Experimental modeling of deforming osteoarthrosis of the knee in small rodents

Full Text

Введение. В конце 20-го столетия активно раз- вивающиеся клеточные технологии подвели иссле- дователей к осознанию возможности компенсации хондральных и остеохондральных дефектов по- средством клеточной терапии и тканевой инжене- рии [24]. Первоначальные попытки в этой области включали восстановление только хрящевой или только костной ткани [22, 23]. В настоящее время уже предлагаются экспериментальные варианты биоинженерных каркасов, заселенных клетками, обладающими возможностью единовременного замещения различных типов тканей [12]. Так, были предложены конструкции со специфической архи- тектурой, способные замещать остеохондральные повреждения, принимая в костных тканях - костный, а в хрящевых - хрящевой фенотип [8, 21]. Подобные инновационные разработки нуждаются в особой те- стовой работе, подразумевающей быструю оценку эффективности применения полученной конструк- ции, а значит, существует необходимость получения экспериментальных животных моделей заболевания, способных выступить тестовой площадкой для тех- нологического процесса. Экспериментальные испытания тканеинженерных конструкций для компенсации хондральных и остео- хондральных дефектов суставов различного характера целесообразно проводить на животной модели за- болевания, позволяющей помимо токсичности самой конструкции наиболее полно оценить эффективность ее применения. Одним из самых распространенных заболеваний сустава является деформирующий остеоартроз (ОА). ОА - это хроническое невоспали- тельное заболевание суставов неизвестной этиоло- гии, имеющее необратимый характер, характеризу- ющееся прогрессирующей дегенерацией суставного хряща, структурными изменениями субхондральной кости и сопутствующим реактивным синовитом [13]. Клиницистами отмечается, что прогрессирование ОА протекает на фоне нарушений региональной гемодина- мики и микроциркуляции с развитием тканевой гипок- сии [13]. Так как трофика суставного хряща, нарушение которой часто является начальной точкой развития ОА, осуществляется диффузным путем из капилляров сино- виальной оболочки и прилежащей кости, во избежание распространения дегенеративного процесса необходи- ма достаточная компрессионная нагрузка на сустав [6, 9]. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 131 Экспериментальные исследования При снижении буферной функции хряща дегене- ративный процесс развивается наиболее интенсивно на участках суставной поверхности, испытывающих относительно большие нагрузки [3, 13]. Прогресси- рование патологического процесса приводит к сни- жению амортизационных способностей хряща и при- лежащих костных структур к динамическим нагрузкам. В субхондральной кости начинают формироваться зоны динамической перегрузки, вызывающие пере- распределительные нарушения микроциркуляции, что способствует возникновению субхондрального остеосклероза, изменению кривизны суставных по- верхностей и образованию краевых костно-хрящевых разрастаний - остеофитов [13, 17]. Следовательно, воссоздание патологического процесса заболевания на экспериментальной модели предполагает нару- шение микроциркуляции на участке с нарушением трофики тканей, формирующих сустав, и нарушением физиологического распределения нагрузки на сустав, вызывающей изменения в анатомо-гистологическом строении хондральных и остеохондральных структур. В это же время анализ многообразия вариантов создания биоинженерных хрящевых тканей для кор- рекции повреждений хряща подводит исследователей к необходимости применения оптимальной модели забо- левания для лабораторных испытаний. Испытания, как правило, проводят на здоровых животных и затрагивают лишь суставные поверхности, в то время как наиболее распространенное заболевание - деформирующий ОА - в наиболее тяжелых случаях, приводит к деформации всей площади сустава и подлежащей кости. Процесс моделирования повреждения суставов, как правило, проводят на крупных животных [6]. Однако многообра- зие вариантов возможной экспериментальной терапии, включающих как клеточные технологии, так и различные варианты биоинженерных конструкций, требуют под- ходящих моделей для экспериментальных имплантаций тканеинженерных систем для быстрой и полной оценки эффективности реорганизации зоны имплантации такой системы in vivo. Использование и содержание крупных животных затратно и требует значительных усилий, в то время как наиболее просты и дешевы в содержании мелкие грызуны. Цель исследования. Создание эксперименталь- ной модели деформирующего остеоартроза коленного сустава на крысах с учетом патогенетической основы заболевания - нарушения трофики нижней конечности и нарушения динамической нагрузки на сустав с целью создания оптимальной модели для будущих пробных имплантаций тканеинженерных конструкций. Материалы и методы. В качестве эксперимен- тальных животных использовали самцов крыс породы «Вистар» (n=14): средний возраст - 4 месяца, средняя масса - около 300 грамм. Содержание и использова- ние животных соответствовало правилам, принятым в учреждении, национальным законам и рекоменда- циям национального совета по исследованиям [15]. За основу создания модели остеоартроза коленного сустава принята модель критической ишемии нижней конечности на крысе, наступающей спустя 20 суток после перевязки бедренной артерии (a. femoralis) [1]. Для снижения трофики хрящевой ткани колен- ного сустава бедренную артерию пересекали после наложения лигатур для нежёсткой иммобилизации сустава использовали гипсовую лонгетную повязку, для жесткой иммобилизации - стержневой аппарат внешней фиксации (АВФ). В качестве контроля ис- пользовали интактных крыс (n=5). Сравнивали срок иммобилизации суставов - 4 недели без периода реабилитации, 4 недели с периодом реабилитации в 2 недели (табл. 1). Оперативное вмешательство проводили при со- блюдении правил асептики и антисептики на левом Таблица 1 Распределение экспериментальных животных по группам Группа Иммобилиза- ция гипсовой лонгетой, пересечение a. femoralis, 4 недели, n=3 Иммобили- зация в АВФ, пересечение a. femoralis, 4 недели, n=3 Иммобили- зация в АВФ, пересечение a. femoralis, 4 не- дели, со сроком реабилитации 2 недели, n=3 Пересечение a. femoralis, 4 недели, n=3 коленном суставе. Пересечение бедренной артерии производили следующим образом: животного вводи- ли в наркоз (золетил 100 фирмы «Virbac» (Франция) - о60 мг/кг), выполняли разрез параллельно и ниже паховой складки в области верхней трети внутренней поверхности бедра. Артерию выделяли с использова- нием операционного микроскопа «MJ 9200 Vet» фир- мы «Meiji Techno» (Япония), на выделенную a. femoralis накладывали двойную лигатуру (Prolene 6/0), затем артерию рассекали между лигатурами поперечно на ¾ для предупреждения потери лигатуры и кровотече- ния. Рану ушивали послойно (Prolene 3/0). Для группы нежесткой иммобилизации непосредственно после операции накладывали гипс (бинт гипсовый клеевой на марлевой основе) на бедро и голень без фиксации голеностопного сустава. Для группы жесткой иммоби- лизации бедренную артерию пересекали описанным выше способом. Затем выполняли боковой разрез в области коленного сустава длиной 20 мм, тупо и остро обнажали метаэпифизы бедренной и большеберцо- вой костей. Визуализировали щель коленного сустава по передней поверхности. При помощи инъекционной иглы делали насечки в области дистального эпифиза бедренной кости, устанавливали по наружной по- верхности 2 стержня диаметром 1,8 мм. В области проксимального метаэпифиза большеберцовой кости по наружной поверхности при помощи инъекционной иглы выполняли насечки и устанавливали 2 стержня. Стержни фиксировали в узле, соединяли между со- бой при помощи шарнира в положении сгибания ко- ленного сустава 90 градусов (рис. 1). Рану послойно ушивали и накладывали асептическую повязку. 132 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования а б в Рис. 1. Этапы операции: а - разрез параллельно и ниже паховой складки в области верхней трети внутренней поверхности бедра крысы, двойная лигатура на a. femoralis; б - боковой разрез в области коленного сустава, установка стержней АВФ в бедренную кость; в - конечность крысы, фиксированная в АВФ Рентгенографические исследования проводили на аппарате «Siemens Multix Pro» в двух стандартных проекциях: переднезадняя (прямая) и боковая. Для оценки местной и общей реакции проопе- рированной конечности за животными установили динамическое наблюдение. Местную реакцию оце- нивали по состоянию операционной раны, цвету кожи конечности, степени выраженности отека (отношение длины окружности поврежденной конечности к здоро- вой на уровне ½ бедра), нарушению функции; общую реакцию - по внешнему виду и поведению животных (состояние волосяного покрова, двигательной актив- ности, приему пищи и воды). Животных выводили из эксперимента летальной дозой наркоза посредством диэтилового эфира. Суставы выделяли, оценивали макроскопически (форма, контур, цвет суставной поверхности, объ- ем эпифизарной части кости). Для исследования в световом микроскопе отбирали прооперированные суставы с захватом 2-3 мм диафиза бедренной и боль- шеберцовой костей, подвергали 3-суточной декаль- цинации раствором «СофтиДек» (Биовитрум), после чего рассекали продольно в саггитальной плоскости, затем производили стандартную гистологическую обработку, окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. Результаты и их обсуждение. В течение на- блюдения за животными в эксперименте отмечено появление спастической походки с характерным подволакиванием прооперированной конечности во всех группах. В момент снятия иммобилизирую- щего устройства (гипсовой повязки или АВФ) у всех животных наблюдалась комбинированная нестойкая контрактура сустава. В группе животных с гипсовой иммобилизацией сустава (гипсовая лонгетная повязка) при макро- скопическом исследовании отмечены истончение хрящевой ткани эпифизов бедренной кости и ис- чезновение нормальной белизны хряща. Суставы не деформированы, подвижны. При микроскопическом исследовании отмечены высокая митотическая активность соединительно- тканных элементов и формирование гипертрофи- ческих экзогенных групп хондроцитов суставной поверхности, что говорит о хорошем кровоснабжении сустава. Выявлена гиперплазия ткани суставных по- верхностей периферических зон за счет разрастания а б Рис. 2. Периферическая часть суставных поверхностей крысы: а - контроль, б - гипсовая иммобилизация, 4 недели, наблюдается разрастание соединительной ткани с периферии суставной поверхности. Окрашивание гематоксилином и эозином, ув. ×5 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 133 Экспериментальные исследования соединительнотканных элементов, в центральной зоне отмечено наличие незначительных истончений с деформированной волнистой поверхностью (рис. 2). Также выявлено снижение высоты хрящевой ткани суставных поверхностей, увеличение толщины кост- ных балок, формирующих эпифизарную часть кости, и увеличение высоты пролиферативной зоны (зона «монетных столбиков» и вакуольных клеток, таблица 2. При рентгенографическом исследовании в группах животных с жесткой иммобилизацией (фиксацией в АВФ) через 4 недели определялись сужение сустав- ной щели, остеопороз дистального метафиза бедра, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, а также наличие краевых остеофитов (рис. 3). Макроскопически на выделенных суставах отмече- ны нарушение физиологического положения сустав- ных поверхностей, увеличение ширины эпифизарной части бедренной и большеберцовой кости, синюшно- красный цвет хряща (рис. 4). При микроскопическом исследовании выявлены массивные повреждения анатомо-гистологического строения суставов. Отмечается формирование круп- ных костно-хрящевых выростов и гипертрофических изменений в хондроцитах на периферических, ранее ненагружаемых участках суставной поверхности, формирующих бугристую поверхность, что является маркерами ОА [15, 20]. Отмечаются множественные хаотичной формы очаги разрастания костно-хря- щевых элементов - окостеневающих хондроцитов и гипертрофических хондроцитов с крупным ободком цитоплазмы и крайне малым количеством внеклеточ- ного матрикса вокруг клеток. Хрящевая ткань ранее нагружаемых поверхностей сустава истощена, отме- чается врастание соединительной ткани в суставную полость с периферической зоны (рис. 5). В части случаев были выявлены очаги нагноения в диафизах костей в месте врезания стержня аппа- рата фиксации, простимулировавшие естественную репарацию этой области с массивным разрастанием соединительной и гипертрофической хрящевой ткани. Отмечены гиперплазия соединительной ткани пери- ферической зоны хряща и нарушение анатомо-гисто- логического строения эпифиза, физиса и метафиза. Также выявлено значительное увеличение толщины костных балок в эпифизарной части, значительное увеличение высоты пролиферативной части эпифиза кости, начало зарастания суставной щели соедини- тельной тканью (см. табл. 2). При двухнедельном сроке реабилитации после демонтажа АВФ в группе животных с жесткой иммо- билизацией АВФ макроскопически суставы соответ- ствовали группе без периода реабилитации. Однако при измерении показателей высоты анатомических зон, выделяемых в суставе, отмечено увеличение вы- соты хрящевой ткани суставной поверхности. Также выявлено разрушение субхондральных структур - врастание соединительной ткани в полость эпифиза и полное заращение суставной щели. При этом отме- чены снижение толщины костных балок эпифизарной части и снижение высоты пролиферативной части до Средние показатели высоты анатомических зон в прооперированных суставах, мкм Таблица 2 Группа животных Высота хрящевой ткани суставной поверхности Толщина костных балок в эпифизарной части кости Высота пролиферативной части метаэпифиза Группа животных бедренной кости большеберцовой кости Толщина костных балок в эпифизарной части кости Высота пролиферативной части метаэпифиза Контроль 494,5 254,10 121,71 296,96 Гипсовая повязка, 4 недели 303,5 223,75 185,44 502,72 АВФ, 4 недели 492,28 242,99 197,5 436,77 АВФ, 4 недели, 2 не- дели реабилитации 510,29 310,58 191,5 266,52 а б в г Рис. 3. Рентгенограммы коленного сустава крысы: а, б - непосредственно после иммобилизации сустава в АВФ; в, г - после демонтажа АВФ, рентгенологические признаки деформирующего артроза 134 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования а б Рис. 4. Продольный разрез декальцинированного сустава крысы, а - контроль, б - жесткая иммобилизация АВФ с двухнедельной реабилитацией, нестойкая контрактура коленного сустава нормы по сравнению с показателями животных группы АВФ без срока реабилитации (см. табл. 2). Таким образом, во всех группах животных вы- явлено нарушение анатомо-гистологического стро- ения сустава, наименее выраженное при гипсовой иммобилизации и наиболее - при иммобилизации сустава в АВФ. Признаки ишемического повреждения сустава после выведения животных из эксперимента отсутствовали. Хотя исследователями отмечается, что структурные нарушения тазобедренных и коленных суставов при ОА связаны с изменениями различных звеньев регионарного кровообращения нижних ко- нечностей (магистральный артериальный кровоток, терминальный артериальный кровоток, система микроциркуляции, венозный отток) [10], митотическая активность соединительнотканных и костно-хрящевых элементов в этом исследовании говорит о хорошем кровоснабжении сустава и быстром формировании сосудистых коллатералей после пересечения бедрен- ной артерии. Дегенеративно-дистрофические процессы в группе нежесткой гипсовой фиксации проявлены в истончении хрящевой ткани суставных поверхностей без выраженного нарушения структуры подлежащих тканей и смещении физиологического положения суставных поверхностей друг относительно друга. В то время как в группе фиксации в АВФ выявлены массивные нарушения анатомо-гистологического строения суставных костей, затрагивающие эпифиз, физис и метафиз костей, формирующих сустав, с отчетливой гипертрофией эпифизарной части, что согласно литературным данным является морфоло- гическим признаком ОА [13]. В принятой классификации Н.С. Косинской [5] выделяется 3 клинико-рентгенологических стадии артроза: 1 стадия - незначительное ограничение движений, неравномерное сужение суставной щели, легкое заострение краев суставных поверхностей (начальные остеофиты); 2 стадия - ограничение подвижности в суставе, грубый хруст при движени- ях, выраженное сужение суставной щели в 2-3 раза по сравнению с нормой, значительные остеофиты, субхондральный остеосклероз; 3 стадия - дефор- мация сустава, ограничения его подвижности, полное отсутствие суставной щели, деформация и уплотнения суставных поверхностей эпифизов, су- ставные «мыши», субхондральные кисты [4]. Помимо остеопороза дистального метафиза бедра, очаго- вого остеосклероза субхондральной зоны и наличия краевых остеофитов во всех случаях иммобилизаа б Рис. 5. Суставные поверхности коленного сустава крысы: а - контрольный сустав, ув. ×5; б - сустав, иммобилизированный в АВФ в течение 4 недель, ув. ×10. Окрашивание по Ван-Гизону ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 135 Экспериментальные исследования ции в АВФ отмечаются участки плотного смыкания суставных поверхностей, а также врастание клеток фибробластной морфологии, предполагающих развитие фиброза на участке, вплоть до тотально- го заращения суставной полости соединительной тканью. В группе животных в АВФ, подвергнутых двухнедельному сроку реабилитации, выявлено дальнейшее развитие дегенеративного процесса, что указывает на необратимый и прогрессирующий характер приобретенной патологии. Это можно объяснить случаями возникновения ОА вслед за прямой одиночной травмой, со временем пере- стающего прогрессировать, если функциональная нагрузка соответствующего сустава оказывается в достаточной степени ограниченной [5]. Таким обра- зом, после демонтажа АВФ увеличение нагрузки на оперированный сустав вызвало усиление ОА. Заме- тим, что при установке стержней АВФ внутрь кости создается дополнительная травмирующая нагрузка, запускающая естественные процессы регенерации, так как именно момент травматизации кости явля- ется спусковым механизмом начала репаративной регенерации костной ткани [2, 19]. В группе живот- ных с АВФ соотношение различных видов тканей в регенерате - костной, оссифицированного хряща и соединительной ткани - было различным в каждом случае. К тому же при наружной фиксации сустава рана в месте врезания стержней АВФ сообщалась с внешней средой, создавая опасность инфици- рования (в 30% случаев в мягких тканях проопери- рованной конечности были сформированы очаги нагноения), что также является стимулом к есте- ственной регенерации [7, 11]. С учетом результатов морфофункциональной оценки прооперированных суставов смещение физиологического положения суставных поверхностей друг относительно друга и вызванное этим перераспределение динамической нагрузки инициировали смену ранее нагружаемых участков суставной поверхности на ненагружаемые, что в свою очередь вызвало деформацию анато- мо-гистологического строения эпифиза, физиса и метафиза формирующих сустав костей [13, 14]. Таким образом, животные с гипсовой иммобили- зацией сустава имеют первую клинико-рентгенологи- ческую стадию артроза, животные с иммобилизацией АВФ - третью стадию [5]. Выводы 1. Ведущая роль в патологическом процессе раз- вития деформирующего остеоартроза коленного сустава принадлежит нарушению физиологического распределения динамической нагрузки на сустав, а наиболее уязвимыми при прогрессировании этого процесса оказываются субхондральные структуры. 2. Дегенеративно-дистрофические изменения, выявленные в группе иммобилизации конечности в АВФ без и со сроком реабилитации, соответствуют 3-й клинико-рентгенологической стадии ОА, в группе гипсовой иммобилизации - 1-й стадии. 3. При помощи жесткой иммобилизации конеч- ности в АВФ у экспериментальных животных удалось получить стойкую деформацию суставов, обуслов- ленную изменениями костных и хрящевых структур, что соответствует 3-й клинико-рентгенологической стадии ОА, делающую ее пригодной для эксперимен- тальных имплантаций костно-хрящевых биоинженер- ных конструкций, предназначенных для компенсации остеохондральных дефектов.

About the authors

M O Sokolova

Email: vmeda-nio@mil.ru

A V Komarov

A A Kokorina

Email: vmeda-nio@mil.ru

D A Shakun

Email: vmeda-nio@mil.ru

References

Supplementary files