New approaches to the selection of genetic markers associated with multifactorial phenotypic traits

Full Text

Конец XX в. и начало нового тысячелетия ознаменовались бурным развитием молекулярной биологии, важнейшие достижения которой нашли практическую реализацию во многих областях клинической медицины. Были созданы предпосылки для перехода к новой модели здравоохранения – так называемой 5П-медицине (предиктивная, персонализированная, превентивная, партисипаторная и позитивная) [5, 19]. Ее целью является выявление факторов риска, определение предрасположенности пациента к тем или иным болезням и их предотвращение. Поэтому модели, предсказывающие риск развития заболеваний, вызывают у исследователей все больший интерес [10].

Большинство сложных фенотипических признаков (особенностей), в том числе и заболеваний, не подчиняются закономерностям менделевского наследования, а имеют многофакторную природу, то есть существенный вклад в их развитие вносит генетическая составляющая в сочетании с влиянием факторов внешней среды. В популяции эти факторы распределяются и комбинируются случайным образом, действуя аддитивно: их суммарный эффект равен сумме эффектов каждого из них в отдельности [1, 3, 4]. Заболевания с наследственной компонентой характеризуются большим числом клинических вариантов, образующих ряд переходных состояний: от минимальных стёртых форм до тяжёлых проявлений.

В формировании наследственной предрасположенности участвует не один, а множество генов, исторически получивших название генов-кандидатов или генов предрасположенности [3, 7, 15]. Число генов-кандидатов, взаимодействующих между собой и индивидуальным геномным «контекстом», формируют так называемую «генную сеть», тем самым влияют на формирование многофакторного признака и могут исчисляться десятками и сотнями. При этом на данный момент ни для одного мультифакторного признака (заболевания) не удалось определить исчерпывающий перечень вариантов генов. В большинстве современных исследований подчеркивается, что генов (вариантов), объясняющих значительное количество фенотипических отклонений, в популяции просто не существует [8, 14, 27, 28].

Более того, полиморфные варианты, имеющие достоверную ассоциацию с признаком, диффузно располагаются в любых, в том числе и малоизученных участках генома, а не непосредственно в белоккодирующих участках-экзонах, как считалось ранее. Например, B. Border et al. [11] показали, что приблизительно 1% полиморфных вариантов шизофрений находится в экзонах, остальные же наиболее ассоциированные варианты располагаются в некодирующих частях генома. Из этого следует, что секвенирование экзона не может быть использовано для проведения генетико-эпидемиологических исследований.

Большинство знаний о полиморфизме популяций и вариабельности генома были получены в результате реализации таких масштабных международных проектов, как «Геном человека», «HapMap» и «1000 геномов». Значительное удешевление технологии высокопроизводительного секвенирования (next generation sequencing) позволило многим странам создать собственные национальные проекты геномной медицины и проводить дополнительные популяционные генетические исследования на огромных выборках более 1 млн человек (Соединенные Штаты Америки, Великобритания, Китайская Народная Республика и Саудовская Аравия). Было установлено, что однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism – SNP) является наиболее частой причиной существования нескольких вариантов (аллелей) одного гена. В общем контексте с SNP часто рассматривают и небольшие вставки или делеции участков геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) [10]. Считается, что геномы двух неродственных индивидов различаются в среднем по одному нуклеотиду из каждой тысячи.

В текущей версии базы данных dbSNP (build 153), аккумулирующей информацию об однонуклеотидной вариабельности геномов, представлена информация о более чем 690 тысячах валидированных SNP в геноме человека. Открытие структуры индивидуальной вариабельности человеческого генома позволило использовать его в популяционной и эволюционной генетике, генетическом картировании болезней [9].

Значительные перспективы получили исследования, направленные на выявление ассоциации полиморфной генетической компоненты с индивидуальной предрасположенностью к заболеваниям, устойчивостью организма к воздействию факторов окружающей среды, определенным метаболическим профилем индивидуума, функциями высшей нервной деятельности и многими другими. Чаще всего это исследования, построенные на сравнении частот встречаемости SNP, предположительно ассоциированных с изучаемым признаком, в группе индивидуумов, демонстрирующих признак в сравнении с контрольной группой (ассоциативное исследование случай/контроль) [10].

Бурное развитие ассоциативных исследований в последние годы привело к накоплению значительного количества данных о полиморфных аллелях, показывающих различную степень доказательной связи с фенотипическими особенностями человека. Это связано с ускорением и удешевлением процедуры полногеномного скрининга индивидуальных генетических полиморфизмов. Данный факт диктует необходимость систематизации этих сведений.

Для решения большинства задач репликативных исследований с уникальной выборкой испытуемых на практике чаще всего используется точечное генотипирование SNP с ограниченным количеством маркеров в диагностической панели. Исследователю важно определить количество генетических маркеров, которое необходимо использовать при разработке тест-систем для определения индивидуальной̆ предрасположенности к развитию многофакторной фенотипической особенности. Применение всех маркеров, ассоциированных с многофакторным заболеванием или признаком, неминуемо приведет к увеличению стоимости тест-системы и снижению ее специфичности. Напротив, исследование малого количества используемых маркеров отрицательно сказывается на чувствительности и уменьшает прогностические свойства набора.

Поэтому при планировании исследований рисков развития мультифакториальных заболеваний и признаков важное значение имеет разработка критериев отбора достоверных и информативных полиморфных локусов.

В настоящее время стратегия анализа генетической предрасположенности подразумевает существование нескольких подходов к отбору молекулярных маркеров.

Задолго до начала эры масштабных геномных исследований и изучения функциональных полиморфизмов в свете формирования наследственной предрасположенности генетические исследования основывались преимущественно на генеалогическом и эпидемиологическом подходах [19]. В дальнейшем эти подходы стали исходной точкой для таких методик генетического картирования сложных наследуемых признаков, как анализ сцепления, анализ ассоциаций в популяциях и семьях, методика идентичных по происхождению аллелей (параметрический метод), анализ неравновесия по сцеплению и анализ экспериментов по скрещиванию модельных организмов. Анализ сцепления, основанный на проверке конкретной модели наследования болезни в родословных, выявление генов, ассоциированных с определенными фенотипическими признаками, и создание мутантных генетических линий, проходивших параллельно с изучением структурной организации хромосом, явились основой для построения цитогенетических карт генов [26].

Несмотря на очевидные преимущества данных методик в выявлении и картировании признаков с традиционным менделевским типом наследования, они оказались малоэффективными при выявлении причинно-следственных связей для сложных многофакторных фенотипических особенностей [24].

На смену пришел новый подход к анализу генетической предрасположенности, основанный на понимании роли белкового продукта в этиологии, патогенезе заболевания и молекулярных механизмов формирования признака, получивший название «генкандидат». Гены-кандидаты в исследование отбирают исходя из априорного знания биологического функционального воздействия гена на признак.

Подход «ген-кандидат» позволяет сфокусироваться на одном или нескольких полиморфных вариантах в области гена (аллельный вариант), продукт которого, вероятно, вовлечен в развитие болезни или признака. Генетический маркер считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, нежели в контрольной выборке. Стандартное исследование проводится на группах из нескольких сотен больных и здоровых индивидов. Выполняют анализ распределения аллелей и генотипов исследуемого генетического маркера в выборке из неродственных здоровых лиц (популяционный контроль) и в группе больных (группа «случай») с тем, чтобы выявить значимые различия в частоте генетического маркера. Генетический маркер считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, нежели в контрольной выборке [4].

Например, однм из первых успешных исследований, использующих ген-кандидатный подход, стало обнаружение мутации в некодирующей области APOC3 (ген аполипопротеина C3), которая связана с более высоким риском гипертриглицеридемии и атеросклероза [29]. Для многих распространенных признаков и заболеваний с наследственной предрасположенностью, таких как индивидуальные физические и психологические особенности организма, метаболизм, транспорт лекарственных препаратов, гипертоническая болезнь, бронхиальная астма, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, по функциональному признаку были определены включающие аллельные варианты «наборы генов», ассоциированных с риском развития многофакторных фенотипических особенностей.

Несмотря на то, что «генные панели» широко используются в современной клинической лабораторной диагностике, данный подход не лишен существенных методологических недостатков. Подход «ген-кандидат» подразумевает наличие небольшого количества генов, оказывающих сильное влияние на формирование признака, в то время как современные исследования убедительно доказывают несостоятельность этой гипотезы.

Например, несмотря на признание факта полигенной природы многофакторных заболеваний, ряд исследователей продолжали настаивать на предположении о том, что шизофрения предопределяется несколькими или даже 1 полиморфным геном [22].

Также часть ассоциаций, полученных в исследованиях с использованием «кандидатного» подхода, могут оказаться ложными за счет малочисленности выборки, этнической неоднородности группы, некорректности клинических критериев отбора при формировании групп «случай/контроль» или неправильном представлении об этиопатогенезе заболевания, то есть выраженной гетерогенности по негенетическим факторам риска.

В итоге нередко возникали ситуации с «плавающими» оценками генетических маркеров, иными словами – ассоциации ранее выявленных «аллелей риска» пересматривались в результатах более поздних исследований. Например, недавнее исследование не смогло подтвердить достоверность ассоциативных связей с депрессией для 18 ранее хорошо изученных генов-кандидатов, несмотря на значительно больший объем выборки [11]. Данные факты заставляют многие научные коллективы пересматривать систематизированные ранее результаты исследований. Например, Национальный институт психического здоровья США, признавая актуальность изучения геномных аспектов поведения, в 2017 г. удалил ссылки на конкретные гены, подчеркнув при этом необходимость повышения надежности данных ассоциативных исследований.

Удешевление процедуры полногеномного скрининга с использованием ДНК-микрочипов сверхвысокой плотности сделало доступным другой подход для поиска генетических предрасположенностей – полногеномный поиск ассоциаций (Genome – wide Association Studies – GWAS). Уже сейчас данный подход использует недоступные ранее для генетического исследования выборки в несколько сотен тысяч или даже миллионов человек при отсутствии сведений о функции и расположении связанных с болезнью генов на хромосоме. В каждом индивидуальном геноме анализируются миллионы полиморфных генетических маркеров – SNP. Постоянно увеличивающиеся объемы выборки значительно повышают достоверность генетической ассоциации. Например, в исследовании диабета второго типа, проводимом Оксфордским университетом, участвовало более 800 тысяч человек [21].

Полногеномный поиск ассоциаций устанавливает корреляцию конкретного варианта генома, характеризующегося уникальным набором SNP, с наличием какого-то заболевания или признака. GWAS основывается на анализе частоты встречаемости SNP: если при генотипировании внутри выборки некоторые полиморфные варианты встречаются у людей с исследуемым фенотипом значимо чаще, чем другие, именно их можно условно признать «ответственными» за проявление этого фенотипа. Таким образом, главные критерии применимости GWAS — наличие репрезентативной выборки (как правило, с большим количеством участников) и, конечно, сама возможность выявить связь (ассоциацию) между генотипом и фенотипом.

Первый в истории результативный GWAS был проведен сотрудниками лаборатории статистической генетики Рокфеллеровского университета в 2005 г. на выборке из 96 пациентов с возрастной макулярной дегенерацией и 50 здоровых людей контрольной группы. Сравнение их геномов выявило два ассоциативных SNP [18]. Эти SNP были локализованы в гене, кодирующем фактор комплемента H, что было неожиданным открытием в исследовании возрастной макулярной дегенерации. Результаты этого анализа привели к дальнейшим функциональным исследованиям в направлении терапевтических манипуляций с системой комплемента [16].

Дальнейшие масштабные исследования были продолжены в рамках консорциума Wellcome trust case control consortium (WTCCC). Исследование включало геномный скрининг 14000 случаев таких распространенных многофакторных заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, диабет 1-го и 2-го типов, ревматоидный артрит, болезнь Крона, биполярное расстройство и гипертоническая болезнь. В 2007 г. в журнале «Nature» были опубликованы результаты анализа молекулярных механизмов развития этих заболеваний, выявлен факт наличия общих полимофных генов и метаболических путей [14].

Количество и масштаб выполненных GWAS каждый год прогрессивно увеличивается, поэтому удобно пользоваться представленными в открытом доступе агрегаторами данных, систематизирующими и каталогизирующими результаты большинства полногеномных исследований ассоциаций, такими как Phe GenI, GWAS Central, GWAS Catalog и др. В данных каталогах для каждого исследованного полиморфного генетического маркера отдельно рассчитываются статистические параметры, характеризующие степень достоверности его ассоциации с многофакторным признаком. В большинстве случаев это отношение шансов (ОШ), относительный риск (ОР), бета-коэффициент или частоты аллелей среди больных и здоровых [6]. Показатели ОШ и ОР имеют схожий смысл в исследованиях типа «случай/контроль», позволяют определить степень влияния полиморфного аллеля на изучаемый признак и показывают, во сколько раз увеличивается или уменьшается вероятность быть здоровым (больным) при носительстве вариантного аллеля. Часто дополнительно определяют чувствительность, специфичность и диагностическую валидность ассоциативных маркеров [2].

Параметром, определяющим достоверность полученных различий между исследуемыми группами людей с многофакторным признаком и без него, является p-уровень значимости (р-value). Достоверно ассоциированными в GWAS-исследованиях необходимо считать те генетические маркеры, ассоциация которых достигла полногеномной значимости (p<5∙10–8) и была подтверждена на независимой выборке, то есть чем ниже данный показатель, тем достовернее ассоциация SNP с фенотипическим признаком (более мягкие критерии допускают использование значения p меньше, чем 10–5, для установления номинальной значимости) [25].

Для визуализации данных, полученных в GWAS, часто используют так называемые манхэттенские графики (рис. 1), где степень ассоциации отображается как отрицательный логарифм р-значения в зависимости от локуса, то есть геномных координат SNP [17].

 

Рис. 1. Манхэттенский график EY, где каждая из точек представляет собой SNP. Ось Х – расположение SNP в геноме, ось Y – уровень ассоциации каждого SNP (чем сильнее ассоциация с признаком, тем ниже ее p-значение, а значит, выше отрицательный логарифм этого значения и соответствующий «столбец»). На графике представлены SNP из GWAS 2013 г. и 74 недавно обнаруженных локуса (помечены красными крестиками), связанных с обучением [23]

 

Вместе с тем, несмотря на громкие заявления о завершении эры изучения «генов-кандидатов» [15], ряд исследователей подвергает GWAS-подход критике. Основной ошибкой признается тот факт, что обнаружение ассоциации еще не означает прямой каузальной связи с ожидаемым событием. Более того, даже если такого рода ассоциации и имеются, мы пока не можем объяснить, как индивидуальный геномный контекст и негенные факторы (образ жизни и факторы окружающей среды) изменяют соотношение рисков формирования сложных признаков.

Вклад конкретного генетического варианта часто является косвенным. Например, полиморфизм может влиять на работу регуляторного комплекса, связанного с сотней генов, а некоторые из них уже могут быть непосредственно связаны с заболеванием или признаком. Исходя из этого, E.A. Boyle et al. [12] предлагают признать, что в реальности все влияет на все, и перейти от концепции «мультигенных» признаков к «всегенной» концепции для интерпретации уже собранных данных. Необходимо сосредоточиться на анализе внутриклеточных регуляторных сетей, а не проводить новые, еще более масштабные исследования. Только так, по их мнению, можно понять, почему вариант X ассоциирован с признаком Y, и сделать практические выводы.

К некорректному поиску ассоциаций могут приводить не недостатки методики, а такие типичные ошибки планирования исследования, как отсутствие однородной выборки или четких критериев для определения изучаемой фенотипической особенности.

С другой стороны, именно активное внедрение полногеномного скрининга ассоциаций в последние годы позволило убедительно подчеркнуть полигенность многофакторных фенотипических особенностей, диффузность распределения полиморфных генетических локусов по всему геному и практически полное отсутствие SNP, оказывающих сильное влияние на развитие признака. Основная концепция традиционного «ген-кандидатного» подхода также вынужденно корректируется, поскольку данные GWAS указывают на то, что в белок-кодирующих участках генома-экзонах локализуется минимальное количество полиморфных вариантов, а чаще всего их расположение фиксируют в межгенных пространствах, интронах, untranslated region, некопирующих рибонуклеиновых кислоахт и прочих относительно плохо изученных областях генома.

Эти факты в совокупности поставили под сомнение результаты многих ранее проведенных ассоциативных исследований, а результаты некоторых из них были признаны ложноположительными [11, 15]. Это объясняет причину изменения подхода к оценке новых и ранее полученных данных, а также пересмотр результатов многих экспериментов по поиску ассоциаций.

Учитывая вышеописанные особенности GWASисследований, можно рекомендовать к использованию следующие критерии отбора генетических маркеров [30]:

– необходимо учитывать только генетические маркеры с достоверностью ассоциации p<5∙10–8 и ниже;

– обнаруженные ассоциации должны быть подтверждены минимум в 2 независимых GWAS исследованиях, либо дополнительных метаанализах высокого уровня;

– при исследовании одного маркера в нескольких GWAS предпочтение следует отдавать более поздним анализам ассоциаций, включавшим большее количество участников;

– размеры выборки участников исследования должны быть достаточно велики для возможности обнаружения ассоциации генетических маркеров с определенными частотами встречаемости;

– однородная выборка должна иметь четкие фенотипические критерии.

Постоянное увеличение объемов выборки и открытие новых молекулярно-генетических маркеров с различной локализацией в геноме позволит сделать GWAS более надежными и улучшить прогностическую ценность оценки риска развития заболевания с генетической предрасположенностью.

В целом следует признать, что, несмотря на наличие некоторых недостатков, модель полногеномного поиска ассоциаций на данный момент признана многими авторами как наиболее достоверно обосновывающая молекулярные механизмы формирования мультифакторных фенотипических особенностей и перспективна для выявления новых ассоциативных генетических маркеров.

Для анализа ассоциативной связи с многофакторными ассоциативными особенностями необходимо применить комплексный подход к выбору ограниченного набора полиморфных генетических локусов. Это позволит учитывать функциональную роль полиморфизмов, которая важна для проработки потенциальной терапевтической стратегии и перспективности новых маркеров в сочетании с высоким уровнем статистической значимости предоставленных GWASподходом.

При отборе полиморфных локусов для проведения ассоциативных исследований предлагается сфокусироваться на изучении молекулярных механизмов формирования многофакторной фенотипической особенности (рис. 2).

 

Рис. 2. Алгоритм изучения молекулярного механизма формирования многофакторного признака

 

На первом этапе поиска необходимо проанализировать биохимические процессы, происходящие на различных уровнях, включая внутриклеточные и межклеточные сигнальные каскады. Эту информацию можно получить в современных литературных источниках, руководствах и открытых онлайнбазах данных, таких как KEGGPATHWAY или Reactome Pathway и др. В результате анализа необходимо сформировать список генов, вовлеченных в процесс формирования признака. Одновременно с изучением молекулярных механизмов рекомендуется провести анализ фенотипических особенностей изучаемого признака, что позволит провести поиск в каталогах признаков, ранее изученных в различных GWAS. Дополнительное направление поиска дает возможность формировать запросы вне функциональной/генной составляющей.

На втором этапе гены и фенотипические признаки из списка необходимо проанализировать в нескольких независимых онлайн-агрегаторах GWASисследований. После получения уникальных идентификационных номеров маркеров (rs в dbSNP) и данных по достоверности ассоциации и силе эффекта необходимо дополнительно актуализировать эти сведения по ссылкам на литературные источники. Если ассоциация полиморфизма с фенотипическим признаком достоверно достигла уровня полногеномной значимости p<5∙10–8, то такой маркер можно признать перспективным к включению в список приоритетных для исследования вариантов. В случае, если достоверность ассоциативной связи полиморфного локуса превысила уровень номинальной значимости p<5∙10–5, но не достигла уровня p<5∙10–8, возможен альтернативный поиск взаимосвязи в метаанализах высокого уровня. Согласно результатам метаанализа, генетический маркер возможно признать перспективным вариантом для исследования. При отсутствии ассоциации полиморфизма с многофакторной фенотипической особенностью по данным GWAS-исследований и метаанализам маркер не следует использовать при проведении репликативных исследований.

Таким образом, предлагаемый алгоритм позволяет учитывать как маркеры, отобранные на основе априорного предположения о функциональной значимости «гена-кандидата», так и поиск ассоциаций с изучаемым признаком по всему геному на основании GWAS-исследований.

В целом существует несколько подходов к дизайну ограниченного набора полиморфных маркеров для точечного генотипирования. Селекцию отдельных ДНК-маркеров осуществляют на основе либо их статистически значимой ассоциации с изучаемым многофакторным признаком, либо функциональной значимости для реализации этой особенности.

Учитывая описанные преимущества и недостатки обеих стратегий, предлагаем объединить их в комплексный алгоритм. Представленная последовательность действий позволит учитывать как маркеры, отобранные на основе априорного предположения о функциональной значимости гена-кандидата, так и поиск ассоциаций с изучаемым признаком на основании данных GWAS. Данный подход позволит оптимизировать диагностическую эффективность создаваемого тест-набора.

Современные молекулярно-генетические исследования характеризуют значительные массивы полученных данных с возрастающей сложностью применяемых к ним аналитических подходов. Появление новых сведений о биологических процессах, лежащих в основе формирования многофакторных фенотипических особенностей человека, позволит провести корректировку представленной методики либо выполнить построение новой модели, включающей уточняющие критерии отбора генетических маркеров.

About the authors

G. G. Kutelev

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Author for correspondence.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

A. B. Krivoruchko

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

A. E. Trandina

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

A. M. Ivanov

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

D. V. Cherkashin

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

A. A. Marchenko

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

S. L. Grishaev

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files