Molecular aspects of creating vaccines for the prevention of poisoning ribosome-inactivating proteins of plant origin: current situation, problems of vaccine development

Vadim A. Myasnikov; Мясников Вадим Александрович; Alexander V. Stepanov; Степанов Александр Валентинович; Olga A. Miteva; Митева Ольга Анатольевна; Alexander S. Nikishin; Никишин Александр Сергеевич; Alexander S. Gogolevsky; Гоголевский Александр Сергеевич; Ruslan I. Al-Shehadat; Аль-Шехадат Руслан Исмаилович

doi:10.17816/brmma65095

Molecular aspects of creating vaccines for the prevention of poisoning ribosome-inactivating proteins of plant origin: current situation, problems of vaccine development

Authors: Myasnikov V.A.¹, Stepanov A.V.¹, Miteva O.A.¹, Nikishin A.S.¹, Gogolevsky A.S.¹, Al-Shehadat R.I.¹
Affiliations:
1. State Scientific-research Test Institute of Military Medicine
Issue: Vol 23, No 2 (2021)
Pages: 219-228
Section: Reviews
Submitted: 14.04.2021
Accepted: 01.06.2021
Published: 12.07.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/65095
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma65095
ID: 65095

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

This article reviews the current understanding of the mechanism of action of the toxin, the clinical effects of ricin and abrin intoxication and how these relate to current and continuing prospects for vaccine development. The threat of bioterrorism worldwide has accelerated the demand for the development of therapies and vaccines against the ribosome-inactivating proteins. The diverse and unique nature of these toxins poses a challenge to vaccinologists. This paper will review the mechanism of toxicity and vaccines development to protect against the highly toxic plant-derived ribosomal toxins. Vaccine development is further complicated by the fact that as bioterrorism agents, abrin and ricin would most likely be disseminated as aerosols supplies. Our understanding of the mechanisms by which these toxins cross mucosal surfaces, and importance of mucosal immunity in preventing toxin uptake is only rudimentary. Research is now aimed at developing recombinant, attenuated vaccines based on a detailed understanding of the molecular mechanisms by which these toxins function. The evolution of the development of specific immunoprophylaxis of acute ricin poisoning from native toxoid to genetically engineered subunit vaccines based on the method of targeted mutagenesis is traced. The past several years have seen major advances in the development of a safe and efficacious ricin toxin vaccine. These vaccines are discussed in the context of the toxicity and structure of ricin. In this review we summarize ongoing efforts to leverage recent advances in the design and use of vaccines.

Keywords

intoxication, vaccination, plant-derived lectins, recombinant subunit vaccines, ribosome-inactivating proteins of plant origin, targeted mutagenesis, immunobiological drugs

Full Text

Токсины широко распространены в живых системах — от вирусов до высших растений и позвоночных животных. Интерес специалистов медико-профилактического профиля к токсинам биологического происхождения обусловлен высокой вероятностью их применения в качестве биологических поражающих агентов (БПА), ввиду высокой активности, нередко превышающей классические конвенциальные яды; тяжести интоксикации и высокой летальности в результате отсутствия проведения профилактических и лечебных мероприятий; относительной простоты получения и стабильности хранения; отсутствия в своем большинстве специфических средств терапии и профилактики; скрытости факта воздействия и отсутствия инкубационного периода перед возникновением клинических проявлений; а также наличия определенных затруднений выявления и идентификации в объектах окружающей среды и биологического материала от пораженных. Возможность применения и распространения токсинного оружия в следствие его относительной доступности и простоты получения представляет одну из значимых потенциальных угроз безопасности современного общества. Проблема предотвращения подобных рисков, в том числе в рамках борьбы с биотерроризмом, приоритетна не только для России, но и для мирового сообщества в целом [1].

По своим характеристикам биологические токсины занимают нишу между классическими биологическими и химическими агентами: с одной стороны, они вырабатываются живыми организмами, но, вместе с тем, не способны реплицироваться, вызывая только интоксикацию (острое отравление). Среди известных на сегодняшний день биотоксинов особое место занимают белковые фитотоксины или токсальбумины высших растений. Последние представляют собой сложные белки-гликопротеиды, обладающие высокой биологической активностью, степенью гомологии и универсальностью механизма действия. Токсальбумины являются классическими бинарными белковыми токсинами, состоящими из двух субъединиц — связывающей, рецепторной (ricin toxin B-chain — RTB) и каталитической (ricin toxin А-chain — RTA). В основе цитотоксического действия этих белков лежит депуринизация рибосом [2]. Этот механизм модификации и инактивации 60S субъединицы эукариотической рибосомы широко распространен и встречается у представителей различных таксонов, чрезвычайно удаленных друг от друга в эволюционном древе. Субъединица В, несущая лектиновый остаток, обеспечивает связь с галактозосодержащими рецепторами на поверхности клеточной мембраны эукариот и транслокацию токсина. Каталитическая субъединица, представляющая собой фермент N-гликозилазу, избирательно выщепляет адениновый остаток из консервативного домена 28S рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) рибосомы, вследствие чего нарушается внутриклеточный синтез белков (трансляция), приводящий клетку к гибели [3].

К настоящему времени известно более 50 растительных белков данной группы, способных блокировать рост пептидной цепи за счет инактивации рибосом. В группу рибосом-инактивирующих белков (РИБ) (ribosome-inactivating proteins — RIP) входят рицин (продуцент Ricinus communis), абрин (продуцент Abrus precatorius), вискумин (продуцент Viscum album), модецин (продуцент Modeca digitata), относительно нетоксичные нигрин и эбулин бузины (продуценты Sambucus ebolus, Sambucus nigra), и многие другие. Рицин, помимо тетродотоксина и ботулотоксина, входит в список 1 «Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении» [4]. Несмотря на то, что получение и хранение рицина строго регламентировано Организацией по запрещению химического оружия (ОЗХО), регулярно фиксируются попытки его незаконного производства и использования [5]. Абрин близок по своей структуре и свойствам рицину. И, хотя возможность крупномасштабного культивирования продуцента абрина признана малоосуществимой, высокая устойчивость и стабильность как нативного белка, так и отдельных его субъединиц, простота и дешевизна получения сырья, его токсичность, превышающая токсичность рицина, представляют значимую угрозу.

За последнее десятилетие многие страны заметно интенсифицировали государственные программы создания средств диагностики, лечения и профилактики острых отравлений белковыми токсинами различной этиологии. Так, были предприняты значительные усилия по совершенствованию контрмер, предназначенных для сдерживания рисков и последствий отравления РИБ [6, 7], включающих в себя разработку перспективных кандидатных вакцин нового поколения [8–10].

В Российской Федерации для обеспечения биологической безопасности населения создана мощная законодательная и регулирующая база, основой которой является «Закон о биологической безопасности в Российской Федерации», подписанный 30.12.2020. Президентом Российской Федерации. Кроме того, в рамках выполнения ряда указов, целевых и федеральных программ создан обширный материально-технический и методический задел с определением функций, распределением сил и средств силовых, медицинских и иных подразделений, предназначенных для снижения и/или устранения рисков воздействия опасных химических и биологических факторов. Вместе с тем перечень научно-технических и опытно-конструкторских разработок, которые были созданы для принятия своевременных мер по предупреждению биологических угроз, вызванных возможным применением белковых ядов, пока не содержит решений применительно к профилактике и специфической терапии отравлений РИБ.

На сегодняшний день вакцинация является наиболее эффективной мерой, позволяющей обеспечить готовность медицинской службы Вооруженных сил Российской Федерации предотвратить либо существенно снизить поражающие эффекты БПА, в том числе белковой природы. Для проведения эффективной специфической иммунопрофилактики (СИП) необходимо четкое определение ее места, специфической направленности, времени и масштабов. В частности, при разработке эффективных СИП важно учитывать не только антигенные детерминанты, являющиеся мишенями для реализации иммунного ответа, но и терапевтическое окно для данного типа воздействия. Несмотря на успехи, достигнутые в изучении молекулярных аспектов, которые лежат в основе нейтрализации растительных РИБ, сохраняются пробелы в понимании основных механизмов реализации иммунного ответа, опосредованного антителами и обеспечивающего защиту от ингаляционного или перорального поражения растительными лектинами, ингибирующими синтез белка в клетке. Знание этих и других особенностей взаимодействия РИБ с организмом предопределяет правильный выбор стратегии разработки СИП и иммунотерапии острых ингаляционных и пероральных поражений как цельными нативными растительными РИБ, так и их отдельными компонентами.

Таким образом, формирование адекватной и надежной системы безопасности, а также изучение биологических свойств токсичных белков растительного происхождения с целью последующего создания средств диагностики, профилактики и терапии отравлений РИБ остается актуальной проблемой современной военной медицины.

История создания противорициновой вакцины берет начало с разработки препаратов на основе нетоксичных форм рицина. Первоначально в качестве нетоксичной формы был предложен токсоид рицина, или анатоксин, представляющий собой нативный белок, обработанный формалином [11–13]. В качестве иных способов модификации изучено дегликозилирование молекулы цельного белка, а также отдельных его субъединиц [13, 14]. В работах C. Yan, W. Rill, L. Mall [11], G. Griffiths, et al. [13] показано, что после инкапсулирования дегликозилированной формы субъединицы А в липосомы и введения полученного препарата в респираторный тракт достигался необходимый протективный эффект, защищавший животных при ингаляции высокими дозами токсина. Вместе с тем все вышеописанные иммунобиологические лекарственные препараты (ИЛП) обладали остаточной токсичностью вследствие сохранения в молекуле антигена участков, ответственных за депуринизацию рРНК [15]. Поэтому, ни вакцина на основе анатоксина, ни вакцина на основе дегликозилированной RTA не нашли широкого практического применения. Дополнительным недостатком, связанным с производством таких ИЛП, является работа с активным белком. Отчасти снижение указанных рисков достигается при разработке субъединичных рекомбинантных вакцин на основе нетоксичных форм RTA, получаемых с использованием генно-инженерных и биотехнологических подходов на основе метода таргетного мутагенеза [16–18].

Субъединичные вакцины содержат четко определенные макромолекулярные детерминанты токсина, способные вызывать протективный иммунитет. Этот тип вакцин обладает рядом преимуществ по сравнению с другими ИЛП (например, инактивированными, субъединичными), а именно улучшенными профилями безопасности, простотой производства и стабильностью. К недостаткам можно отнести ограничения, связанные с очисткой специфического рекомбинантного белка и изменением его конформации на начальных этапах отработки технологии производства. Еще одной значимой проблемой субъединичных вакцин является их недостаточная иммуногенность, хотя к настоящему времени отработаны определенные подходы к ее усилению, например, использование поливалентных антигенов, адъювантов и ряд других субстратов и методических приемов [17–22].

В настоящее время наиболее перспективными признаются две вакцины — RiVax и RVEc, разработанные в Соединенных Штатах Америки, на основе рекомбинантной формы RTA, лишенной ферментативной активности, но сохранившей третичную структуру.

Препарат RiVax представляет собой полноразмерный вариант (267 а.о.) RTA. Для разработки RiVax в RTA были введены две точечные мутации Туг8 —> А1а и Val76 —> Met, что позволило нивелировать токсические эффекты, связанные с депуринизацией рРНК (Туг80 —> А1а) и способностью вызывать синдром повышенной проницаемости сосудов (Val76 —> Met) [16, 17]. Препарат высоко очищен и нетоксичен, при этом даже в отсутствии адъюванта обладает способностью активировать выработку нейтрализующих антирициновых антител в высоком титре у мышей и кроликов [16–18]. Мыши, трехкратно иммунизированные этим ИЛП с четырехнедельным интервалом между повторными инъекциями в количестве 1 мкг, были полностью защищены от токсического эффекта рицина, введенного внутрибрюшинно в дозе 10 ЛД₅₀. Важно отметить, что иммунные сыворотки, полученные от этих же животных, содержали антитела, нейтрализующие рицин и способные защитить не вакцинированных мышей от одной летальной дозы токсина, введенной внутрибрюшинно. Исследование защитной эффективности ИЛП при реальных аппликациях токсиканта показало, что внутримышечное введение RiVax по вышеописанной схеме защищало мышей от 10-кратной средней смертельной дозы, введенной перорально или ингаляционно [19]. Препарат также обладал высокой иммуногенностью и не проявлял сколько-нибудь выраженной токсичности при проведении I фазы клинических испытаний, а антитела, полученные из сыворотки вакцинированных добровольцев, обладали протективным эффектом и защищали мышей от ингаляций рицина в дозе не менее одной смертельной [20].

Вторая кандидатная вакцина — RVEc — представляет собой усеченную версию RTA, в которой отсутствуют остатки 199–267 С-конца и небольшая гидрофобная петля в N-конце (остатки 34–43) [21–23]. Эти изменения позволили снизить агрегабельность молекулы RTA и ее осаждение из раствора, что существенно повысило стабильность вакцины. Исследование кристаллической структуры показало, что, несмотря на отсутствие домена свертывания 3, молекула RTA в RVEc способна принимать нормальную третичную структуру в доменах 1 и 2, что, безусловно, способствует ее высокой иммуногенности и является неотъемлемой частью эффективности вакцины. Эффективность данного ИЛП объясняется тем, что ряд сильных токсиннейтрализующих антител нацелен именно на конформационно зависимые эпитопы внутри самих фолдинговых доменов [24].

За последние 10 лет RiVax и RVEc были подвергнуты всесторонним доклиническим исследованиям, включая оценку эффективности и безопасности, проведенную на двух видах лабораторных животных — мышах и кроликах. Показано, что подкожное, внутрибрюшинное или внутримышечное введение RiVax обеспечивало развитие протективного иммунитета против системных и местных (слизистые оболочки) поражений у мышей [16, 19, 25, 26]. RVEc также обеспечивала формирование системного и мукозального иммунитета респираторного тракта, защищая мышей и кроликов от ингаляционного поражения летальными дозами токсина [22, 27, 28].

Результаты I фазы клинических исследований RiVax и RVEc позволили сделать заключение, что обе вакцины действуют аналогично друг другу [8–10]. Исследования их безопасности свидетельствуют, что по этому показателю RiVax и RVEc схожи между собой. Так, подавляющее большинство добровольцев (80–100%) сообщали о легких системных нежелательных симптомах, регистрируемых после вакцинации (температура, головная боль, артралгия, миалгия, и т. п.). Важно отметить, что уровни специфических противорициновых антител в крови вакцинированных RiVax или RVEc в сопоставимых дозах были практически идентичны. Хотя наименьшая исследованная прививочная доза RiVax (1 мкг) не вызывала выработки специфических антител ни у одного из вакцинированных, у четырех из пяти привитых RiVax в дозе 10 мкг, и пяти из пяти, привитых RiVax в дозе 100 мкг, регистрировали высокие уровни сероконверсии спустя 14 сут после третьей вакцинации.

При исследовании иммунного статуса добровольцев, иммунизированных RVEc, у десяти из десяти (100%) и девяти из десяти (90%) привитых препаратом в дозах 20 и 50 мкг соответственно, сероконверсия была установлена после третьей вакцинации. Самые высокие уровни специфических противорициновых антител были выявлены при введении препаратов в средних, а не максимальных дозах. Например, через 10 сут после второй вакцинации сероконверсия была выявлена у девяти из десяти добровольцев, привитых RVEc в дозе 20 мкг, при этом среди добровольцев, привитых препаратом в дозе 50 мкг, только у семи из десяти (70%) выявлены высокие уровни специфических антител. Пиковые токсин-специфические сывороточные титры антител иммуноглобулина (Ig) G в клинических исследованиях RiVax и RVEc были зарегистрированы через 2–4 нед после третьей вакцинации. Однако, вследствие различий в методике определения, прямое сравнение абсолютных титров невозможно. В обоих случаях титры токсин-специфических сывороточных антител IgG имели тенденцию к снижению через 2–4 нед после последней вакцинации с периодом полураспада от 100 до 180 сут. Следовательно, обе вакцины являются относительно безопасными и иммуногенными для людей. Однако ввиду быстрого снижения титров токсин-специфических сывороточных IgG по причине их короткого периода полураспада ни одна из вакцин не оказалась значимо более эффективной при оценке в тесте токсиннейтрализующей активности. Кроме того, был выявлен целый ряд других проблем применительно к обоим ИЛП. Так, по результатам I фазы клинических исследований отмечено, что ни одна из вакцин RVEc или RiVax, содержащих в своем составе альгидрогель, не является достаточно иммуногенной для людей, что определяет необходимость дальнейшего совершенствования ИЛП против рицина путем применения более эффективных адъювантов, способных увеличить иммуногенность существующих препаратов.

Вместе с тем нельзя не признать, что данные, полученные в исследованиях на животных, особенно ИЛП, не всегда могут быть экстраполированы на человека. С одной стороны, значение показателей титра токсиннейтрализующих антител в защите от поражений рицином бесспорно. С другой стороны, уровни токсин-специфических сывороточных IgG, по крайней мере у мышей, не являются надежными индикаторами развития напряженного иммунитета [29].

В настоящее время единственным признаком формирования напряженного иммунного ответа является оценка токсиннейтрализующей активности (toxin-neutralizing activity — TNA) in vitro с использованием анализа цитотоксичности на клетках млекопитающих. Проблема заключается в том, что сама по себе TNA может быть слишком жестким порогом, по которому оценивают эффективность защиты. В исследованиях, проведенных на мышиной модели, показано, что выживание после введения смертельной дозы рицина может происходить и в отсутствие детектируемой токсиннейтрализующей активности [29, 30]. В исследовании, проведенном под руководством J.M. O’Hara, L.M. Neal, E.A. McCarthy [31], беспородных белых мышей (n = 10) иммунизировали RiVax или RVEc в дозе 0,3 мкг/мышь двухкратно, с интервалом 30 сут. Далее, при отравлении мышей рицином в дозе, превышающей 10 средних смертельных доз (ЛД₅₀), все иммунизированные животные выжили несмотря на то, что TNA с сывороткой иммунизированных мышей оказалась отрицательной. Высказано предположение, что уровни циркулирующих токсиннейтрализующих антител, достаточных для достижения протективного эффекта, были ниже порога, который может быть зафиксирован применяемыми методами. В качестве альтернативы нельзя исключать вероятность того, что смесь поликлональных «не нейтрализующих» антител (как определено с помощью текущих исследований in vitro) потенциально способна инактивировать рицин in vivo с помощью механизмов, до настоящего момента еще не изученных [10].

Заметим, что публикации, посвященные разработке рекомбинантных вакцин к другим типам рибосом-ингибирующих белков, в частности к абрину практически отсутствуют. До недавнего времени о мишенях абрин-нейтрализующих антител было известно крайне мало. В работе M.S. Kumar, А.А. Karande [32] описано два иммунодоминантных эпитопа, расположенных на субъединице A абрина. Анализ паттерна связывания антител выявил 11 линейных эпитопов для субъединицы А и 14 эпитопов для субъединицы В молекулы холотоксина, которые расположены на поверхности токсина и, следовательно, доступны для взаимодействия с антителами [33].

Несмотря на описанный научно-практический задел в области разработки и испытания вакцин против РИБ, в частности рицина, на сегодняшний день информация о разработке вакцин-кандидатов против абрина отсутствует. Однако несколько лет назад опубликована серия работ, посвященных исследованию и оценке свойств рекомбинантного модифицированного белка А, представляющего собой химерную молекулу, содержащую участок цепи В как абрина, так и рицина [34, 35]. Был сконструирован оптимизирующий ген, кодирующий В-субъединицы как рицина, так и абрина, созданы методики очистки экспрессированного продукта и подтверждения его структуры методом масс-спектрометрии высокого разрешения. В экспериментах на белых беспородных мышах показана высокая иммуногенность и защитный эффект разработанной двойной субъединичной рекомбинантной вакцины при четырехкратной с интервалом в неделю подкожной иммунизации в дозах 15 или 25 мкг на животное с последующим пероральным или ингаляционным отравлении токсинами в дозах от 2 до 4 ЛД₅₀.

По мнению специалистов в области вакцинологии, стратегия применения В-субъединиц А-В токсинов для иммунизации имеет ряд преимуществ ввиду невысокой токсичности транспортной субъединицы по сравнению с ферментативной, а также выявленными адъювантными свойствами субъединицы В. В 2015 г. было объявлено о проведении доклинических испытаний безопасности и иммуногенности препарата на животных моделях [36], однако в ходе исследований было установлено, что защитный титр антител снижался до минимальных величин менее чем за 3 мес, что не позволило провести весь спектр доклинических исследований.

Способность антител частично или полностью инактивировать последствия поражения рицином была признана более века назад. Тем не менее основные механизмы, с помощью которых достигался протективный эффект были изучены сравнительно недавно. В первую очередь, это было достигнуто благодаря детальной характеристике десятков нейтрализующих и ненейтрализующих моноклональных рицин-специфических антител, что послужило основой для разработки средств иммунизации. Появилось понимание молекулярных механизмов, обеспечивающих формирование протективного иммунитета против нативных риботоксинов и их отдельных субъединиц.

Современные исследования продемонстрировали потенциал субъединичных вакцин в достижении протективного эффекта и являются свидетельством того, что концепция, принятая при разработке кандидатных вакцин, верна. Дальнейшие усилия исследователей должны быть направлены на более глубокое понимание принципов развития протективного иммунитета, изучение молекулярных основ взаимодействия антиген-антитело, составление полной антигенной карты рицина и абрина и более точное определение эпитопов, связанных с нейтрализующей активностью. Это позволит создать образцы рекомбинантных субъединичных вакцин, полностью лишенных риботоксических свойств, с высокими протективными свойствами.

About the authors