A comparative evaluation of the effectiveness of aspiration and automatic systems for percutaneous liver biopsy in experimental rats

Abstract


The effectiveness and quality of liver biopsy in rats are applicable to the aspiration and automatic liver biopsy system. Histological examination of 240 biopsy specimens in 100% of cases identified portal tracts. The number of portal tracts to determine the stage of liver fibrosis in rats of the 1st group who underwent liver biopsy was performed using an 18 G aspirating needle from the puncture liver set (Menghini type), which is 4-5, you have the 2nd group, which one-time guillotine soft tissue biopsy with a semi-automatic action of 16G×20 cm, Italy) - 7-8 portal tracts. The average size of the biopsy in the 1st group is 0,5 cm, in the 2nd group - 1 cm. Thus, the automatic biopsy system allows you to get liver tissue in 100% of cases. At the same time, the automatic system eliminates the additional traumatization of experimental animals, as well as minimizes efforts to separate the biopsy material from the organ. In addition, the automated system for liver biopsy allows to evaluate 7-8 portal tracts with a biopsy size of 1 cm, this provides a reliable histological assessment of pathological changes in liver tissue to assess the stage of fibrosis and the activity of the inflammatory process over time.

Full Text

Введение. Формирование фиброза печени яв- ляется типовым патологическим процессом, харак- терным для всех диффузных заболеваний печени. Именно прогрессирование фиброза с исходом в цирроз печени (ЦП) определяет качество жизни и прогноз заболевания. Понимание патогенеза наиболее распространен- ных и актуальных заболеваний печени, в основе диа- гностики которых лежит биопсия, в настоящее время невозможно без экспериментальных исследований. При этом чрезвычайно важно наблюдать морфологи- ческую картину в динамике с целью оценки изменений в ткани печени, полученной при биопсии. Анализ работ в открытом доступе интернет-ресур- сов (PubMed, Google Scholar), посвященных изучению этого направления, показал, что оценка результатов гистологических исследований выполняется только на завершающем этапе эксперимента [7, 9, 13, 14, 16, 17]. К сожалению, с целью получения гистологических образцов экспериментальных животных приходится умерщвлять. В итоге исследователи увеличивают количество животных в экспериментальных группах, а следовательно, и затраты на эксперимент. Результаты исследований посмертных гистологических образцов не всегда отражают объективную гистологическую картину в печени у живых животных. В этой связи применение прижизненной биопсии печени (БП) чрезвычайно важно, так как в этом случае возможны оценка состояния печеночной ткани у од- ного и того же животного в динамике, осуществление гистологического контроля на стадии индукции ЦП, а также оценка эффективности проводимой терапии на протяжении всего эксперимента. Для получения образца ткани печени в экспери- ментальных работах применяются следующие мето- дики: открытая биопсия печени (минилапаротомия), перкутанная пункционная биопсия печени (ПБП). Эти методики имеют как достоинства, так и недостатки. Сторонники открытого доступа вполне справедли- во утверждают, что его применение позволяет визу- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (66) - 2019 133 Экспериментальные исследования ально оценить орган, достоверно точно получить ткань печени, а также исключить вероятность повреждения других органов [11, 15]. Однако при использовании выбранного метода приходится применять антибиоти- ки с целью профилактики воспалительного процесса, в результате чего страдает кишечная микрофлора, что в свою очередь делает невозможным использование этой методики при изучении микробоценоза кишечни- ка на фоне экспериментального цирроза. Кроме того, эта процедура может вызвать значительный стресс у животных и нередко приводит к летальным исходам. Сторонники ПБП придерживаются идеи малой инвазивности этой методики, позволяющей много- кратно её использовать на одном животном [8, 10]. Поскольку манипуляция выполняется вслепую, это не только увеличивает риск развития осложнений вслед- ствие повреждения диафрагмы, желудка и кишечника, но и снижает вероятность получения биоптата печени. По данным G. Drews et al. [10], в 13,5% случаев полу- чение биоптата печени, несмотря на неоднократные попытки, оказалось безуспешным, а в 5,8% случаев пункция печени сопровождалась смертью животного из-за перфорации диафрагмы. I.R. Corbin et al. [8] отмечают, что у 27% лаборатор- ных животных наблюдался летальный исход, причем в 21% случаев - непосредственно от осложнений ПБП. Нами ранее был разработан межреберный до- ступ ПБП, который решил эту проблему и позволил в 100% случаев избежать летальных исходов у экспе- риментальных крыс, при этом манипуляция вызывала определенные проблемы [4]. Во-первых, неизбежно приходилось наносить дополнительную травму живот- ным как во время разреза кожи скальпелем, так и при проколе троакаром мышц с целью обеспечения досту- па для иглы Menghini в брюшную полость. Во-вторых, возникали проблемы при попытке отделить биопсийный материал от органа. Для этого приходилось вы- полнять ряд сложных дополнительных движений иглой Menghini. В этой связи нами была поставлена задача усовершенствовать процедуру забора ткани печени у экспериментальных крыс. Цель исследования. Используя межреберный доступ для пункционной биопсии печени у крыс, срав- нить эффективность и качество получения биоптата печени, применив аспирационную и автоматическую системы для биопсии печени. Материалы и методы. Экспериментальная рабо- та на животных, одобренная независимым этическим комитетом при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (ВМА) (20.06.2017, протокол № 191), была выполнена на базе вивария кафедры военной токсикологии и медицинской защиты ВМА. Содержа- ние и уход за экспериментальными животными осу- ществлялись в соответствии с требованиями закона Российской Федерации «О ветеринарии» № 4979-1 от 14.05.1993 г. [2] и «Рекомендациями комитета по этике проводящим экспертизу в биомедицинских ис- следованиях» [3]. В исследование были включены 60 самцов крыс линии Wistar, массой 250±50 г, у которых индуцировали ЦП. На 60-е сутки эксперимента крысам было пре- кращено введение 50% четыреххлористого углерода (ССl4) и 10% спирта, после чего они методом случай- ной выборки были разделены на 2 группы: 1-я группа состояла из 30 крыс, которым выполнялась ПБП аспирационной иглой размером 18 G из набора для пункции печени (тип Menghini), а 2-я группа включала 30 крыс, которым выполнялась ПБП с использованием автоматической системы (АС), состоящей из специ- альной коаксиальной иглы с троакаром (Disposable Рис. 1. Алгоритм исследования для получения биоптата печени у крыс 134 2 (66) - 2019 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования guillotine needle fop soft tissue biopsy with semiautomatic action 16G20 см, Италия). Алгоритм исследования представлен на рисунке 1. В ходе эксперимента все животные получали стан- дартный корм для грызунов (Nuvilab CR1s Nuvital S.A., Colombo-PR, Бразилия), в состав которого входили 22% белка, 4% жира, 4% сырого волокна, что соответ- ствовало 290 ккал/100 г. Каждое животное получало 12 г корма в течение суток. Длительность индукции ЦП составила 60 суток. Индукция ЦП выполнялась путем внутрибрюшинного введения 50% ССl4 на оливковом масле из расчета 1 мл/кг массы тела животного два раза в неделю с интервалами между инъекциями в 2-3 дня. Всего было сделано 18 инъекций. Для потенцирования на- ступления фибротических изменений в печени жи- вотным давался 10% спирт через поилку в свободном доступе [5]. Биопсия печени выполнялась квалифицированным хирургом. В условиях операционной крысам 1-й и 2-й групп вводился общий анестетик диссоциативного действия zolеtil 100 (по 250 мг тилетамина гидрох- лорида и золепама гидрохлорида) в дозе 20 мг/кг массы тела. После наступления анестезии у живот- ного сбривалась шерсть в области брюшка и грудной клетки справа, после чего осуществлялась фиксация на операционном столе. Операционное поле обрабатывалось антисепти- ческим раствором по Филончикову - Гроссиху [1]. Пальпаторно определялся мечевидный отросток и край правой реберной дуги. При помощи скальпеля с градуированной линейкой откладывался интервал 2 см от нижнего края мечевидного отростка в сторону правой области грудной клетки. Полученная точка D соответствовала месту прикрепления диафрагмы к грудной клетке (рис. 2). Далее крысам 1-й группы выполнялся разрез кожи скальпелем от точки D в сторону реберной дуги по направлению к мечевидному отростку. Затем опре- делялась точка пункции (Р), которая находилась на расстоянии 0,5 см от точки D в сторону края реберной дуги на протяжении разреза и соответствовала меж- реберью VII и VIII ребра (рис. 3). Используя точку Р, мы исключали вероятность повреждения диафрагмы (рис. 4). При помощи троа- кара размером 1,6 мм в сагиттальной плоскости, проходящей через точку Р под углом 45 градусов в направлении к нижнему краю мечевидного отростка, осуществляли прокол на глубину приблизительно 3-5 мм (до ощущения провала в брюшинную полость). Данная манипуляция выполнялась с целью подготовки канала для прохождения по нему пункционной иглы. Точка прокола печени представлена на рисунке 5. После этого троакар извлекался, и использовалась пункционная игла размером 18 G из набора для пункции печени (тип Menghini), которая вводилась в пункцион- ный канал до ощущения провала в брюшную полость. К пункционной игле присоединялся аспирацион- ный шприц, в который предварительно набиралось 5 мл физиологического раствора. Предпосылая иглу перпендикулярно грудной клетке и смещая ее вправо на 10 градусов, осуществлялся прокол капсулы печени на глубину приблизительно 1 см, при этом одновре- менно с проколом выполнялась аспирация поршнем шприца до защелки фиксатора. Рис. 2. Определение точки D (стрелка) Рис. 3. Точка пункции Р (межреберье VII и VIII ребра) Рис. 4. Исключение вероятности повреждения диафрагмы (стрелка) ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (66) - 2019 135 Экспериментальные исследования Рис. 5. Точка прокола печени (стрелка) Рис. 6. Техника отклонения иглы Menghini Рис. 7. Полученный биоптат печени Рис. 8. Техника прокола коаксиальной иглой с троакаром Для отделения биоптата от основной ткани игла без извлечения из печени наклонялась под углом 20-30 градусов к оси прокола по направлению к голове (рис. 6), после этого игла возвращалась в прежнее поло- жение и извлекалась из пункционного канала. Полу- ченный биоптат выдавливался из иглы и помещался в пробирку с 10% формалином (рис. 7). Края раны ушивались с использованием рассасы- вающегося шовного материала, после чего обрабаты- вались 5% спиртовым раствором йода. С целью профилактики кровотечений крысе одно- кратно вводился 0,1 мл 12,5% этамзилата, после чего животное укладывалось животом на предварительно обернутый пеленкой пузырь со льдом на 20-30 минут. На завершающем этапе процедуры животное помеща- лось в чистую клетку. Обработка операционного шва 5% спиртовым раствором йода выполнялась один раз в сутки на протяжении 4 дней. Крысам 2-й группы биопсия выполнялась также через межреберный доступ при этом исключался раз- рез кожи, так как в системе предусмотрен встроенный троакар в просвет коаксиальной иглы. В точке Р осу- ществлялся прокол под прямым вертикальным углом до ощущения провала в брюшную полость (рис. 8). Далее осуществлялся прокол капсулы печени на глубину приблизительно 0,2 см. Заметим, что погру- жать иглу более 0,4 см нецелесообразно по причине того, что во время нажатия на спусковой механизм АС происходит выдвижение троакара из просвета коаксиальной иглы на 1 см, тем самым появляется риск прокола печени насквозь с последующим по- вреждением нижележащих органов. После чего не- обходимо взвести спусковой механизм АС и нажатием на рычаг вырезать биоптат печени. Полученный био- птат помещался в пробирку с формалином (рис. 9). Профилактика кровотечений выполнялась по ранее описанной методике. Всем животным обеих групп было проведено по 4 ПБП. Повторные ПБП выполнялись у каждого из лабораторных животных с недельным интервалом между пункциями. Для объективной оценки результатов использова- лась гистологическая методика. Образцы биоптата Рис. 9. Полученный биоптат печени 136 2 (66) - 2019 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования помещались в раствор 10% нейтрального формали- на, в котором фиксировались в течение 24 ч. После фиксации образцы подвергались дегидратации путем инкубации в изопропиловых спиртах, а затем имби- бировались парафином по общепринятой методике. Из парафиновых блоков с помощью ротационного микротома изготавливались срезы ткани толщиной 4 мкм, которые окрашивались гематоксилином-эози- ном и пикрофуксином по Ван Гизону и заключались в покровные стекла. Изучение гистологических препаратов осущест- влялось с помощью бинокулярного микроскопа в про- ходящем свете при суммарном увеличении Изучение гистологических препаратов осуществлялось с помо- щью бинокулярного микроскопа в проходящем свете при суммарном увеличении ×50, ×100, ×200, ×400. Полуколичественная оценка степени выраженности фиброза определялась по системе Metavir (F0 - отсут- ствие фиброза, F1 - звездчатое расширение порталь- ных трактов без образования септ, F2 - расширение портальных трактов с редкими порто-портальными септами, F3 - множественные порто-центральные септы без цирроза, F4 - цирроз печени) [7]. Результаты и их обсуждение. В обеих группах летальные исходы не зарегистрированы. Эффектив- ность получения биоптата выглядит следующим обра- зом. От крыс обеих групп было получено 240 образцов ткани печени (табл. 1). При гистологическом исследовании 240 биоптатов в 100% случаев определялись портальные тракты (ПТ). Таблица 1 Количество результативных и нерезультативных биопсий в зависимости от системы ПБП Количество ПТ, позволяющих определить стадию фи- броза печени, в 1-й группе составляло 4-5, а во 2-й группе - 7-8. Средний размер биоптата в 1-й группе составил 0,5 см; во 2-й группе - 1 см (табл. 2). Нерепрезентативные биоптаты в группах отсут- ствовали. Репрезентативные гистологические срезы представлены на рисунке 10. Отмечаем, что в экспериментальных исследова- ниях в области гепатологии важно получить биоптат печени, но также не менее важно минимизировать наносимую травму экспериментальным животным. Известно, что любое повреждение запускает ответные реакции в организме, которые в свою очередь влияют на количественные и качественные показатели, по- лученные в результате эксперимента. Учитывая это и опираясь на данные I.R. Corbin et al. [8], G. Drews et al. [10], указывающих, что на фоне развившегося посттравматического стресса отмечалась гибель животных, считаем, что наиболее оптимальным ис- пользовать АС (Disposable guillotine needle fop soft tissue biopsy with semiautomatic action 16G20 см, Италия), поскольку исключаются дополнительные разрезы кожи скальпелем, тем самым уменьшается травматическое повреждение. К достоинствам АС также относятся: во-первых, уменьшение времени на выполнение процедуры за счет сокращения этапов манипуляции; во-вторых, решается проблема, свя- занная с отделение биопсийного материала от органа; в-третьих, возрастает размер получаемого биоптата длиной 1 см с возможностью оценки 7-8 ПТ. Количество ПТ в образцах биопсии имеет важное значение для гистологического анализа. Наши дан- ные о необходимом объеме биоптата совпадают с результатами, полученными I.R. Corbin et al. [8] в том, что, учитывая диффузный характер изучаемых пато- логических изменений для объективной их оценки, достаточно наличия 2-4 ПТ в образце. Однако воз- можность оценки большего количества ПТ позволит исследователю наиболее достоверно оценить выра- женность патологических изменений в печени. Интервал между ПБП должен составлять семь дней, так как восстановление поврежденного участка печени после воздействия иглой Menghini требует этого времени. Исследования, в которых изучены процессы заживления повреждений печени после прокола органа иглой для биопсии, были проведены А. Размер полученных биоптатов печени у крыс обеих групп, см Таблица 2 Показатель Группа Срок получения биоптата Показатель Группа Первая неделя (60-е сутки) Вторая неделя (68-е сутки) Третья неделя (76-е сутки) Четвертая неделя (84-е сутки) Средний размер биоптата печени 1 0,5 0,5 0,7 0,5 Средний размер биоптата печени 2 1 1 1 1 Количество ПТ 1 4-5 4-5 4-5 4-5 Количество ПТ 2 7-8 7-8 7-8 7-8 Нерепрезентативные биоптаты 1 0 0 0 0 Нерепрезентативные биоптаты 2 0 0 0 0 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (66) - 2019 137 Экспериментальные исследования а б в г д е Рис. 10. Типовые патологические изменения в биоптатах печени у одного и того же животного после повторных ПБП: (а, б, в - ув. ×10; г, д, е - ув. ×20) Haraszti et al. [12]. Авторы показали, что повреждения печени иглой Menghini в большей степени разреши- лись через неделю после процедуры. В этой связи важно отметить, что образцы ткани, полученные при многократной ПБП, позволяют оценивать динамику гистологических изменений. Процедура ПБП может быть использована для получения материала не только для гистологического, но и биохимического и молекулярно-генетического анализов. Выводы 1. Использование как аспирационной, так и авто- матической систем для биопсии позволяет получить ткань печени в 100% случаев. 2. Автоматическая система исключает дополни- тельную травматизацию экспериментальных жи- вотных, а также минимизирует усилия на отделение биопсийного материала от органа. 3. Автоматическая система для биопсии печени позволяет оценить 7-8 ПТ при размере биоптата 1 см, это обеспечивает надежную гистологическую оценку патоморфологических изменений ткани печени для оценки стадии фиброза и активности воспалительного процесса в динамике.

References

  1. Зубарев, П.Н. Общая хирургия [Учебник для медицинских вузов] / П.Н. Зубарев [и др.]. - СПб.: СпецЛит, 2011. - 608 с.
  2. О ветеринарии: федер. закон от 14 мая 1993 г. № 4979-1: принят Верхов. Сов. Рос. Федерации 14 мая 1993 г. // Ведомости СНД и ВС РФ. - 1993. - № 24. - С. 857.
  3. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований / ВОЗ. - М., 2000. - 36 с.
  4. Саулевич, А.В. Способ перкутанной аспирационной пункционной биопсии печени у крыс / А.В. Саулевич [и др.] // Заявка на изобретение № 2018109016, Российская Федерация RU 13.03.2018.
  5. Скуратов, А.Г. Тетрахлорметановая модель гепатита и цирроза печени у крыс / А.Г. Скуратов // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2012. - №9. - С. 37-40.
  6. Bedossa, P. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C / P. Bedossa [et al.] // Hepatology. - 1996. - Vol. 24. - P. 289-293.
  7. Chiva, M. Effect of Lactobacillus johnsonii La1 and antioxidants on intestinal flora and bacterial translocation in rats with experi- mental cirrhosis / M. Chiva [et al.] // J. Hepatol. - 2002. - Vol. 37. - P. 456-462.
  8. Corbin, I.R. Serial percutaneous liver biopsies in laboratory rats / I.R. Corbin [et al.] // Dig Dis Sci. - 2003. - Vol. 48. - P. 1939-1943.
  9. D’Argenio, G. Symbiotic formulation in experimentally induced liver fibrosis in rats: intestinal microbiota as a key point to treat liver damage? / G. D’Argenio [et al.] // Liver Int. - 2013. - Vol. 33. - P. 687-697.
  10. Drews, G. Percutaneous liver core biopsy in rats: an alternativ e to minilaparotomy / G. Drews [et al.] // J. Exp Anim Sci. - 2000. - Vol. 41. - P. 115-120.
  11. Garofalo, J.M. Laparotomic Approachfor Collecting Serial Hepatic Biopsies in Rats (Rattus norvegicus) and Mice (Mus musculus) / J.M. Garofalo [et al.] // J. AM Assoc. Lab. Anim. Sci. - 2016. - Vol. 55. - P. 324-330.
  12. Haraszti, A. Healing of the needle-biopsy wound in the liver of the rat / A. Haraszti [et al.] // Acta Hepatogastroenterol (Stuttg). - 1973. - Vol. 20. - P. 290-294.
  13. Hussien, N.I. Protective effect of rimonabant, a cannabinoid receptor 1 antagonist, on nonalcoholic fatty liver disease in a rat model through modulation of the hepatic expression of activin A and follistatin / N.I. Hussien [et al.] // Can. J. Physiol Pharmacol. - 2017. - Vol. 95. - P. 1433-1441.
  14. Pérez-Paramo, M. Effect of propranolol on the factors promoting bacterial translocation in cirrhotic rats with ascites / M. Pérez- Paramo [et al.] // Hepatology. - 2000. - Vol. 31. - P. 43-48.
  15. Rowe, A. Assessment and histological analysis of the IPRL technique for sequential in situ liver biopsy / A. Rowe [et al.] // Comp Hepatol. - 2011. - Vol. 10. - P. 7-14.
  16. Sánchez, E. VSL# 3 probiotic treatment decreases acterial translocation in rats with carbontetrachloride-induced cirrhosis / E. Sánchez [et al.] // Liver Int. - 2015. - Vol. 35. - P. 735-745.
  17. Teltschik, Z. Intestinal bacterial translocation in rats with cirrhosis is related to compromised Paneth cell antimicrobial host defense / Z Teltschik [et al.] // Hepatology. - 2012. - Vol.
  18. - P. 1154-1163.

Statistics

Views

Abstract - 55

PDF (Russian) - 22

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2019 Zhdanov K.V., Saulevich A.V., Karev V.E., Kozlov K.V., Zakharkiv Y.F., Zakharenko S.M., Lyashenko Y.I., Ivanov K.S., Sukachev V.S., Shakhmanov D.M., Popov D.V., Kariakin S.S., Bedarev A.V., Chernenok M.G., Gemst I.I., Tashimov M.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies