина – вальцитом по 450 мг 2 раза в день внутрь в течение 2 месяцев в сочетании с ингароном в той же дозировке. Ранее все больные во 2-й группе по назначению врача или самостоятельно (часто неоднократно) получали терапию препаратами группы ациклических естественных нуклеозидов, в том числе валтрексом короткими курсами (7–10 дней). Выраженного клинико-лабораторного эффекта от проводимой ранее терапии валтрексом у больных не было, поэтому им был назначен вальцит в сочетании с ингароном. Для оценки эффективности проводимого лечения через месяц после окончания курса терапии в обеих группах была проанализирована динамика количества копий ДНК ВЭБ в образцах слюны и проявления клинических жалоб. С целью подтверждения вирусной этиологии заболевания у больных проводилось выявление ДНК вируса путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах слюны. Это сделано потому, что при хронических формах инфекции исследование ПЦР в образцах крови не дает положительного результата. Количественное определение ДНК ВЭБ в образцах слюны проводили, используя ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для этого использовали тест-системы, разработанные Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии «АмплиСенс EBV/ CMV/HHV6-скрин-FL» (Россия). Единицы измерения, используемые для оценки вирусной нагрузки при экстракции ДНК из слюны, – количество копий ДНК ВЭБ на мл образца (КПДНК). Этот показатель рассчитывается по формуле из инструкции к набору: КПДНК=КДНК×100 (копий/мл), где КДНК – количество копий ДНК ВЭБ в пробе ДНК. Аналитическая чувствительность тест-системы составляет 400 копий/мл. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью статистического пакета программного обеспечения IBM SPSS Statistics, версия 26. Групповые результаты представлены в виде средней ± стандартная ошибка от средней (М±Standard Error). Обработка результатов проводилась с использованием параметрических (метод Пирсона) и непараметрических (тау (τ) Кендалла) критериев. Критический уровень значимости различия показателей принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение. Из анамнеза известно, что у 39 (65%) больных в детстве было неоднократное обострение хронического тонзиллита, плохо поддающееся терапии антибиотиками; 18 (30%) больных перенесли острый инфекционный мононуклеоз, а 6 (10%) больных страдали обострением хронического ринофарингита. 46 (76,67%) больных жаловались на частые ОРВИ (от 5 до 10 раз в год), 53 (83,33%) больных связывали появление клинических жалоб с длительным стрессом или отмечали после перенесенного стресса.

До начала терапии колебания количества копий ДНК ВЭБ на мл образца слюны у больных в обеих группах хронической ВЭБИ были от 1,24×104 до 9,98×105 копий. Через месяц после окончания противовирусной терапии в 1-й группе отрицательные результаты ПЦР были получены только у 10 (29,41%) больных. Во 2-й группе отрицательный результат ПЦР был получен у 19 (73,07%) больных (табл. 1).

 

Таблица 1. Динамика количества копий ДНК ВЭБ через месяц после окончания противовирусной терапии у больных хронической ВЭБИ

Группа	Количество копий/мл		р=
	до терапии	после терапии
1-я	252453,57±93108,909	11318,42± 3643,75 (у 10 больных - 0,00 копий)	0,001
2-я	311185,71±93754,10	46956,67±45030,14 (у 19 больных - 0,00 копий)	0,006

 

При этом комбинация вальцита и ингарона у больных 2-й группы была различной. Так, 10 больных (2а подгруппа) получали вальцит по 900 мг/сутки (2 мес.) и 10 инъекций ингарона по 500000 МЕ внутримышечно через день; 10 больных (2б подгруппа) получали вальцит по 900 мг/сутки (2 мес.) + ингарон 20 инъекций по 500000 МЕ внутримышечно через день; 6 больных (2в подгруппа) получали вальцит по 900 мг/сутки (2 мес.) + ингарон 10 инъекций по 500000 МЕ и 15 инъекций по 100000 МЕ внутримышечно через день (табл. 2).

 

Таблица 2. Динамика количества копий ДНК ВЭБ через месяц после окончания комбинированной противовирусной терапии вальцитом и ингароном у больных хронической ВЭБИ

Группа	Количество копий/мл
	до терапии	после терапии
2-я общая	425250,00±62697,09	35934,50±33764,56 р=0,0001
2а	204000,00±96215,03	У 6 больных - 0,00 копий; у 4 больных - 4245,56±2,752,64 р=0,07
2б	361733,33±161746,19	У 9 больных - 0,00 копий; у 1 больного - 140 копий;
2в	274533,33±143185,99	У 4 больных - 0,00 копий; у 2 больных -115000,00±112416,48 р=0,027

 

Из данных таблицы 2 видно, что наилучший результат после введения ингарона был получен у 90% больных, получивших 20 инъекций ингарона по 500000 МЕ через день в сочетании с вальцитом (группа 2б). В группах 2а и 2в результаты были практически одинаковыми (60 и 66,67% соответственно). Положительный результат в данной схеме терапии обусловлен двумя моментами: 1) комбинированием вальцита и ингарона; 2) длительностью введения и суммарной дозой ингарона.

Для выявления влияний количества копий ДНК ВЭБ на выраженность клинических жалоб у больных хронической ВЭБИ был проведен корреляционный анализ. Выявлено, что тяжесть заболевания напрямую коррелирует с уровнем количества копий ДНК ВЭБ. Так, жалобы на слабость и боль в горле имеют прямую среднюю и высокую корреляционную взаимосвязь (r=0,553 и r=0,741 соответственно). Жалобы на боль в суставах также имеют среднюю, но отрицательную корреляционную связь (табл. 3).

 

Таблица 3. Влияние количества копий ДНК ВЭБ на выраженность клинических жалоб у больных хронической ВЭБИ

Жалобы	Коэффициент корреляции
Слабость	т=0,473; р=0,026 г=0,553; р=0,026
Боли в горле	т=0,629; р=0,002 г=0,741; р=0,001
Боли в суставах	т= -0,413; р=0,052 г= -0,521; р=0,039

 

Через месяц после окончания проводимой терапии, по сравнению с исходным состоянием, выраженность клинических жалоб у больных обеих групп была достоверно (р=0,001) ниже. При этом выраженность клинических жалоб через месяц после лечения была достоверно (р=0,001) ниже у больных 2-й группы, за исключением субфебрильной температуры и общей слабости (табл. 4).

 

Таблица 4. Частота клинических жалоб у больных обеих групп до начала терапии и через месяц после ее окончания, %

Частота клини­ческих жалоб	1-я группа		2-я группа
	ингарон до терапии	ингарон после терапии	вальцит+ ингарон до терапии	вальцит+ ингарон после терапии
Субфебрильная температура	82,35	29,41 (р=0,001)	86,46	57,69 (р=0,001)
Лимфаденит	70,58	44,11 (р=0,02)	53,84	30,76 (р=0,002)
Боли в горле	91,18	32,35 (р=0,001)	80,76	30,76 (р=0,001)
Слабость	91,18	44,12 (р=0,001)	73,07	53,85 (р=0,005)
Озноб	64,70	44,12 (р=0,001)	69,23	30,76 (р=0,001)
Потливость	85,29	64,70 (р=0,01)	76,92	38,46 (р=0,001)
Стекание слизи	91,18	64,70 (р=0,001)	76,92	30,76 (р=0,001)
Стоматит	47,05	32,35 (р=0,017)	34,61	26,92 (р=0,045)
Боли в суставах	58,82	41,17 (р=0,056)	34,61	23,07 (р=0,01)
Раздражитель­ность и плаксивость	85,29	79,41 (р=0,054)	76,92	46,15 (р=0,001)
Высыпания на коже	52,94	32,35 (р=0,031)	34,61	23,07 (р=0,01)

 

В настоящее время единого подхода в лечении хронической ВЭБ-инфекции нет, несмотря на то, что широко используются ациклические нуклеозиды (ацикловир, валтрекс, фамвир) и синтетический нуклеозидный аналог гуанозина – ганцикловир (цимевен, вальцит). H. Kimura et al. [11] показали, что противовирусная терапия может быть эффективной при лечении хронической ВЭБИ. Однако в многочисленных исследованиях подтверждена неэффективность противовирусной терапии. На фоне противовирусной терапии наблюдается подавление вирусного выброса, но этот эффект прекращается после окончания проведения противовирусной терапии [17], а количество вирус-инфицированных клеток и уровень вирусной нагрузки возвращается к исходным значениям после прекращения терапии [3]. Это объясняется тем, что ВЭБ-тимидинкиназа не фосфорилирует ацикловир и ганцикловир, именно поэтому эти препараты не эффективны при лечении хронической ВЭБ-инфекции [4]. S. Kure et al. [13] показали, что предварительная обработка негативных В-клеточных линий, BJAB и нормальных зрелых В-лимфоцитов в течение 24 ч рекомбинантным (rе) IFN-α и rеIFN-γ подавляет продукцию специфического ядерного антигена ВЭБ (EBNA-1) в клетках BJAB через 24 ч после ВЭБ-инфицирования. Оба типа rеIFN также эффективно ингибируют ВЭБИ в нормальных зрелых В-лимфоцитах, что подтверждается снижением включения [3H] тимидина через 6 дней после ВЭБ-инфицирования и общего количества пролиферирующих клеток через 21 день после инфицирования. При этом rеIFN-α проявляет более выраженный ингибирующий эффект, чем rеIFN-γ. Эти результаты свидетельствуют о том, что rеIFN действуют преимущественно на ранней стадии инфицирования ВЭБ. Нами показано, что ингарон (1-я группа больных) может ингибировать репликацию вируса только у 29,41% больных. При этом у всех больных, принимавших ингарон, через месяц после лечения было получено достоверное уменьшение клинических жалоб.

 Полученные нами результаты подтверждают данные Е.Г. Гайнановой, В.Х. Фазыловой, О.В. Скороходкиной [1] в пользу высокой эффективности ингарона в лечении герпевирусных инфекций. B. Sainz, W.P. Halford [18] показали, что обработка клеток линии Vero IFN-β или IFN-γ ингибирует репликацию вируса простого герпеса (HSV)-1 менее чем в 20 раз, тогда как совместная обработка IFN-β и IFN-γ ингибирует репликацию HSV-1 примерно в 1000 раз. Авторы предположили, что высокий уровень ингибирования, достигаемый введением экзогенного IFN-γ, является результатом синергичного взаимодействия с эндогенными IFN-α/β, которые локально продуцируются в ответ на инфекцию HSV-1. Наши результаты, полученные в условиях in vitro, подтверждают эти данные.

Наилучший клинический результат был получен у больных 2б группы, которые получали 20 инъекций ингарона в сочетании с вальцитом. Именно в этой группе количество копий ДНК ВЭБ в образцах слюны было отрицательным у 90% больных и наблюдалась 100% достоверная положительная динамика уменьшения клинических жалоб. Таким образом, положительный результат данной схемы терапии обусловлен не только комбинацией препаратов, но и суммарной дозой, а также длительностью введения ингарона.

H.L. Weng et al. [20] в 2003 г. провели открытое рандомизированное контролируемое многоцентровое клиническое исследование по изучению антифибротического эффекта rеIFN-γ у 153 пациентов, страдающих хроническим вирусным гепатитом В. rеIFN-γ вводился внутримышечно ежедневно в дозе 1 МЕ в течение трех месяцев и через день в течение шести месяцев. Было выявлено, что rеIFN-γ обладает выраженным антифибротическим эффектом. Эффективность лечения составила 66% в группе пациентов против 16,2% в контрольной группе (136 чел.). Позднее в 2011 г. Y.J. Wu, W.M. Cai, Q. Li [21] опубликовали результаты исследования монотерапии rеIFN-γ у 25 HBsAg-позитивных пациентов с фиброзом 2–4 стадии, получавших длительную терапию rеIFN-γ. Авторы также показали, что длительная (в течение девяти месяцев) терапия приводит к выраженной динамике показателей воспаления и фиброза печеночной ткани. Полученные нами результаты подтверждают наибольшую эффективность ингарона при его длительном применении по сравнению с коротким курсом терапии.

Выводы

1. Ингарон оказывает выраженный противовирусный эффект, подтвержденный уменьшением количества копий ДНК ВЭБ у больных хронической ВЭБИ.
2. У больных хронической ВЭБИ терапия ингароном через месяц после ее окончания приводит к достоверному уменьшению клинических жалоб.
3. У больных хронической ВЭБИ наилучший эффект от терапии ингароном достигается в дозе 500000 МЕ через день при длительном введении (не менее 20 инъекций).
4. Ингарон можно использовать в комбинированной противовирусной терапии в сочетании с вальцитом.

About the authors

I. A. Rakityanskaya

City Polyclinic No. 112

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

T. S. Ryabova

City Polyclinic No. 112; S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

U. A. Todzhibaev

City Polyclinic No. 112

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. A. Kalashnikov

A.M. Nikiforov All-Russian Center for Emergency and Radiation Medicine

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. S. Manuilov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files