Evaluation of virucidal properties of the disinfectant agent based on polyhexamethyleneguanidine hydrochloride and alkyldimethylbenzylammonium chloride for the prevention of infections associated with health care

Full Text

Введение. Стратегической задачей здравоохранения является обеспечение качества медицинской помощи и создание безопасной среды пребывания для пациентов и персонала в организациях, осуществляющих медицинскую деятельность. Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются важнейшей составляющей этой проблемы в силу широкого распространения негативных последствий для здоровья пациентов, персонала и экономики государства. Общим критерием для отнесения случаев инфекций к ИСМП является непосредственная связь их возникновения с оказанием медицинской помощи (лечением, диагностическими исследованиями, иммунизацией и т. д.). Именно поэтому, к ИСМП относят случаи инфекции не только присоединяющиеся к основному заболеванию у госпитализированных пациентов, а также связанные с оказанием любых видов медицинской помощи (в амбулаторно-поликлинических, образовательных, санаторно-оздоровительных учреждениях, учреждениях социальной защиты населения, при оказании скорой медицинской помощи, помощи на дому и др.), и случаи инфицирования медицинских работников в результате их профессиональной деятельности [2, 4, 5].
В национальной концепции профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, отдельным вопросом рассматривается ротация дезинфицирующих средств, совершенствование лабораторной диагностики и мониторинга возбудителей ИСМП. Лабораторная диагностика и мониторинг возбудителей ИСМП – важнейшие компоненты системы эпидемиологического надзора за ИСМП. Микробиологический мониторинг возбудителей ИСМП предусматривает обязательное перманентное микробиологическое обеспечение системы эпидемиологического надзора за ИСМП; этиологическую расшифровку ИСМП у пациентов и медицинского персонала, внутривидовую идентификацию (типирование) возбудителей ИСМП; исследование объектов больничной среды; определение чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов к антимикробным средствам; создание и ведение баз данных о возбудителях ИСМП; эффективный контроль качества микробиологических исследований в организациях здравоохранения; статистический анализ результатов исследований. Как правило, объем и уровень микробиологических исследований, должны соответствовать условиям и профилю организации здравоохранения, обеспечивать эффективность эпидемиологического надзора. Профилактика ИСМП тесно связана с дезинфекцией и совершенствованием лабораторной диагностики и мониторинга возбудителей ИСМП: изучением дезинфектантов и их ротацией; оптимизацией перечня показаний для микробиологического исследования клинического материала и объектов больничной среды; включением методов микробиологической диагностики в стандарты оказания медицинской помощи; развитием сети микробиологических лабораторий организаций здравоохранения; оснащением лабораторий, участвующих в этиологической расшифровке и мониторинге возбудителей ИСМП современным лабораторным оборудованием, диагностическими системами; оптимизацией системы забора и доставки образцов биологического материала в лабораторию; совершенствованием и унификацией методов выделения и идентификации возбудителей ИСМП; разработкой и внедрением экспресс-методов микробиологической диагностики ИСМП бактериальной и вирусной этиологии и др. [1, 2].
Особое место среди ИСМП занимают возбудители вирусных инфекций, в частности, норовирусы. Калицивирусы человека относятся к семейству Caliciviridae. Генетическим материалом калицивирусов является однонитевая плюс-смысловая рибонуклеиновая кислота размером около 7500–7700 нуклеиновых оснований. В состав семейства Caliciviridae входят роды Norovirus, Sapovirus, Lagovirus и Vesivirus. Заболевания человека (вирусные гастроэнтериты) вызываются только представителями родов Norovirus и Sapovirus, представители двух других родов вызывают заболевания у различных животных, в том числе у кроликов, кошек и морских млекопитающих. Вирус Norwalk (Норволк), ставший впоследствии типовым представителем рода Norovirus, был открыт при помощи электронной микроскопии A.Z. Kapikian et al. в 1972 г. при изучении этиологии вспышки острого кишечного заболевания [8].
В настоящее время доказано, что норовирусы являются наиболее распространенными агентами, вызывающими острый гастроэнтерит у человека. Заражающая доза крайне мала, около 10 вирусных частиц. На долю норовирусов приходится свыше 90% вспышек острых кишечных вирусных инфекций в мире, причем значительная часть заболеваний норовирусной этиологии регистрируется у больных в лечебнопрофилактических учреждениях [2].
Поскольку норовирусы не культивируются, работа с ними крайне затруднена. В исследованиях используют либо суррогатный вирус, сходный по строению с норовирусом человека, либо вирусный концентрат, полученный многостадийной очисткой из клинических образцов фекалий больных людей. В качестве суррогатного вируса обычно используют калицивирус кошек (ринотрахеит кошек). Однако калицивирус кошек не является вполне адекватной моделью, поскольку он вызывает легкое респираторное заболевание у природного хозяина в отличие от норовируса человека, вызывающего острый гастроэнтерит. Многочисленными исследованиями [3, 4] показано, что респираторные вирусы менее устойчивы к воздействию дезинфектантов и различных физико-химических факторов, чем вирусы, поражающие кишечник. Именно в силу своей относительно высокой устойчивости во внешней среде кишечные вирусы хорошо сохраняются на поверхностях (до 28 дней и более), в холодной воде (более 2-х месяцев) и представляют собой реальную угрозу здоровью населения. Считается, что норовирусы более устойчивы к воздействию хлорсодержащих дезинфицирующих средств, чем полиовирус 1-го типа, ротавирусы человека [2, 9].

Цель исследования. Изучить вирулицидные свойства дезинфицирующего вещества «Дезавид» на основе полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида на модели норовируса, а также использовать указанный выше дезинфектант для ротации биоцидных препаратов в многопрофильном медицинском учреждении с целью профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Материалы и методы. Оценка вирулицидных свойств дезинфицирующего вещества «Дезавид» проводилась в лаборатории электронной микроскопии Научно-исследовательского института гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации и на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.
В данном исследовании использовался концентрат норовируса человека, полученный из пула фекалий госпитализированных с диагнозом острого гастроэнтерита с молекулярно-биологическим подтверждением. Концентрат норовируса получали многостадийной очисткой с использованием центрифугирования и мембранных фильтров из нитроцеллюлозы в тангенциальном потоке. Первоначально наличие частиц норовируса в препарате и отсутствие сочетанной вирусной инфекции подтверждали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с использованием стандартных методик идентификации по характерным морфологическим признакам [6, 7, 9]. Фекалии разбавляли буфером STE (pH 7,8) в соотношении 1:5, затем осаждали клеточный детрит центрифугированием 30 мл суспензии фекалий при 5000 об/мин в течение 15 мин на настольной центрифуге. Супернатант отбирали в чистые пробирки, добавляли антибиотик (пенициллин/синтомицин) и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 20 мин на ультрацентрифуге «Beckman L-8». Снова отбирали супернатант и центрифугировали при 40000 об/мин в течение 90 мин в бакет-роторе на ультрацентрифуге «Beckman L-8». Полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл буферного раствора STE, дополнительно очищали от балластных белков методом мембранной фильтрации в тангенциальном потоке и хранили при 4оС не более 5 дней до использования.
Электронно-микроскопические исследования проводили в соответствии с методиками, описанными в руководстве Doane F.W., 1994 [8]. 100 мкл концентрата норовируса смешивали с 100 мкл раствора дезинфектанта, полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида, т. е. в соотношении 1:1, в итоге в этой смеси концентрация дезинфектанта составляла 0,256 г активного вещества (или 100-кратное разведение концентрата испытуемого дезинфицирующего средства тщательно перемешивали и через определенные промежутки времени исследовали под электронным микроскопом [6, 8]. Для этого каплю исследуемого препарата (дезинфектанта) помещали на поверхность биопленки в пластиковой чашке Петри. На каплю опускали медную сетку с углеродной подложкой. После адсорбции в течение 30–60 с сетку отмывали в капле дистиллированной воды 2 раза, затем препарат контрастировали 1,5% раствором калиевой соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) (рН 6,7), удаляли избыток жидкости о край фильтровальной бумаги и высушивали сетку с препаратом в течение 1–2 мин при комнатной температуре. Просмотр препаратов производили на электронном микроскопе «JEM-1011» фирмы «JEOL» (Япония) при инструментальном увеличении ×50000. Исследовали не менее 20 полей зрения каждого препарата. Съемку производили с помощью встроенной в электронный микроскоп цифровой камеры «Morada» фирмы «Olympus-SIS» (Япония). Обработку изображений производили в цифровом формате.
Микробиологический мониторинг и оценка доминирующих штаммов микроорганизмов проводились также в медицинском стационаре Белгородской областной клинической больницы. Использовался клинический материал от больных; смывы с инструментария, устройств и аппаратов; с рук медицинского персонала; исследования воздуха; смывов с поверхности стен, панелей и др. Диагностические возможности лаборатории были расширены за счет применения методов полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа, иммунохроматографии.

Результаты и их обсуждение. Результаты электронно-микроскопического исследования приведены на рис. 1–4. При морфологическом исследовании концентрата норовируса человека до и после экспозиции с дезинфицирующим средством полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида в соотношении 9:1 было обнаружено, что воздействие испытуемого препарата на норовирус проявляется непосредственно в прямой деструкции вирусных частиц.
По истечении 15 мин экспозиции вирусного концентрата с раствором дезинфектанта в исследуемом препарате не было обнаружено полноценных вирусных частиц (рис. 1). Наблюдались лишь белковые коагуляты, состоящие из денатурированных капсидных белков норовируса и незначительного количества (менее 1%) полуразрушенных частиц (рис. 2). При увеличении времени обработки вирусного концентрата дезинфектантом до 30 мин происходила полная деструкция всех вирусных частиц в исследуемом препарате (рис. 3). При дальнейшем увеличении времени обработки наблюдалось укрупнение и уплотнение белковых коагулятов, которые в последующем выпадали в осадок (рис. 4).

 

Рис 1. Очищенный концентрат норовируса человека, содержащий $1.5\times {10}^{10}$ частиц в 1 мл диаметром 27–32 нм. Полноценные частицы – светлая стрелка; неполноценные частицы с проникшим внутрь контрастирующим веществом – темная стрелка; фрагменты клеточных мембран – треугольная стрелка. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 2. Концентрат норовируса после 15 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате наблюдаются бесформенные белковые коагуляты, состоящие из полностью денатурированных частиц норовируса, и незначительное количество полуразрушенных вирусных частиц – светлые стрелки. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 3. Концентрат норовируса после 30 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате наблюдаются только бесформенные коагуляты, состоящие из денатурированных белков норовируса. Интактных вирусных частиц не обнаружено. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 4. Концентрат норовируса после 60 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате присутствуют только бесформенные коагуляты, состоящие из денатурированных белков норовируса. Вирусных частиц не обнаружено. Наблюдается укрупнение и уплотнение белковых коагулятов. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

Полагаем, что механизм инактивации норовируса исследуемым дезинфектантом состоит в следующем. Частицы норовируса не содержат липидов и образованы только белковыми молекулами и РНК. Однако внутренняя поверхность капсидов норовируса – так называемые S-домены достаточно гидрофобны, благодаря чему и происходит сборка вирусных частиц в инфицированной клетке. В то же время наружные вариабельные домены капсидных белков, так называемые P-домены, гидрофильны и несут положительно заряженные аминокислоты, что и приводит к деструкции вирусных частиц за счет сочетанного действия испытуемого дезинфектанта. Исследования по адсорбции норовирусов на заряженных углероднополимерных подложках показали, что норовирусы обладают выраженным отрицательным электростатическим зарядом, т. н. дзета-потенциалом, который должен учитываться при выборе рабочей концентрации дезинфектанта [3].
Проведенный нами анализ циркулирующих штаммов возбудителей в медицинских стационарах показал снижение долевого участия бактериальных патогенных и непатогенных возбудителей. Отсутствие вирусных контаминантов также можно предположительно отнести к смене дезинфектанта, что способствовало снижению уровня регистрируемой ИСМП.
После применения полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида в стационаре в клиническом материале больных на 22,1% снизилась доля грамположительных бактерий семейства Micrococcaceae. В смывах с поверхностей и инструментария в больнице отсутствовали норовирусы.
Применение дезинфектанта «Дезавид» позволило снизить не только контаминацию поверхностей, но и заболеваемость ИСМП в лечебном учреждении.

Заключение. Установлено, что входящие в состав дезинфицирующего средства «Дезавид» полигексаметиленгуанидина гидрохлорид и алкилдиметилбензиламмония хлорид (заряженный поликатион) электростатически взаимодействуют с частицами норовируса. Взаимодействие начинается с наружных отрицательно заряженных P-доменов, затем охватывает гидрофобные S-домены, что приводит к диссоциации молекул капсидного белка и, таким образом, в итоге ведет к разрушению вирусных частиц. РНК норовируса в отсутствие рецепторных белков не способна осуществлять заражение, более того, она также разрушается и инактивируется компонентами дезинфектанта. Разрушенные вирусные частицы в дальнейшем превращаются в конгломераты денатурированных белков, которые со временем коагулируют, выпадают в осадок и подвергаются биодеградации. Ротация дезинфектантов в медицинском учреждении позволила снизить уровень заболеваемости ИСМП.

About the authors

V. V. Malyshev

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Russian Federation, г. Санкт-Петербург

T. A. Zmeeva

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Russian Federation, г. Санкт-Петербург

V. B. Sboychakov

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Russian Federation, г. Санкт-Петербург

E. A. Averina

Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа

Author for correspondence.
Email: vladmal_spb@list.ru
Russian Federation, г. Белгород

References

Supplementary files