Оценка вирулицидных свойств дезинфицирующего вещества на основе полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида для профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи

Полный текст

Введение. Стратегической задачей здравоохранения является обеспечение качества медицинской помощи и создание безопасной среды пребывания для пациентов и персонала в организациях, осуществляющих медицинскую деятельность. Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются важнейшей составляющей этой проблемы в силу широкого распространения негативных последствий для здоровья пациентов, персонала и экономики государства. Общим критерием для отнесения случаев инфекций к ИСМП является непосредственная связь их возникновения с оказанием медицинской помощи (лечением, диагностическими исследованиями, иммунизацией и т. д.). Именно поэтому, к ИСМП относят случаи инфекции не только присоединяющиеся к основному заболеванию у госпитализированных пациентов, а также связанные с оказанием любых видов медицинской помощи (в амбулаторно-поликлинических, образовательных, санаторно-оздоровительных учреждениях, учреждениях социальной защиты населения, при оказании скорой медицинской помощи, помощи на дому и др.), и случаи инфицирования медицинских работников в результате их профессиональной деятельности [2, 4, 5].
В национальной концепции профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, отдельным вопросом рассматривается ротация дезинфицирующих средств, совершенствование лабораторной диагностики и мониторинга возбудителей ИСМП. Лабораторная диагностика и мониторинг возбудителей ИСМП – важнейшие компоненты системы эпидемиологического надзора за ИСМП. Микробиологический мониторинг возбудителей ИСМП предусматривает обязательное перманентное микробиологическое обеспечение системы эпидемиологического надзора за ИСМП; этиологическую расшифровку ИСМП у пациентов и медицинского персонала, внутривидовую идентификацию (типирование) возбудителей ИСМП; исследование объектов больничной среды; определение чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов к антимикробным средствам; создание и ведение баз данных о возбудителях ИСМП; эффективный контроль качества микробиологических исследований в организациях здравоохранения; статистический анализ результатов исследований. Как правило, объем и уровень микробиологических исследований, должны соответствовать условиям и профилю организации здравоохранения, обеспечивать эффективность эпидемиологического надзора. Профилактика ИСМП тесно связана с дезинфекцией и совершенствованием лабораторной диагностики и мониторинга возбудителей ИСМП: изучением дезинфектантов и их ротацией; оптимизацией перечня показаний для микробиологического исследования клинического материала и объектов больничной среды; включением методов микробиологической диагностики в стандарты оказания медицинской помощи; развитием сети микробиологических лабораторий организаций здравоохранения; оснащением лабораторий, участвующих в этиологической расшифровке и мониторинге возбудителей ИСМП современным лабораторным оборудованием, диагностическими системами; оптимизацией системы забора и доставки образцов биологического материала в лабораторию; совершенствованием и унификацией методов выделения и идентификации возбудителей ИСМП; разработкой и внедрением экспресс-методов микробиологической диагностики ИСМП бактериальной и вирусной этиологии и др. [1, 2].
Особое место среди ИСМП занимают возбудители вирусных инфекций, в частности, норовирусы. Калицивирусы человека относятся к семейству Caliciviridae. Генетическим материалом калицивирусов является однонитевая плюс-смысловая рибонуклеиновая кислота размером около 7500–7700 нуклеиновых оснований. В состав семейства Caliciviridae входят роды Norovirus, Sapovirus, Lagovirus и Vesivirus. Заболевания человека (вирусные гастроэнтериты) вызываются только представителями родов Norovirus и Sapovirus, представители двух других родов вызывают заболевания у различных животных, в том числе у кроликов, кошек и морских млекопитающих. Вирус Norwalk (Норволк), ставший впоследствии типовым представителем рода Norovirus, был открыт при помощи электронной микроскопии A.Z. Kapikian et al. в 1972 г. при изучении этиологии вспышки острого кишечного заболевания [8].
В настоящее время доказано, что норовирусы являются наиболее распространенными агентами, вызывающими острый гастроэнтерит у человека. Заражающая доза крайне мала, около 10 вирусных частиц. На долю норовирусов приходится свыше 90% вспышек острых кишечных вирусных инфекций в мире, причем значительная часть заболеваний норовирусной этиологии регистрируется у больных в лечебнопрофилактических учреждениях [2].
Поскольку норовирусы не культивируются, работа с ними крайне затруднена. В исследованиях используют либо суррогатный вирус, сходный по строению с норовирусом человека, либо вирусный концентрат, полученный многостадийной очисткой из клинических образцов фекалий больных людей. В качестве суррогатного вируса обычно используют калицивирус кошек (ринотрахеит кошек). Однако калицивирус кошек не является вполне адекватной моделью, поскольку он вызывает легкое респираторное заболевание у природного хозяина в отличие от норовируса человека, вызывающего острый гастроэнтерит. Многочисленными исследованиями [3, 4] показано, что респираторные вирусы менее устойчивы к воздействию дезинфектантов и различных физико-химических факторов, чем вирусы, поражающие кишечник. Именно в силу своей относительно высокой устойчивости во внешней среде кишечные вирусы хорошо сохраняются на поверхностях (до 28 дней и более), в холодной воде (более 2-х месяцев) и представляют собой реальную угрозу здоровью населения. Считается, что норовирусы более устойчивы к воздействию хлорсодержащих дезинфицирующих средств, чем полиовирус 1-го типа, ротавирусы человека [2, 9].

Цель исследования. Изучить вирулицидные свойства дезинфицирующего вещества «Дезавид» на основе полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида на модели норовируса, а также использовать указанный выше дезинфектант для ротации биоцидных препаратов в многопрофильном медицинском учреждении с целью профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Материалы и методы. Оценка вирулицидных свойств дезинфицирующего вещества «Дезавид» проводилась в лаборатории электронной микроскопии Научно-исследовательского института гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации и на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.
В данном исследовании использовался концентрат норовируса человека, полученный из пула фекалий госпитализированных с диагнозом острого гастроэнтерита с молекулярно-биологическим подтверждением. Концентрат норовируса получали многостадийной очисткой с использованием центрифугирования и мембранных фильтров из нитроцеллюлозы в тангенциальном потоке. Первоначально наличие частиц норовируса в препарате и отсутствие сочетанной вирусной инфекции подтверждали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с использованием стандартных методик идентификации по характерным морфологическим признакам [6, 7, 9]. Фекалии разбавляли буфером STE (pH 7,8) в соотношении 1:5, затем осаждали клеточный детрит центрифугированием 30 мл суспензии фекалий при 5000 об/мин в течение 15 мин на настольной центрифуге. Супернатант отбирали в чистые пробирки, добавляли антибиотик (пенициллин/синтомицин) и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 20 мин на ультрацентрифуге «Beckman L-8». Снова отбирали супернатант и центрифугировали при 40000 об/мин в течение 90 мин в бакет-роторе на ультрацентрифуге «Beckman L-8». Полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл буферного раствора STE, дополнительно очищали от балластных белков методом мембранной фильтрации в тангенциальном потоке и хранили при 4оС не более 5 дней до использования.
Электронно-микроскопические исследования проводили в соответствии с методиками, описанными в руководстве Doane F.W., 1994 [8]. 100 мкл концентрата норовируса смешивали с 100 мкл раствора дезинфектанта, полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида, т. е. в соотношении 1:1, в итоге в этой смеси концентрация дезинфектанта составляла 0,256 г активного вещества (или 100-кратное разведение концентрата испытуемого дезинфицирующего средства тщательно перемешивали и через определенные промежутки времени исследовали под электронным микроскопом [6, 8]. Для этого каплю исследуемого препарата (дезинфектанта) помещали на поверхность биопленки в пластиковой чашке Петри. На каплю опускали медную сетку с углеродной подложкой. После адсорбции в течение 30–60 с сетку отмывали в капле дистиллированной воды 2 раза, затем препарат контрастировали 1,5% раствором калиевой соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) (рН 6,7), удаляли избыток жидкости о край фильтровальной бумаги и высушивали сетку с препаратом в течение 1–2 мин при комнатной температуре. Просмотр препаратов производили на электронном микроскопе «JEM-1011» фирмы «JEOL» (Япония) при инструментальном увеличении ×50000. Исследовали не менее 20 полей зрения каждого препарата. Съемку производили с помощью встроенной в электронный микроскоп цифровой камеры «Morada» фирмы «Olympus-SIS» (Япония). Обработку изображений производили в цифровом формате.
Микробиологический мониторинг и оценка доминирующих штаммов микроорганизмов проводились также в медицинском стационаре Белгородской областной клинической больницы. Использовался клинический материал от больных; смывы с инструментария, устройств и аппаратов; с рук медицинского персонала; исследования воздуха; смывов с поверхности стен, панелей и др. Диагностические возможности лаборатории были расширены за счет применения методов полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа, иммунохроматографии.

Результаты и их обсуждение. Результаты электронно-микроскопического исследования приведены на рис. 1–4. При морфологическом исследовании концентрата норовируса человека до и после экспозиции с дезинфицирующим средством полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида в соотношении 9:1 было обнаружено, что воздействие испытуемого препарата на норовирус проявляется непосредственно в прямой деструкции вирусных частиц.
По истечении 15 мин экспозиции вирусного концентрата с раствором дезинфектанта в исследуемом препарате не было обнаружено полноценных вирусных частиц (рис. 1). Наблюдались лишь белковые коагуляты, состоящие из денатурированных капсидных белков норовируса и незначительного количества (менее 1%) полуразрушенных частиц (рис. 2). При увеличении времени обработки вирусного концентрата дезинфектантом до 30 мин происходила полная деструкция всех вирусных частиц в исследуемом препарате (рис. 3). При дальнейшем увеличении времени обработки наблюдалось укрупнение и уплотнение белковых коагулятов, которые в последующем выпадали в осадок (рис. 4).

 

Рис 1. Очищенный концентрат норовируса человека, содержащий $1.5\times {10}^{10}$ частиц в 1 мл диаметром 27–32 нм. Полноценные частицы – светлая стрелка; неполноценные частицы с проникшим внутрь контрастирующим веществом – темная стрелка; фрагменты клеточных мембран – треугольная стрелка. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 2. Концентрат норовируса после 15 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате наблюдаются бесформенные белковые коагуляты, состоящие из полностью денатурированных частиц норовируса, и незначительное количество полуразрушенных вирусных частиц – светлые стрелки. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 3. Концентрат норовируса после 30 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате наблюдаются только бесформенные коагуляты, состоящие из денатурированных белков норовируса. Интактных вирусных частиц не обнаружено. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

 

Рис. 4. Концентрат норовируса после 60 мин обработки средством «Дезавид» в рабочей концентрации. В препарате присутствуют только бесформенные коагуляты, состоящие из денатурированных белков норовируса. Вирусных частиц не обнаружено. Наблюдается укрупнение и уплотнение белковых коагулятов. Негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой

Полагаем, что механизм инактивации норовируса исследуемым дезинфектантом состоит в следующем. Частицы норовируса не содержат липидов и образованы только белковыми молекулами и РНК. Однако внутренняя поверхность капсидов норовируса – так называемые S-домены достаточно гидрофобны, благодаря чему и происходит сборка вирусных частиц в инфицированной клетке. В то же время наружные вариабельные домены капсидных белков, так называемые P-домены, гидрофильны и несут положительно заряженные аминокислоты, что и приводит к деструкции вирусных частиц за счет сочетанного действия испытуемого дезинфектанта. Исследования по адсорбции норовирусов на заряженных углероднополимерных подложках показали, что норовирусы обладают выраженным отрицательным электростатическим зарядом, т. н. дзета-потенциалом, который должен учитываться при выборе рабочей концентрации дезинфектанта [3].
Проведенный нами анализ циркулирующих штаммов возбудителей в медицинских стационарах показал снижение долевого участия бактериальных патогенных и непатогенных возбудителей. Отсутствие вирусных контаминантов также можно предположительно отнести к смене дезинфектанта, что способствовало снижению уровня регистрируемой ИСМП.
После применения полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и алкилдиметилбензиламмония хлорида в стационаре в клиническом материале больных на 22,1% снизилась доля грамположительных бактерий семейства Micrococcaceae. В смывах с поверхностей и инструментария в больнице отсутствовали норовирусы.
Применение дезинфектанта «Дезавид» позволило снизить не только контаминацию поверхностей, но и заболеваемость ИСМП в лечебном учреждении.

Заключение. Установлено, что входящие в состав дезинфицирующего средства «Дезавид» полигексаметиленгуанидина гидрохлорид и алкилдиметилбензиламмония хлорид (заряженный поликатион) электростатически взаимодействуют с частицами норовируса. Взаимодействие начинается с наружных отрицательно заряженных P-доменов, затем охватывает гидрофобные S-домены, что приводит к диссоциации молекул капсидного белка и, таким образом, в итоге ведет к разрушению вирусных частиц. РНК норовируса в отсутствие рецепторных белков не способна осуществлять заражение, более того, она также разрушается и инактивируется компонентами дезинфектанта. Разрушенные вирусные частицы в дальнейшем превращаются в конгломераты денатурированных белков, которые со временем коагулируют, выпадают в осадок и подвергаются биодеградации. Ротация дезинфектантов в медицинском учреждении позволила снизить уровень заболеваемости ИСМП.

Об авторах

В. В. Малышев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

Т. А. Змеева

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

В. Б. Сбойчаков

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladmal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

Е. А. Аверина

Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа

Автор, ответственный за переписку.
Email: vladmal_spb@list.ru
Россия, г. Белгород

Список литературы

Дополнительные файлы