Changes in the cerebral cortex and thyroid in the simulation of cerebral hypoperfusion and its combination with physical exercise

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Подавляющее число хронических заболеваний головного мозга тесно связано со снижением гемоперфузии, которая запускает ряд клеточных механизмов: нейродегенерацию [1], некроз и апоптоз нейронов [2], активацию и гибель астроцитов [3] и олигодендроглиоцитов, микроглиальную и астроглиальную активацию, повреждение гемато-энцефалического барьера [4], нарушение гемореологии и гемомикроциркуляции, эндотелиальную дисфункцию, окислительный стресс [5], нейровоспаление, приводящее к снижению когнитивных способностей [6]. Исследования В.Н. Рудакова [7], проведенные в 2020 г., демонстрируют, что совершенствование квалификации сотрудников по мере роста стажа работы ассоциировано с ростом риска церебральной гипоперфузии, что ставит задачу повышения эффективности реабилитационных мероприятий. Неотъемлемым компонентом данных мероприятий является физическая нагрузка.

Цель исследования — анализ компенсаторно-приспособительных реакций интегративных систем моторной коры головного мозга, щитовидной железы и системы крови, при церебральной гипоперфузии и ее сочетания с кратковременной физической нагрузкой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Хроническую гипоперфузию головного мозга моделировали путем перманентной двусторонней окклюзии общих сонных артерий. Исследование проведено на 280 крысах линии Вистар, массой 180–200 г, содержавшихся в группах по 5 особей в стандартных условиях вивария. Животные разделены 3 основные группы: 1-я группа — контрольная (КГ) — интактные крысы. 2-я группа — модель церебральной гипоперфузии (ЦГ) — двусторонняя перевязка общих сонных артерий под общей анестезией золетилом. Данная методика является «золотым стандартом» долговременной церебральной гипоперфузии у животных [4]. 3-я группа — экспериментальная (ЦГ + СП), ее составили животные с моделью церебральной гипоперфузии, которым начиная с 8-го дня после операции и на протяжении дальнейшего исследования, максимум на протяжении 28 дней (до 35 сут. исследования), проводили ежедневное свободное плавание (СП) длительностью 15 мин. Группы формировали с учетом одинаковой представленности животных с разными результатами предварительного поведенческого тестирования. Животных выводили из эксперимента на 1-е, 6-е, 8-е, 14-е, 21-е, 28-е, 35-е, 60-е и 90-е сутки после операции.

Поведенческое тестирование включало в себя расчет интегрального индекса активности (ИИА), по формуле:

ИИА = ГА / ЛП + ЛПц,

где ГА — горизонтальная активность, ЛП — латентный период первого перемещения и ЛПц — латентный период выхода в центр открытого поля. Для оценки состояния когнитивных функций использовался тест «водный лабиринт Морриса» с расчетом индекса когнитивных функций (ИКФ) [8].

Для гистологического и имунногистохимического исследования использовали фронтальные срезы головного мозга и продольные срезы щитовидной железы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином-эозином Майора. Срезы головного мозга добавочно окрашивали по Нисслю и при помощи имуногистохимических методик с целью выявления нейрональной синтазы оксида азота (neuronal nitric oxide synthase — nNOS), нейронального ядерного антигена позитивных нейронов (neuronal nuclear protein — NeuN, он же маркер неповрежденных нейронов), и глиального фибриллярного кислого белка (glial fibrillary acidic protein — GFAP) — маркера астроцитов. Нейрональную NO-синтазу и NeuN выявляли с помощью первичных кроличьих моноклональных антител (ab270958, титр 1:200 и ab177487, титр 1:500). GFAP выявляли с помощью первичных поликлональных кроличьих антител (ab16997, UK, титр 1:200). В качестве хромогена использовали тест-систему DAB (ab64238). Детекцию пероксидазы производили с помощью DAB Substrate Kit (ab64238). Морфометрическое исследование осуществлялось на цифровых изображениях 50 случайно выбранных полей зрения (об. × 40) на каждый срок исследования с использованием программы «ImageJ 1.45s».

Биохимические методики исследования включали в себя спектрофотометрическое определение в плазме крови концентрации активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК), соответствующих концентрации малонового диальдегида (МДА), концентрации нитрит-ионов и цитруллина. Интенсивность окислительного стресса оценивали хемилюминесцентным способом по антиоксидантной активности плазмы крови. Определялись максимальная интенсивность свободно-радикальных процессов за все время измерения; светосумма (содержание радикалов, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления); tgα — параметр, характеризующий активацию антиоксидантной системы.

Материал представлен как среднеарифметическое значение и среднее квадратичное отклонение. Значимость различий измеряемых параметров оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни для двух независимых выборок. Различия выборок считали достоверными при p < 0,05.

Эксперимент одобрен этическим комитетом Ярославского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 24.03.2016) и выполнен в соответствии с рекомендациями по гуманному обращению с животными, используемыми в экспериментальных и других научных целях¹.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По данным поведенческих исследований установлено, что снижение ИИА приходится на 21–35-е сутки (рис. 1, а), также на 21–35-е сутки приходится снижение когнитивных функций животных (рис. 1, b), что согласуется с результатами аналогичных поведенческих тестов [9]. Ежедневное плавание повышает уровень стрессоустойчивости и ИКФ (pис. 1, a, b).

 

Рис. 1. Динамика основных поведенческих и биохимических показателей: а — динамика ИИА; b — динамика ИКФ; c — динамика МДА; d — динамика NO; e — динамика S; f — динамика tgα; * — p < 0,05. Маркировка групп: черная сплошная линия — ЦГ; серая двойная линия — ЦГ + СП

Fig. 1. Dynamics of the main behavioral and biochemical indicators: a — dynamics of IIA; b — dynamics of ICF; c — dynamics of MDA; d — dynamics of NO; e — dynamics of S; f — dynamics of tga; * — p < 0.05. Marking of groups: black solid line — CG ; gray double line — CG + SP

 

Биохимические исследования продемонстрировали, что концентрация МДА в плазме крови формирует два пика, отражающих разрушение липидов клеточных мембран в реакциях оксидантного стресса — на 1-е и 90-е сутки исследования. Воздействие физической нагрузки снижает второй пик (рис. 1, с). Росту МДА предшествует рост оксида азота (NO) плазмы крови — пик приходится на 35-е сутки (рис. 1, d), за которым на 60-е сутки следует рост светосуммы (S), характеризующей количество образовавшихся перекисных радикалов (рис. 1, е). Физическая нагрузка нивелирует рост концентрации оксида азота на 35-е сутки (рис. 1, d), что ассоциировано с уменьшением интенсивности нарастания S на 60-е и 90-е сутки и достоверным снижением концентрации МДА плазмы крови (рис. 1, e). При этом значения tgα в группах варьировал в течение всего срока наблюдения: снижение к 6-м суткам наблюдения, с последующем увеличением вплоть до 90-х суток исследования (рис. 1, f).

Морфометрия микропрепаратов головного мозга демонстрирует постоянное снижение числа неповрежденных нейронов, наиболее интенсивное на 1-е и 8-е сутки, в дальнейшем снижение стабилизируется. Синхронно растет доля нейронов с двумя и более ядрышками, демонстрируя увеличение функциональной активности выживших нейронов (рис. 2, а, b).

 

Рис. 2. Динамика основных морфометрических показателей коры больших полушарий головного мозга: a — численная плотность ядросодержащих нейронов без необратимых изменений; b — доля нейронов c 2 ядрышками; с — численная плотность GFAP позитивных клеток в 1 мм²; d — численная плотность макроглии на 1 мм² среза; e — cреднее расстояние между ядрами нейрона и сателлита; f — численная плотность nNOS-позитивных клеток; * — p < 0,05. Маркировка групп: черная сплошная линия или столбик с черной заливкой — ЦГ; серая двойная линия или столбик с белой заливкой — ЦГ + СП

Fig. 2. Dynamics of the main morphometric indicators of the cerebral cortex: a — numerical density of nucleated neurons without irreversible changes; b — proportion of neurons with 2 nucleoli; c — numerical density of GFAP positive cells in 1 mm²; d — numerical density of macroglia per 1 mm² slice; e — average distance between the nuclei of a neuron and a satellite; f — numerical density of nNOS-positive cells; * — p < 0.05. Marking of groups: black solid line or column with a black fill — CG; gray double line or column with a white fill — CG + SP

 

Физическая нагрузка обладает двойным эффектом: тормозит убыль нейронов и стимулирует рост доли нейронов с двумя и более ядрышками. Также физическая нагрузка способствует росту числа астроцитов (рис. 2, с). Однако общая численная плотность макроглии на 1 мм² среза на 90-е сутки в группе ЦГ + СП снижается (рис. 2, d), что позволяет предположить уменьшение численной плотности олигодендроглиоцитов. Нейроглиальный индекс (соотношение числа глиоцитов к числу нейронов на срезе), постоянно растущий по мере развития церебральной гипоперфузиии, при этом также снижается. Тесное взаимодействие сателлита с перикарионом, погружение в цитоплазму нейрона и сближение ядер этих клеток, призвано обеспечить рост площади нейроглиального соприкосновения для улучшения трофики нейрона [10]. В группе ЦГ отмечалась тенденция к формированию более плотных нейроглиальных взаимоотношений, которая нарушалась на 8-е и 28–35-е сутки исследования, но влияние физической нагрузки сглаживало эти изменения (рис. 2, d). Также на 28-е сутки отмечался рост числа глиоцитов в непосредственной близости от гемокапилляра. В этом интервале 21–35-х суток отмечается рост численной плотности nNOS-позитивных клеток в группе с ежедневной физической нагрузкой (рис. 2, f).

Эти изменения ассоциированы с ростом численной плотности NeuN-позитивных клеток на 35-е сутки, появлением телец Ронкорони [11], выравниванием кровоснабжения в коре группы экспериментальных животных, что может отражать нейропротекторное действие физической нагрузки. Кроме того, именно с этого времени, по данным E. Farkas, P.G.M. Luiten, F. Bari [12], начинается медленное частичное восстановление кровотока в церебральной коре. Также выявлено снижение количества GFAP-позитивных клеток по сравнению с показателями интактных животных (рис. 2, с).

Морфометрия срезов щитовидной железы демонстрирует снижение средней высоты тироцитов фолликулов под влиянием церебральной гипоперфузии на протяжении 2 нед. от начала эксперимента в обеих группах (рис. 3, а). В дальнейшем отмечается ее рост, более интенсивный в группе ЦГ + СП. 35-е сутки — это срок с максимальными показателями высоты тиреоидного эпителия в этой группе, в дальнейшем высота снижается ниже показателей КГ. В последней рост этого показателя происходит более равномерно, достигая максимальных значений к 90-м суткам исследования.

 

Рис. 3. Динамика основных морфометрических показателей щитовидной железы: а — средняя высота тиреоидного эпителия фолликулов; b — средний диаметр фолликулов; с — средняя площадь островков интерфолликулярного эпителия; d — удельный вес перифолликулярных гемокапилляров на срезе; * — p < 0,05. Маркировка групп: черная сплошная линия — ЦГ, серая двойная линия — ЦГ+ СП

Fig. 3. Dynamics of the main morphometric parameters of the thyroid gland: a — average height of the thyroid epithelium of the follicles; b — average diameter of the follicles; c — average area of the islets of the interfollicular epithelium; d — specific gravity of the peripheral hemocapillaries on the slice; * — p < 0.05. Marking groups: black solid line — CG, gray double line — CG + SP

 

Рост высоты тироцитов в КГ на 21-е, 28-е и 35-е сутки сопровождается ростом среднего диаметра фолликула. Поскольку последний включает в себя также размеры коллоида, можно предположить, что происходит рассогласование между уровнем активации фолликулов и эффективностью их гормонсинтетических процессов. В группе ЦГ + СП в эти сроки выявлено уменьшение среднего диаметра фолликула (рис. 3, b), что может свидетельствовать о большей эффективности тиреоидсинтетических процессов при воздействии физической нагрузки.

Удельный вес перифолликулярных гемокапилляров на срезе нарастает по мере увеличения срока эксперимента, вероятно, отражая развитие венозной гиперемии при гипоперфузии (рис. 3, с). Рост этого показателя при комбинации с физической нагрузкой более интенсивный на 35-е и 60-е сутки. Средняя площадь островка интерфолликулярного эпителия при церебральной гипоперфузии возрастает и превышает аналогичный показатель в группе ЦГ + СП. Учитывая нейропротекторную роль тиреоидных гормонов при ишемических инсультах, это можно интерпретировать как саногенетический эффект.

Выявленное нами снижение числа астроцитов в комплексе с прогрессирующим снижением числа неповрежденнных нейронов, особенно на поздних сроках исследования, может быть следствием роста пироптоза [13]. Это подтверждается наблюдаемым нами нейропротекторным эффектом физической нагрузки, поскольку недавние исследования M.X. Liu, L. Luo, J.H. Fu et al. [14] демонстрируют, что последний осуществляется в рамках реперфузионного повреждения, вызванного ростом свободных радикалов, которое, по данным E. Farkas, P.G.M. Luiten, F. Bari [12], характерно для поздних сроков используемой нами модели церебральной гипоперфузии и обусловлено развитием анастомозов.

По данным V. Chrishtop, V. Nikonorova, A. Gutsalova et al. [4], церебральная гипоперфузия и физическая нагрузка имеют несколько сопряженных механизмов. Нейрональная NO-синтаза играет важную роль в обучении, формировании памяти и синаптической пластичности, ее активность также опосредует восприимчивость индивида к стрессу [15]. С активностью локальной NO-ергической системы коры головного мозга тесно сопряжена выраженность оксидантного стресса, состояние оксидантной и противооксидантной систем крови [16]. Вторым важным компонентном нейроглиального ансамбля можно считать астроциты. В норме и при церебральной гипоксии астроциты обеспечивают трофическую функцию, нейроваскулярное ремоделирование и модуляцию, участвуют в нервной пластичности. На организменном уровне оказывают существенное влияние на работу нейрональных сетей и когнитивную функцию животных, выявляемую в водном лабиринте Морриса [17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Межорганные перестройки при церебральной гипоперфузии характеризуются общей стадийностью. Период альтерации (1–8-е сутки): гипотиреоидное состояние и гибель клеток коры, преимущественно нейронов. Период стабилизации, регуляции адаптогенеза (2–3-я недели): переход в эутиреоидное состояние, с десквамацией тироцитов, снижение функциональной активности нейронов, активация астроцитов. Развитие неполной адаптации (4–5-я недели): сопровождается приближением нейронов к сосудам гемоциркуляторного русла и погружением сателлитов в цитоплазму нейронов. Отмечается мозаичность кровенаполнения сосудов головного мозга и щитовидной железы. Период дезадаптации (3 мес.): развиваются дегенеративные изменения клеток коры и снижение численной плотности нейронов и GFAP-IR-клеток, гипертиреоидное состояние щитовидной железы. Физическая нагрузка при церебральной гипоперфузии обладает нейропротекторным эффектом, замедляет прогрессирование гипоксических и нейродегенеративных изменений, снижает концентрацию нитритов и МДА крови, количество nNOS-IR-нейронов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Вклад каждого автора: И.В. Гайворонский — разработка общей концепции, дизайн исследования; В.В. Криштоп — анализ данных; В.Г. Никонорова — сбор материала; А.А. Семенов — написание статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

The contribution of each author: I.V. Gaivoronsky — development of a general concept, research design; V.V. Kryshtop — data analysis; V.G. Nikonorova — collection of material; A.A. Semenov — writing an article.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

 

¹ Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

About the authors

Ivan V. Gaivoronskii

Kirov Military Medical Academy; Saint Petersburg State University

Email: i.v.gaivoronsky@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7232-6419
SPIN-code: 1898-3355
ResearcherId: А-6482-2016

MD, Dr. Sci. (Med.), professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Vladimir V. Chrishtop

State Scientific Research Test Institute of Military Medicine of the Ministry of Defence of Russia

Email: chrishtop@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9267-5800
SPIN-code: 3734-5479
Scopus Author ID: 57207690596
ResearcherId: J-3456-2017

MD, Cand. Sci. (Med.), principal scientist

Russian Federation, Saint Petersburg

Varvara G. Nikonorova

State Scientific Research Test Institute of Military Medicine of the Ministry of Defence of Russia

Email: bgnikon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9453-4262
SPIN-code: 2161-4838
Scopus Author ID: 57217099371
ResearcherId: AAI-7758-2020

junior researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksei A. Semenov

Kirov Military Medical Academy; Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: semfeodosia82@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1977-7536
SPIN-code: 1147-3072
ResearcherId: IAP-1241-2023

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

References

Supplementary files