Подходы к выделению и очистке нуклеиновых кислот из крови для генотипирования человеческого лейкоцитарного антигена

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Актуальным вопросом в области иммуногенетики и трансплантологии остается модификация алгоритмов типирования человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) (от англ. Human Leukocyte Antigens) для повышения точности результатов скрининга гистосовместимости и обеспечения эффективного подбора пар «донор — реципиент». Несовпадение HLA-статуса донора и реципиента приводит к иммунному ответу и отторжению трансплантата — реакциям «хозяин против трансплантата» (РХПТ) и «трансплантат против хозяина» (РТПХ), поэтому при аллотрансплантации клеток, тканей, органов критически важна гистосовместимость донора и реципиента [1]. За тканевую совместимость отвечают высокополиморфные гены главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) (major histocompatibility complex — MHC), кодирующие специфические белки, которые презентируют антигены на поверхности мембран клеток лимфоцитам для распознавания и уничтожения собственных измененных и чужеродных клеток (у человека семейство генов MHC именуется как HLA).

Молекулярные методы анализа нуклеиновых кислот широко используются как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Одним из основных молекулярно-генетических методов анализа является генотипирование — выявление присутствующих в геномной последовательности организма генетических вариаций (полиморфизмов) посредством сравнения его генотипа с референтным геномом. Генотипирование нашло практическое применение в идентификации микроорганизмов, пренатальной диагностике, персонализированной медицине, при переливании крови, а также в трансплантологии [2–5]. Для эффективного подбора потенциального донора трансплантата проводят предтрансплантационный генетический скрининг — HLA-генотипирование [6, 7].

Высокое качество и достаточное количество нуклеиновых кислот — ключевые условия успешного проведения высокоточных молекулярно-биологических исследований. Однако научная и клиническая практика, как правило, требует значительных материальных и финансовых вложений, что вынуждает сотрудников подбирать метод получения нуклеиновых кислот, руководствуясь не только его эффективностью, но также время- и трудозатратностью, экономичностью и потребностью в дополнительном оборудовании и реагентах. Остается актуальной проблема разработки новых и оптимизации, модификации уже существующих методов выделения и очистки нуклеиновых кислот, адаптированных под конкретные задачи и возможности лабораторий.

Цель исследования — описать принцип действия наиболее распространенных методик получения нуклеиновых кислот из периферической крови, сравнить характеристики относительно друг друга исходя из практического и экономического критериев для установления оптимального протокола выделения и очистки дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой кислот (РНК) для HLA-генотипирования и дать рекомендации исследователям по выбору наиболее эффективных методик и протоколов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка нуклеиновых кислот осуществляется на основе физико-химических методик, позволяющих отделить ДНК и РНК от балластных биомакромолекул и клеточного дебриса [8]. Первый этап любого протокола выделения заключается в механическом, химическом или ферментативном лизисе биоматериала, целью которого является максимально полное извлечение нуклеиновых кислот из образцов [9]. Высокая степень очистки нуклеиновых кислот обеспечивает их стабильность в течение продолжительного времени, поэтому полученный необработанный лизат необходимо подвергнуть физико-химической и ферментативной очистке от клеточных компонентов и химических соединений, препятствующих длительному хранению нуклеиновых кислот и их дальнейшему использованию в молекулярно-биологических исследованиях: рестрикционном анализе, ПЦР, молекулярном клонировании, секвенировании и т. д. Методики очистки нуклеиновых кислот подразделяют на жидкофазные (органическая экстракция и высаливание) и твердофазные (на спин-колонках и магнитных частицах) [10–12].

Качественный и количественный анализы препарата нуклеиновой кислоты осуществляются широко распространенными и хорошо зарекомендовавшими себя методиками спектрофотометрии (Nano Drop, Nano Photometer P-Class), флуориметрии (Qubit, Quantus^тм Fluorometer) и гель-электрофореза. Спектрофотометрически концентрацию нуклеиновой кислоты определяют по величине поглощенного излучения определенной длины волны (пик абсорбции ~ 260 нм, A260), а качество — по отношению A260/A280, которое при значении < 1,8 для ДНК и < 2 для РНК указывает на недостаточную степень очистки от белков [8]. Флуориметрическая методика основана на специфическом связывании нуклеиновой кислоты с флуоресцентным зондом и флуоресценции образованного комплекса, интенсивность свечения которого пропорциональна концентрации нуклеиновой кислоты [13, 14].

Методика органической экстракции основана на фазовом разделении раствора нуклеиновых кислот и фенол-хлороформной смеси. При классической фенол-хлороформной очистке геномной ДНК к лизату клеток добавляют смесь фенола и хлороформа, затем центрифугируют для разделения двух фаз (рис. 1, а). После расслаивания нуклеиновые кислоты распределяются в верхней водной фазе; липиды, углеводы и клеточный дебрис попадают в более плотную органическую фазу, денатурированные белки — в интерфазу. Водную фазу аккуратно отбирают, повторяют процедуру при более низком pH (4–6) и отбирают органическую фазу. ДНК из полученного экстракта осаждают этанолом и растворяют в буфере TE или деионизированной воде (mQ) [15, 16].

 

Рис. 1. Органическая (фенол-хлороформная) экстракция нуклеиновых кислот: а — геномной ДНК; b — РНК

 

Для предотвращения пенообразования и улучшения разделения водной и органической фаз в фенол-хлороформную смесь добавляют изоамиловый спирт до объемного соотношения 25 : 24 : 1 соответственно, что способствует повышению эффективности очистки нуклеиновых кислот. Существуют готовые наборы реагентов — так называемые «киты» для органической экстракции, гидролизующие РНК и позволяющие избирательно выделять и очищать ДНК из клеточного лизата [17].

Методика органической экстракции РНК аналогична экстракции геномной ДНК (см. рис. 1, b). Биоматериал лизируют в феноле или тризоле (TRIzol Reagent), поддерживающих целостность РНК, добавляют хлороформ и разделяют фазы центрифугированием [18, 19]. Верхнюю водную фазу отбирают и повторяют процедуру при необходимости получить особо чистый препарат РНК. На финальной стадии РНК осаждают из водной фазы изопропанолом и растворяют в mQ [18–20].

Основными преимуществами классической фенол-хлороформной методики экстракции нуклеиновых кислот и ее модификаций являются относительно низкая стоимость, пригодность для основных типов биоматериала (кровь, моча, волосы, слюна и буккальный эпителий, ткани) и эффективность лизиса клеток. Несмотря на трудоемкость процесса очистки, варьируемость выхода нуклеиновых кислот и токсичность используемых реагентов, органическая экстракция не потеряла своей актуальности, удобна при получении нуклеиновых кислот из сложных гетерогенных образцов и служит ориентиром при оценке эффективности новых методик.

Выделение и очистка геномной ДНК способом высаливания основана на ее экстракции из клеточного лизата и преципитации белков под действием осаждающих реагентов или высокой концентрации солей [21, 22]. Методика применяется для получения геномной ДНК из растительных и животных клеток и особенно часто из клеток цельной крови (рис. 2) [21–24].

 

Рис. 2. Выделение геномной ДНК путем высаливания

 

Современные методики выделения и очистки геномной ДНК из клеток крови состоят из трех последовательных стадий: 1) лизис безъядерных клеток (эритроцитов), центрифугирование и удаление супернатанта, содержащего клеточный дебрис; 2) лизис ядерных клеток (лейкоцитов), осаждение белков и высвобождение ДНК насыщенным раствором NaCl в водную фазу, которую переносят в новую пробирку; и 3) осаждение ДНК из водной фазы этанолом или изопропанолом, очистка от примесей и растворение полученной ДНК в TE-буфере или mQ [23]. Альтернативный протокол содержит незначительные отличия, такие как предварительная промывка цельной крови от плазмы, термический лизис лейкоцитов и осаждение белков не только насыщенным раствором NaCl, но и хлороформом [24].

Методики высаливания привлекают внимание исследователей благодаря простоте исполнения, низкой стоимости реагентов и отсутствию потребности в дополнительном оборудовании, а полученная ДНК пригодна для ПЦР, клонирования, рестрикционного анализа и саузерн-блоттинга.

В основе колоночной методики очистки нуклеиновых кислот лежит высокая аффинность их отрицательно заряженного остова к положительно заряженным частицам мембраны. В условиях высокой ионной силы и наличия хаотропных солей (тиоцианата гуанидина) нуклеиновые кислоты избирательно связываются с мембраной и элюируются при низкой ионной силе раствора. Тиоцианат гуанидина дестабилизирует водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия, облегчает иммобилизацию нуклеиновых кислот на носителе и инактивирует нуклеазы. В качестве материала для мембраны используют силикатные носители (силикагель, силику), стеклянные частицы, диатомит и анионообменные носители. Пропускание клеточного экстракта через спин-колонку, промывку и элюирование нуклеиновых кислот проводят в центрифуге или посредством подключения к вакуумному насосу [25–27].

При выделении и очистке геномной ДНК на спин-колонках клетки лизируют в буфере, содержащем додецилсульфат натрия (SDS), протеиназу К (для удаления белковых примесей и инактивации нуклеаз) и РНКазу А (для очистки от РНК). Полученный экстракт пропускают через колонку, и геномная ДНК связывается фильтрующей мембраной, которую затем промывают от остаточных белков и солей, далее ДНК элюируют с поверхности мембраны (рис. 3 а). Геномная ДНК, полученная с помощью спин-колонок, отличается хорошим качеством и отсутствием ингибиторов ферментативных реакций и балластных примесей, что способствует получению воспроизводимых результатов анализов [26]. Колоночная методика выделения и очистки РНК в целом аналогична протоколу экстракции ДНК (рис. 3, b) и позволяет получать тотальную РНК — как мРНК, так и некодирующие РНК. Важным фактором является использование реагентов и колонок, не содержащих РНКаз [28].

 

Рис. 3. Выделение нуклеиновых кислот с использованием спин-колонок: a — геномной ДНК; b — РНК

 

Методика выделения и очистки нуклеиновых кислот на спин-колонках считается одной из лучших среди доступных вариантов и широко распространена благодаря своей универсальности, простоте выполнения и эффективности очистки от ингибиторов ферментативных реакций и примесей. Однако методика имеет существенные ограничения, связанные с высокой стоимостью анализа большого количества образцов и поэтому малопригодна для лабораторий с ограниченным бюджетом. В практическом плане возможности колоночной методики лимитированы пропускной способностью мембраны колонки, склонной к засорению пор вязкими образцами.

Принцип выделения и очистки нуклеиновых кислот на магнитных частицах («магнитных бидах» — от англ. magnetic beads) заключается в обратимом связывании нуклеиновых кислот на поверхности магнитных частиц [29, 30]. Современные магнитные частицы покрывают разным материалом: пористым стеклом, диоксидом кремния, неорганическими магнитными материалами, полистиролом, целлюлозой [31].

Эффективность выделения и очистки нуклеиновых кислот на магнитных частицах повышают путем иммобилизации олигонуклеотидов, нуклеотидная последовательность которых комплементарна последовательности целевых нуклеиновых кислот, например, поли(Т)-олигонуклеотидов для селективного связывания мРНК [32, 33].

Клетки лизируют в буфере и вносят в пробирку магнитные частицы, сорбирующие нуклеиновые кислоты из клеточного экстракта. Пробирку ставят на магнитный штатив, который притягивает магнитные частицы к стенке. Удаление супернатанта и промывка позволяют быстро очистить притянутые магнитные частицы от несвязанных примесей, в том числе от нуклеиновых кислот, не содержащих целевую последовательность (рис. 4) [29, 30].

 

Рис. 4. Выделение нуклеиновых кислот на магнитных частицах: a — геномной ДНК; b — РНК

 

Наборы на основе магнитных частиц предназначены для быстрого и эффективного получения нуклеиновых кислот и удобны при одновременном выделении из большого количества образцов. Метод сочетает в себе высокий выход ДНК и РНК хорошего качества и воспроизводимость получаемых результатов.

К основным типам биоматериала человека, применимых для генетических исследований, относят периферическую кровь, слюну, буккальный эпителий, мочу и волосы. Несмотря на инвазивность процедуры забора периферической крови, а также необходимость наличия квалифицированного медицинского персонала для проведения процедуры, получаемые из нее нуклеиновые кислоты превосходят по качественным и количественным показателям нуклеиновые кислоты из другого биоматериала, что делает кровь главным источником геномной ДНК и РНК в диагностических и эпидемиологических исследованиях [34–36]. В современной практике генотипирование проводится с использованием следующих методик: полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), случайно амплифицируемая полиморфная ДНК (RAPD), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК (AFLPD), аллель-специфические олигонуклеотиды (ASO), секвенирование, ДНК-микрочипы. В зависимости от выбранной методики генотипирования для создания библиотек в качестве матрицы используют геномную ДНК или РНК. В геномных библиотеках, получаемых из геномной ДНК, заключена информация о полной нуклеотидной последовательности генома, что делает возможным выявление однонуклеотидных полиморфизмов интронных областей. Напротив, из РНК создают библиотеки кДНК, несущие в себе нуклеотидные последовательности экзонов.

Сравнение методик получения геномной ДНК. Лаборатории с недостаточным финансированием имеют ограниченные возможности использования дорогих коммерческих наборов для извлечения геномной ДНК из крови. Авторами работ [37–40] произведен поиск более дешевой альтернативы наборам со спин-колонками и сформулированы предложения по использованию имеющихся протоколов жидкофазных методик получения ДНК и разработке новых, чтобы снизить стоимость процедуры в пересчете на один образец при сохранении эффективности выделения и очистки ДНК.

Показано, что классическая фенол-хлороформная экстракция благодаря длительной обработке ядерных клеток крови (лейкоцитов) в лизирующем буфере с SDS и протеиназой К позволяет извлекать из крови геномную ДНК, пригодную для ПЦР-анализа [38]. Тем не менее, из-за вариабельного качества ДНК, полученной с помощью данной методики, она не может быть использована для создания ДНК-библиотек и генотипирования [39]. Исследователи отмечают непрактичность фенол-хлороформной экстракции в условиях проведения высокопроизводительных многоканальных и потоковых исследований, так как данная методика включает большое число сложных длительных процедур и манипуляций [38, 39].

В работе D. Chacon-Cortes et al. [37] обращено внимание на перспективы оптимизации протоколов выделения и очистки геномной ДНК способом высаливания и разработан менее дорогой и времязатратный протокол. В более поздних работах [40] указывается на то, что повышение эффективности очистки обеспечивается благодаря отделению безъядерных клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов) от ядерных клеток (лейкоцитов) и лизису полученного осадка лейкоцитов при повышенной температуре в большем объеме лизирующего буфера и SDS [38, 39]. Разработанные протоколы позволяют извлекать качественную высокомолекулярную геномную ДНК и использовать ее для ПЦР [38, 40] и гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах, таргетного секвенирования и секвенирования de novo [39].

Стандартные протоколы коммерческих наборов со спин-колонками («Nucleospin» («Macherey-Nagel», «Duren», Германия)) и наборов с магнитными частицами («ChargeSwitch gDNA Tissue Mini» («Invitrogen», США)), как показано в работе A. Psifidi et al. [41], не обеспечивают необходимого качества получаемой из крови геномной ДНК для проведения NGS секвенирования, создания и скрининга библиотек ДНК, вследствие чего отмечается острая необходимость в модификации стандартных протоколов, в том числе посредством введения дополнительных этапов пробоподготовки биоматериала и очистки ДНК. Кроме того, авторы предлагают 2 экспериментально подтвержденных решения данной проблемы: а) предварительное отделение ДНК-содержащих ядерных клеток (лейкоцитов) от белков плазмы крови и безъядерных клеток (эритроцитов и тромбоцитов); б) повышение эффективности лизиса лейкоцитов за счет увеличения температуры инкубации (56 °С), ее длительности и использования бóльших объемов лизирующего буфера и протеиназы К. Предложенные меры позволяют улучшить качество и увеличить выход геномной ДНК, пригодной для длительного хранения и удовлетворяющей требованиям чувствительных молекулярных методик анализа [41]. Так, для проведения гибридизационного анализа ДНК с использованием ДНК-микрочипов достаточно 2,5–3 мкг ДНК, для таргентного ресеквенирования ДНК — 3–6 мкг, для секвенирования de novo — 10–20 мкг [42]. Помимо эффективности разработанных протоколов, авторы оценили их стоимость и времязатратность, признав адекватным решение увеличить стоимость (с 3 до 4€ на один образец) и длительность процедуры получения ДНК для увеличения ее выхода и повышения качества [41].

Наибольшей эффективностью выделения и очистки геномной ДНК из малых объемов крови обладают коммерческие наборы, используемые в криминалистических лабораториях. Стандартные протоколы наборов со спин-колонками («DNA Investigator» («QIAGEN», CШA)) и магнитными частицами («PrepFiler® BTA» («Life Technologies™», CШA), «DNA IQ™» («Promega», США)) позволяют удалять ингибиторы ПЦР и создавать библиотеки ДНК для NGS-платформ «Ion S5™» и «MiSeq FGx™» [43]. Данные наборы не нашли повсеместного спроса из-за высокой себестоимости процедуры (от 6 до 10 $ и дороже за 1 выделенный образец геномной ДНК).

В таблице 1 приведены экспериментальные данные об основных характеристиках геномной ДНК, которая была получена из крови путем органической экстракции, высаливания, на спин-колонках и магнитных частицах [37–41, 43].

 

Таблица 1. Концентрация и чистота ДНК, полученной из крови разными методиками

Table 1. Concentration and purity of deoxyribonucleic acid obtained from blood by different methods

Протокол	Средние значения концентраций ДНК, нг/мкл	Средние значения A260/280
Органическая экстракция
Фенол-хлороформная экстракция [38]	302	1,83
Фенол-хлороформная экстракция с добавлением изоамилового спирта [39]	68	1,71
Фенол-хлороформная экстракция [41]	260	1,67
Высаливание
Традиционный протокол высаливания [37]	32	1,75
Модифицированный протокол высаливания [37]	40	1,75
Стандартный протокол высаливания [38]	21	1,93
Модифицированный протокол высаливания [38]	368	1,84
Модифицированный протокол высаливания [39]	347	1,73
Традиционный протокол высаливания [40]	86	1,77
Протокол двойного высаливания [40]	122	1,80
Выделение на спин-колонках
Протокол со спин-колонками QIAamp DNA Blood Maxi Kit [37]	103	2,02
Протокол со спин-колонками Roche Diagnostics GmbH Kit [38]	24	1,86
Протокол со спин-колонками Origin Blood DNA Kit [39]	67	1,58
Протокол со спин-колонками QIAamp DNA Blood Mini Kit [40]	7	1,79
Стандартный протокол со спин-колонками Nucleospin [41]	55	1,76
Модифицированные протоколы со спин-колонками Nucleospin Blood, Tissue и Dx [41]	218–310	1,85–1,90
Протокол со спин-колонками DNA Investigator [43]	N/A
Выделение на магнитных частицах
Протокол с магнитными частицами Charge-Switch gDNA Tissue Mini kit [41]	7	1,47
Модифицированный протокол In-house с магнитными частицами PMSi-H1.0–5 [41]	207	1,85
Протокол с магнитными частицами PrepFiler BTA [43]	N/A
Протокол с магнитными частицами DNA IQ [43]	N/A

 

Примечание: M. Metzker [42] указывает, что минимальная концентрация ДНК для проведения NGS секвенирования соответствует 50 нг/мкл; X. Zeng et al. [43] не приводят данных о концентрации полученной геномной ДНК и соотношении A260/280, однако ее качество позволило провести STR-генотипирование и секвенирование на платформах «Ion S5™» и «MiSeq FGx™».

Для проведения HLA-генотипирования допустимо получать геномную ДНК из периферической крови не только коммерческими наборами со спин-колонками и магнитными частицами, но также недорогими протоколами высаливания. Заметим, что модифицированные лабораторные протоколы высаливания способны конкурировать по эффективности с готовыми «китами» [38–40], а доработка протокола со спин-колонками Nucleospin позволяет значительно улучшить выход и чистоту геномной ДНК [41].

Сравнение методик получения РНК. Лаборатории, занимающиеся разработкой и оптимизацией протоколов экстракции нуклеиновых кислот из крови, в случае с РНК отдают предпочтение коммерческим наборам со спин-колонками и магнитными частицами. В отличие от геномной ДНК, получать которую допустимо с использованием более дешевых жидкофазных методик, РНК извлекается в ущерб экономической составляющей, чтобы компенсировать недостаток опыта персонала при сохранении качественных и количественных показателей препарата РНК [44–48]. Подобная тенденция возникает из-за высоких требований к качеству РНК и сложности работы с ней, что опосредовано химической нестабильностью и восприимчивостью к РНКазам. Широко распространенным инструментом оценки целостности (интактности) выделенной РНК является «Agilent 2100 Bioanalyzer». Значения RIN (RNA integrity number) ≥ 7 свидетельствуют об интактном состоянии РНК, тогда как при значениях < 7 наблюдается ее деградация, что приводит к искажению результатов анализа уровня экспрессии генов путем количественного ОТ-ПЦР и РНК-секвенирования (RNA-seq) [49, 50].

По данным D. Schwochow et al. [48], полученные с использованием набора «TRIzol LS reagent» образцы РНК демонстрировали большой разброс значений RIN, а в работе J. Kim et al. [46] — низкие значения A260/A280 (≤ 1,7) и завышенные значения концентрации, поскольку авторы не обрабатывали полученные образцы РНК ДНКазой, что привело к их контаминации геномной ДНК.

Наивысшие качественные и количественные показатели были установлены у РНК, извлеченной коммерческим набором с магнитными частицами «MagMAX» [45, 47], аналогичный набор «easyMAG» был признан наихудшим из анализируемых по причине низкого выхода РНК, обусловленного ее большими потерями из клеточной пеллеты в супернатант [44]. Ручной и автоматизированный протоколы «MagMAX» дали сравнимые результаты по выходу тотальной РНК, A260/A280, целостности РНК, выходу малых РНК и соотношению мРНК/микроРНК. Автоматизированный протокол более предпочтителен, поскольку отличается меньшими трудозатратами и исключает разброс качественных и количественных показателей из-за человеческого фактора [45, 47].

Методики выделения и очистки РНК на основе спин-колонок представлены несколькими коммерческими наборами — «Tempus», «Norgen», «Nucleospin», «RiboPure», «LeukoLOCK», «PAXgene», «RNeasy» и др. У РНК, полученной из крови наборами «Tempus» и «Norgen», путем количественной ОТ-ПЦР были установлены уровни целевых мРНК, сравнимые с лидирующим по характеристикам набором «MagMAX» [45, 47]. Выводы и рекомендации по использованию наборов со спин-колонками RNeasy и RiboPure противоречивы: в работе A. Rodríguez et al. [44] при использовании этих наборов с совместимыми буферами для лизиса была получена РНК с высоким выходом и значениями RIN, однако в работе D. Schwochow et al. [48] эти же протоколы оказались в числе худших по количественным показателям и целостности очищенной РНК.

В таблице 2 приведены основные характеристики РНК, которая была получена из крови с помощью органической экстракции, на спин-колонках и магнитных частицах. Установлены функционально значимые особенности наиболее результативных протоколов: 1) использование расходных материалов, не содержащих РНКаз (RNase-free); 2) обработка полученной РНК ДНКазой; 3) отделение ретикулоцитов от лейкоцитов. При этом отделение лейкоцитов от остальных клеток крови признано целесообразным при получении геномной ДНК, в случае с РНК удаление ретикулоцитов оказывает позитивное влияние на качество РНК-препарата, а также облегчает последующее секвенирование. Так, за счет отделения ретикулоцитов снижается количество прочтений («ридов») мРНК-транскриптов гемоглобина, что позволяет секвенировать более редкие транскрипты [48].

 

Таблица 2. Выход, чистота и целостность (RIN) РНК, полученной из крови с помощью разных методик

Table 2. Yield, purity, and integrity (RIN) of ribonucleic acid derived from blood by various methods

Протокол	Выход РНК, мкг	Средние значения A260/280	Средние значения RIN
Органическая экстракция
Фенол-хлороформная экстракция с TRI reagent [46]	0,60	1,70	3,20
Фенол-хлороформная экстракция с TRIzol™ LS Reagent [48]	0,2–15,1	1,90	6,20
Выделение на спин-колонках
Протокол со спин-колонками RNeasy Mini Kit [44]	0,90	2,10	8,80
Протокол со спин-колонками RiboPure RNA Purification Kit-Blood [44]	3,30	2,00	8,60
Протокол со спин-колонками Norgen Preserved Blood RNA Purification Kit I [45]	12,04	2,09	8,63
Протокол со спин-колонками Tempus Spin RNA Isolation Kit [45]	10,14	2,05	8,70
Протокол со спин-колонками PAXgene Blood RNA system [46]	0,10	2,00	6,00
Протокол со спин-колонками NucleoSpin RNA Blood Kit [46]	0,40	2,00	6,40
Протокол со спин-колонками Norgen Preserved Blood RNA Purification Kit I [47]	15,40	2,12	7,36
Протокол со спин-колонками Tempus™ Spin RNA Isolation Kit [47]	15,40	2,09	8,97
Протокол со спин-колонками Tempus™ 6-Port RNA Isolation Kit [47]	15,40	2,20	8,38
Протокол со спин-колонками RiboPure™ RNA Purification Kit [48]	5,0–43,9	1,90	4,60
Протокол со спин-колонками RNeasy Mini Kit [48]	0,0–6,20	2,10	6,90
Протокол со спин-колонками PAXgene Blood RNA Kit [48]	0,10–10,2	2,10	7,70
Протокол со спин-колонками LeukoLOCK™ Fractionation & Stabilization Kit [48]	0,10–3,70	2,00	7,60
Выделение на магнитных частицах
Протокол с магнитными частицами NucliSENS easyMAG [44]	0,60	2,10	1,00
Протокол с магнитными частицами MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNA Isolation Kit [45]	8,34	2,09	6,68
Ручной протокол с магнитными частицами MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNA Isolation Kit [47]	15,40	2,12	7,20
Автоматизированный протокол с магнитными частицами MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNA Isolation Kit [47]	15,40	2,09	7,85

Примечание: необходимое количество РНК для синтеза кДНК — 0,5 нг [52]; рекомендуемое количество РНК для РНК-секвенирования — 100 нг [53].

 

Для выделения и очистки РНК из крови мы рекомендуем использовать коммерческие наборы со спин-колонками «LeukoLOCK», «Nucleospin», «Tempus», «Norgen» и «PAXgene» и набор с магнитными частицами «MagMAX».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сегодня лаборатории имеют на вооружении достаточно большой набор проверенных методик для выделения (экстракции) и очистки нуклеиновых кислот — фенол-хлороформную экстракцию, высаливание, выделение на спин-колонках и магнитных частицах. Существуют универсальные методики выделения и очистки ДНК и РНК из типового биоматериала — культур прокариотических и эукариотических клеток, растений, вирусных частиц, сред и т. д., однако при получении нуклеиновых кислот из неоднородных, комплексных образцов — таких как периферическая кровь, следует учитывать фактор гетерогенности и вводить дополнительные меры на этапе очистки нуклеиновых кислот от примесей и биомолекул, чтобы предотвратить ингибирование протекающих при анализе процессов и искажение получаемых данных. Потребность в доступных, недорогих и эффективных протоколах извлечения ДНК и РНК из минимальных объемов биоматериала стимулирует оптимизацию и модификацию уже существующих протоколов и создание новых методик на новых физико-химических принципах. Мы находим целесообразными разработки в направлении автоматизации и масштабирования методик экстракции и очистки, уменьшения продолжительности и трудоемкости выполнения процедуры, снижении финансово-материальных затрат, а также их адаптации к применению с конкретными источниками нуклеиновых кислот. Кроме того, многообразие протоколов получения нуклеиновых кислот ставит исследователя в затруднительное положение, вынуждая самостоятельно выбирать стратегию на основе имеющегося собственного опыта в этой области. При этом эффективность выделения и очистки нуклеиновых кислот с помощью коммерческих наборов варьируется даже в руках опытных лабораторных сотрудников, в том числе по объективным причинам, таким как различия в составе используемых буферных растворов и наборе расходных материалов у разных производителей. Именно поэтому остаются востребованными как экспериментальные, так и обзорные статьи, сравнивающие характеристики коммерческих и оригинальных протоколов, что позволит исследователям лучше ориентироваться при их выборе, а руководителям научных и медицинских учреждений внедрять эти методики в лабораторную и клиническую практику для решения важных практических задач, таких как HLA-генотипирование.

Об авторах

Олег Александрович Баранов

Военный инновационный технополис «ЭРА»

Email: repit13254@gmail.com

старший оператор

Россия, Анапа

Дмитрий Алексеевич Байран

Военный инновационный технополис «ЭРА»

Email: dima.bayran@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5527-5560

старший оператор

Россия, Анапа

Илья Владимирович Маркин

Военный инновационный технополис «ЭРА»

Автор, ответственный за переписку.
Email: ilya.markin.92@bk.ru
SPIN-код: 6021-7645

кандидат технических наук

Россия, Анапа

Елена Сергеевна Щелканова

Военный инновационный технополис «ЭРА»

Email: schelkanova_el@mail.ru
SPIN-код: 8396-0602

кандидат биологических наук

Россия, Анапа

Евгений Александрович Журбин

Военный инновационный технополис «ЭРА»

Email: zhurbin-90@mail.ru
SPIN-код: 8426-1354

кандидат медицинских наук

Россия, Анапа

Список литературы

Дополнительные файлы