Using the Paramecium caudatum test object to determine acute toxicity of physiologically active substances

Abstract


The advantage of biotesting in comparison with the physicochemical analysis of the use of Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. Physical and chemical analysis often fails to detect unstable compounds. In addition, these tools are not possible to determine the ultra-low concentration of chemicals. In addition to the traditional use of laboratory animals, representatives of protozoa have recently been used. In connection with this, a test object of the Sim-plest type was chosen and justified. The advantages of using the simplest compared with the use of laboratory animals. The various models used to test toxic substances are described. Their advantages and disadvantages are noted. The main advantages of second-order models using alternative models (various hydrobionts, bacteria, cell cultures, etc.) are described. The relevance of using the culture of cells of the ciliate Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. The methodological aspects of the biotesting of organic solvents using the proposed test object are presented. A unidirectional change in the toxicometric parameters of organic solvents for two types of biological objects: a white mouse and a culture of infusoria Paramecium caudatum were revealed. The possibility of using Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. A correlation was noted between the indicators of the general toxicity of organic dyes and those of white mice.

Full Text

Введение. Для токсикологической оценки различ- ных физиологически активных веществ (ФАВ) тради- ционно используют лабораторных животных. Однако в числе организмов, на которых проводят биотестиро- вание, наряду с лабораторными животными зачастую присутствуют представители простейших, что тесно связывает токсикологические исследования с микро- биологическими. На сегодняшний день в Российской Федерации разработано около 40 биотестов с исполь- зованием бактерий активного ила, грибов и актиноми- цетов, водорослей, простейших, беспозвоночных и рыб [1, 2, 5]. Наиболее яркими и распространёнными представителями простейших являются одноклеточ- ные организмы из класса инфузорий. Применение инфузорий для проведения биотестирования можно объяснить наиболее быстрым развитием тест-реакции в ответ на воздействие химических веществ. Наступле- ние таких реакций может происходить в диапазоне от нескольких минут до нескольких часов. Применение биотестирования имеет ряд пре- имуществ перед физико-химическим анализом, средствами которого часто не удается обнаружить неустойчивые соединения или количественно определить ультрамалые концентрации химических веществ. Довольно часты случаи, когда выполнен- ный современными средствами химический анализ не показывает наличия токсикантов, тогда как ис- пользование биологических тест-объектов свиде- тельствует об их присутствии в исследуемой среде. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методики обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. Биотести- рование дает возможность быстрого получения ин- тегральной оценки токсичности, что делает весьма привлекательным его применение при скрининговых исследованиях [1, 5, 6, 7]. 110 2 (66) - 2019 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Существующая на сегодняшний день классифи- кация биологических моделей представлена в сле- дующем виде [2]: - модели первого порядка - лабораторные жи- вотные; - модели второго порядка - альтернативные модели (различные гидробионты, бактерии, ферменты, культуры клеток и др.); - модели третьего порядка - математические мо- дели, описывающие биологические процессы. В качестве лабораторных животных используют- ся мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, свиньи, приматы. В редких случаях исследования проводятся на крупном рогатом скоте и экзотиче- ских видах животных. Однако использование био- логических моделей первого порядка сопряжено со значительными финансовыми расходами на закупку и содержание (законность приобретения и создание специализированных помещений), а также с этически- ми принципами проведения исследований. В связи с этим особую значимость приобретают токсикологические исследования с использованием биологических моделей второго порядка. Исследо- вания на биологических моделях второго порядка являются не только доступными для большинства лабораторий, но и относятся к наиболее экономически обоснованным в качестве экспресс-оценки токси- кометрических показателей химических веществ на этапе доклинического изучения. С точки зрения гуман- ности и законности данный способ исследований не имеет отрицательного значения. Цель исследования. Определить острую ток- сичность некоторых органических растворителей с использованием инфузорий Paramecium caudatum в качестве тест-объекта и возможность ее корреляции с аналогичными показателями для белых мышей. Материалы и методы. В опытах в качестве тест- объектов использовали 10-суточную культуру настоя банановой кожуры, содержащую инфузории Para- mecium caudatum и 10 белых мышей массой 16-18 г. Выбор Paramecium caudatum связан с простотой и дешевизной их культивирования, чувствительностью к токсикантам разного рода и быстрым развитием от- ветной реакции (табл. 1). Оценку влияния растворителей на тест-объект проводили в микроаквариумах, в качестве которых использовали иммунологические планшеты с объ- емом ячейки 0,3 мл. Контроль за выживаемостью тест-объектов осуществляли при помощи цифрового микроскопа «Микрон-400» фирмы «Sititek» (рис. 1). Периодическое культивирование инфузорий Parame- cium caudatum осуществляется в чашках Петри. Средой для культивирования служит модифицированная среда Лозино-Лозинского. После культивирования очищали вы- ращенную массу микроорганизмов от посторонних видов и продуктов жизнедеятельности. Для этого использовали разные способы фильтрации и разделения бактерий по разным физическим и биохимическим особенностям. При очистке использовали нормальную физиоло- гическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости (рис. 2). При этом задействовали сосуды с узким длинным горлом, позволяющие сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить их в другой сосуд с минималь- ным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляли чистой средой Лозина-Ло- зинского, опять собирали клетки в верхней зоне и сливали. В результате отмывания инфузорий степень разбавления культуральной жидкости чистой средой была не менее 1:200, что соответствовало рекомен- дациям других исследователей [5]. В 5 ячеек иммунологического планшета помещали питательную среду с тест-объектами в объеме 0,15 мл и при помощи микроскопа визуально определяли на- личие и активность инфузорий. После этого в ячейки добавляли рабочие растворы исследуемых веществ в различных концентрациях в объеме 0,15 мл. Визу- альное наблюдение за тест-объектами осуществляли в течение суток. Определяемым токсикометрическим параметром являлся показатель смертности тест- объекта при воздействии растворителя в заданной концентрации (LC50, мг·л-1). В работе придержива- лись методических рекомендаций по практическому использованию стандартизованных тест- культур [5]. Острое токсическое действие исследуемой пробы определяли по смертности инфузорий за определен- ный период экспозиции. Критерием острой токсично- сти пробы служила гибель 50% и более клеток за 24 ч. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Наиболее распространенные тест-объекты и критерии их выбора Таблица 1 Вид тест-объекта Критерий выбора Вид тест-объекта чувствительность к токси- кантам разного рода простота культивирования и дешевизна использования время развития тест-реакции качество потомства Дафнии + + До 96 ч Отрицательное Половые клетки - - До 7 ч Отрицательное Люминесцентные бактерии - - До 7 ч Отрицательное Инфузории Paramecium caudatum + + От 10 до 15 мин Отрицательное ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (66) - 2019 111 Экспериментальные исследования а б в Рис. 1. Техническая составляющая исследований: а - иммунологический планшет; б - одноканальный дозатор; в - микроскоп «Микрон-400» цифровой Рис. 3. Количественные значения LD для белых мышей Рис. 2. Сосуд с длинным горлом, в котором инфузории и LC для инфузорий. Ряд 1 - LD 50 для белых мышей, ряд переместились в верхние слои жидкости 50 2 - LC для 50 инфузорий В качестве контроля использовали культуральную среду с инфузориями. При этом в контроле гибель особей не превышала 10%. По окончании срока наблюдения регистрировали токсикометрические показатели исследуемых растворов органических растворителей. Заражение белых мышей проводили perosс последующим определением их 50% гибели (LD50, мг·кг-1). Результаты и их обсуждение.Установлено,чтоток- сичность органических растворителей для инфузорий и белых мышей имеет однонаправленное увеличение в ряду: диметилсульфоксид (ДМСО)→ацетон→спирт этиловый→диметилфорамамид (ДМФА) (табл. 2). Так, высокие цифры LD50 для белых мышей (21,18) при тестировании ДМСО соответствуют также высоким цифрам LC50 для инфузорий (43,7), и наоборот: низкий уровень LD50 при исследовании ДМФА соот- ветствует также низкому уровню LC50 для инфузорий, такое соотношение сохраняется для всех тестирован- ных веществ. Корреляция значения LD50 для белых мышей и LC50 для инфузорий наглядно представлена на приведенном ниже графике (рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют об общей направленности изменения токсикометрических пока- зателей органических растворителей для двух видов биологических объектов: белая мышь и инфузории Paramecium caudatum. Это подтверждает выбор и обоснованность предлагаемой нами биомодели для проведения токсикологических исследований. Кроме того, процесс подбора оптимального растворителя Таблица 2 Сравнительная характеристика показателей токсичности органических растворителей для белых мышей и инфузорий Paramecium caudatum Органический растворитель LD50 для белых мышей при внутри- желудочном введении, мг·кг-1 LC для инфузорий, мг·мл-1 50 ДМСО 21,18 43,7 Ацетон 9,3 7,49 Спирт этиловый 8,7 6,4 ДМФА 6,8 4,36 112 2 (66) - 2019 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования для постановки экспериментов на инфузориях может быть упрощен за счет имеющихся баз данных по по- казателям токсичности для лабораторных животных. Гибель клеток инфузорий является наиболее на- дежной реакцией выявления токсических свойств различных веществ. Однако при исследовании низких концентраций токсических веществ могут выявляться и другие тест-функции, такие как скорость размноже- ния, длина свободного пробега, хемотаксис, двига- тельная активность [3, 4, 6, 7]. Изменение подвижно- сти - ориентировочный параметр при оценке токсич- ности, так как на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, следовательно, эта функция незначительно отражает изменения метабо- лизма клетки при его нарушениях токсичными аген- тами. Большей чувствительностью обладает биотест на основе оценки скорости размножения. Выводы Культура клеток инфузории Paramecium caudatum представляет собой адекватный тест-объект для вы- явления острой токсичности веществ, и ее использо- вание возможно для проведения токсикологических исследований. Показатели острой токсичности органических растворителей, выявленные на культуре Paramecium caudatum, в целом коррелируют с аналогичными по- казателями для белых мышей.

References

  1. Виноходов, Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: автореф. дис. … д-ра биол. наук / Д.О. Виноходов. - СПб., 2007. - 45 с.
  2. Красовский, Г.Н. Экстраполяция токсикологических данных с животных на человека / Г.Н. Красовский, Ю.А. Рахманин, Н.А. Егорова. - М.: Медицина, 2009. - 208 с.
  3. Сибагатуллина, А.М. Измерение загрязнённости речной воды (на примере малой реки Малая Кокшага) / А.М. Сибагатуллина, П.М. Мазуркин. - М.: Академия естествознания, 2009. - 71 с.
  4. Субботин, А.М. Исследование физиологических параметров культуры инфузорий Paramecium caudatum при воздействии фильтратов бактериальных культур рода Acinetobacter / А.М. Субботин, Л.Н. Гнатченко, Г.А. Петухова // Вестн. Оренб. гос. ун-та. - 2011. - № 12 (131). - С. 149-150.
  5. Суворова, Т.В. Метод и средства контроля токсичности водных сред по реакции бактерий: автореф. дис.. канд. техн. наук / Т.В. Суворова. - СПб.: СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2004. - 16 с.
  6. Терехова, В.А. Биотест-системы для задач экологического контроля: методические рекомендации по практическому использованию стандартизованных тест-культур / В.А. Терехова [и др.]. - М.: Доброе слово, 2014. - 48 с.
  7. Raoa, J.V. Acute toxicity bioassay using Paramecium caudatum , a key member to study the effects of monocrotophos on swimming behaviour, morphology and reproduction / J.V. Raoa [et al.] // Toxicological & Environmental Chemistry. - 2007. - Volume 89, Issue 2. - Р. 307-317.

Statistics

Views

Abstract - 83

PDF (Russian) - 76

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2019 Andreev V.A., Andreeva E.Y., Erdniyev L.P., Stepanov Y.A., Mikshta A.Y., Mokshanov I.V., Yermolayeva I.A., Stepanova N.V., Apchel V.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies