Physiological features of development and options for technology for obtaining pluripotent stem cells

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Проблемы, связанные с выделением стволовых клеток (СК), их последующим применением по-прежнему остаются нерешенной проблемой, как с научной точки зрения, так и, особенно, в практическом здравоохранении. Нерешенность практических вопросов связана с недостаточными знаниями биологических и физиологических особенностей этих клеток. Необходимо рассмотреть основные теоретические научные данные, которые исследователи получили на сегодняшний день.

Цель исследования — на основании отечественного и мирового опыта оценить методики и перспективы выделения СК, их применение в медицине, а также доведение до широкого круга читателей вопросов, связанных с технологией выделения СК и механизмами их биологического развития.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучена отечественная и зарубежная литература, отражающая особенности дифференцировки и варианты технологии получения плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) и основные вопросы, связанные с их развитием.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Плюрипотентные стволовые клетки по своей структуре и организации напоминают эпибласт раннего эмбриона. Теоретически ПСК могут быть получены в неограниченном количестве in vitro. Эти клетки могут дифференцироваться в большинство клеток и тканей организма, то есть являются тотипотентными, образующими однородные яйцеклетки, состоящие из внутреннего клеточного слоя, формирующего трофобласт. Единственными тотипотентными клетками (ТК) млекопитающих являются зигота и первые несколько бластомер, образованных делением зиготы. К ПСК относятся все типы клеток, кроме трофоэктодермы, в том числе не только ткани плода, но и различные типы внезародышевой ткани, такие как висцеральная энтодерма. Такие клетки являются мультипотентными, образующими определенные субтипы клеток при естественных обстоятельствах, и охватывают большинство тканей конкретных популяций СК, выявленных во взрослом организме [1–3].

Существует три способа получения ПСК. Во-первых, они могут быть получены in vitro из культуры клеток внутреннего слоя бластоцисты, это эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Во-вторых, они могут быть получены из соматических клеток в результате введения группы генов, индуцирующих плюрипотентность, это индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Наконец, они могут быть получены в результате трансплантации ядра соматических клеток в энуклеированную вторичную яйцеклетку (somatic cell nuclear transfer — SCNT). Микроокружение яйцеклетки способствует перепрограммированию ядра до состояния близкого к зиготе. В результате оплодотворенная яйцеклетка может быть получена в «пробирке» и быть источником клеточной линии. ПСК, полученные с помощью этих методик, являются практически идентичными, но существуют и весьма важные различия [4].

ЭСК мыши впервые были получены еще в 1980 г. в результате культивирования in vitro внутренней массы клеток (ВМК) мышиных бластоцист. Естественно, что с тех пор методы и методики получения ЭСК были значительно усовершенствованы. Первоначально ЭСК были получены из фидер-клеток, являющихся фибробластами, потерявшими способность к делению. Фидер-клетки остаются живыми и секретируют необходимые факторы для роста ПСК. Одним из таких важнейших факторов является фактор ингибирующий лейкемию (Leukemia inhibitory factor — LIF), принадлежащий к семейству интерлейкина 6. Трансдукция сигнала осуществляется через путь Янус-киназа (трансдуктор сигнала и активатор транскрипции — Jаnus Kinases — signal transducer and activator of transcription — JAK-STAT). В настоящее время фидер-клетки по-прежнему широко используются для получения ЭСК. Кроме того, ЭСК мыши можно культивировать и в бессывороточной питательной среде, содержащей LIF, а также ингибиторы сигнальных путей — митоген-активированные внеклеточные сигнальные регуляторы киназы (MEK), киназу гликогенсинтазы 3β (glycogen synthase kinase — GSК3), которые обычно активируются фактором роста фибробластов (FGF) и белками Wnt. МЕК инактивируется мирдаметинибом PD0325901, а GSK3 — тригидрохлоридом CHIR99021. Первоначально в таких средах можно было культивировать ЭСК 129 штаммов мыши, однако в настоящее время количество штаммов может быть значительно расширено, в том числе и от крыс. В питательной среде ЭСК растут как куполообразные скопления рефракционных клеток. Эти скопления могут быть разобщены соответствующими ферментами, после чего одиночные клетки могут образовывать новые колонии. Такие клетки имеют большие ядра, четкие нуклеолы и мало цитоплазмы. Их плюрипотентные свойства зависят от сети транскрипционных факторов, из которых Oct4 (POU5F1), Sox2 и Nanog составляют основную группу. Эти три фактора вместе способствуют их собственной транскрипции, тем самым генерируя стабильную автокаталитическую петлю, которая поддерживает плюрипотентное состояние до тех пор, пока клеточная среда остается постоянной. Они также связываются с многочисленными участками по всему геному и подавляют экспрессию целого ряда генов контроля раннего развития [5–7].

Многие такие гены имеют промотеры, находящиеся в хроматине, являющиеся модификациями гистонов активации и ингибирования. Так, с триметилированием лизина 4 на гистоне H3 (H4K3Me3) связаны процессы активации, а с H4K27Me3 — ингибирования. Это состояние хрупкого динамического равновесия свидетельствует о том, что небольшой стимул может либо активировать, либо подавлять гены контроля развития. При нормальном развитии глобальное ремитилирование генома начинается на стадии бластоцисты. Поэтому предшественники ЭСК и сами ЭСК имеют почти нормальный уровень метилирования дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и сохраняют следы своего эмбрионального происхождения. ЭСК самки мыши обычно имеют обе активные Х-хромосомы. Это свидетельствует о том, что они находятся в состоянии развития до случайной Х-инактивации, обычно происходящей в эпибласте. Мышиные ЭСК на своей поверхности имеют многие эмбриональные маркеры: углеводные рецепторы SSEA1 (CD15), щелочную фосфатазу, также экспрессируют и другие маркеры плюрипотентности: фактор 4, подобный Круппелю ((Krüppel-like factor 4, 2 — KLF4, 2), рецептор, связанный с эстрогеном (estrogen related receptor beta — ESRRB), транскриптационный фактор СР2, подобный 1 (transcription factor CP2 like 1 — TFCP2L1), Т-бокс транскриптационный фактор (TBX3) и гаструляционный гомеобокс мозга 2 (Gastrulation Brain Homeobox 2 — GBX2). ЭСК мыши дифференцируются из ВМК на стадии преимплантации эпибласта. Это установлено на основании сравнения профилей экспрессии генов и на прямой изоляции ЭСК от эпибластов 4,5-дневных оплодотворенных яйцеклеток. ЭСК могут быть получены из материала 8,5–11,5-дневных эмбрионов мыши. ЭСК, полученные из эмбрионов мыши более поздних стадий развития, теряют маркеры плюрипотентности [8–10].

Существуют три различных варианта определения потенциала дифференцировки ЭСК мыши (рис. 1).

 

Рис. 1. Дифференциация ЭСК мыши. ЭСК формируют тело эмбриона в пробирке, в естественных условиях — тератому

Fig. 1. Differentiation behavior of mouse embryonic stem cells. They can form embryoid bodies in vitro, teratomas in vivo, and contribute to mouse embryos if introduced at an early stage

 

Во-первых, это дифференциация в «пробирке», начинающаяся при удалении LIF и 2i-ингибиторов. Если клетки способны к агрегированию, то полученные структуры образуют эмбриоидные тела (ЭТ). Первичная ткань дифференцируется в первичную энтодерму по всему ЭТ. Образование энтодермы сопровождается элиминированием Nanog и дисрегуляцией экспрессии GATA6. Примерно через 3 дня после элиминирования LIF экспрессия гена Осt4 приводит к потере маркеров специфичности ранним эмбрионом. К ним относится эмбриональный транскрипционный фактор, кодируемый генами Т и Sox17. Затем появляются индивидуальные маркеры для органов, например, тропонин С для сердечной мышцы. Временная шкала развития ЭТ аналогична обычной временной шкале эмбрионального развития, но пространственная организация эмбрионов в значительной степени отсутствует. Вероятно, это связано с тем, что ЭТ, как правило, гораздо больше, чем реальные ВМК или эпибласты. Поэтому они обеспечивают иную среду межклеточных контактов, внеклеточной матрицы и индуцирующих факторов, выделяемых близлежащими клетками [11].

Вторым типом дифференциации является формирование тератомы. Если ЭСК мыши имплантируются в иммунологически толерантную взрослую мышь, то, как правило, под кожей или внутри мышцы образуется опухоль (тератома). Она содержит компоненты трех зародышевых эмбриональных слоев, устойчивые ПСК, обеспечивающие увеличение опухоли. Тератомы нуждаются в минимальном количестве ПСК. Однако патогенетические механизмы формирования тератомы изучены недостаточно. Так, например, неизвестно, какое количество клеток необходимо для формирования тератомы [12–13].

Третий тип дифференциации осуществляется, если ЭСК мыши вводятся повторно в полость бластоцисты ранней оплодотворенной яйцеклетки или агрегированием с ранними бластомерами (см. рис. 1). ЭСК мыши контактируют с ВМК и способствуют формированию и развитию всех структур и тканей эмбриона. В таких экспериментах донорские клетки генетически отличаются от клеток реципиента. Поэтому полученный эмбрион, состоящий из двух генетически различных популяций клеток, будет гибридным (химерным). Если эмбрионы реимплантируются в матку реципиентной самки мыши, то они развиваются в более ранние сроки, что позволяет выращивать и спаривать гибридных мышей. Таким образом можно получать потомство с генетическими маркерами оригинальной линии ЭСК. Это подтверждает происхождение функциональных зародышевых клеток из ЭСК, введенных в эмбрион, и гибридизация зародышевой линии, что используется для незначительно дефектных линий ЭСК при генерации химер. Таким образом, формирование зародышевой гибридной линии является «золотым стандартом» плюрипотентного поведения клеток [14].

Тетраплоидные клетки — клетки с двойным набором хромосом. Тетраплоидные эмбрионы мыши могут быть получены электрофузией первых двух бластомер, которые генерируют новую зиготу с двойным набором хромосом. Тетраплоидные эмбрионы не способны развиваться соответствующим образом, но могут образовывать экстраэмбриональные структуры, необходимые для развития диплоидного плода. Поэтому если нормальные СК или ЭСК мыши имплантируются в бластоцисту тетраплоидного образования, то донорские клетки формируют весь эмбрион, а тетраплоидные клетки образуют плаценту. Способность формировать целый эмбрион является более важным критерием плюрипотентности клеток, чем зародышевые химерные линии, так как только отдельные линии ЭСК мыши могут осуществлять это успешно. Можно генерировать ПСК не только из ВМК эмбриона, но и из эпибластов ранних стадий постимплантации, это — эпибластные СК (EpiSCs). Они соответствуют базовому определению ПСК с точки зрения роста культуры без ограничений и способны формировать широкий спектр образований — либо ЭТ, либо тератомы. Однако они отличаются от обычных ЭСК. Во-первых, колонии EpiSC плоские, во-вторых, не образуют клоны, в-третьих EpiSC не растут в присутствии LIF, но требуют активации и наличия в питательной среде FGF. В-четвертых, они не генерируют химеризм в эмбрионах мышей, дополнительные факторы транскрипции, присутствующие в ЭСК мыши, отсутствуют, а ген Oct4 контролируется различными усиливающими агентами. Общий уровень метилирования генома высокий, и EpiSC самок имеют только одну активную хромосому. Такие клетки, полученные из ЭСК мышей, находятся в отчетливом плюрипотентном состоянии. Клетки, полученные из ВМК, являются «наивными», неинформированными, а клетки из эпибласта — примированными. Возможно преобразование ЭСК мыши в EpiSC, добавив в питательную среду активин/FGF. Обратная трансформация от EpiSC к ЭСК мыши возможна усилением экспрессии гена Klf4, одного из вспомогательных факторов плюрипотенции, связанных с транскрипцией [15–16].

В 2006 г. было обнаружено, что существует возможность перепрограммирования обычных соматических клеток путем введения группы генов плюрипотентности. Полученные клетки являются индуцированными ПСК. В настоящее время перепрограммирование плюрипотентности является активной областью исследований, в которой достигнут значительный технический прогресс. Так, используется оригинальный генный коктейль, состоящий из четырех генов: Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc. Oct4 и Sox2 являются частью основной сети плюрипотенции транскрипционных факторов ЭСК, а Klf4 — вспомогательным фактором транскрипции, также связанным с плюрипотенцией (рис. 2) [17].

 

Рис. 2. Этапы получения ПСК

Fig. 2. Procedure for making induced pluripotent stem cells

 

cMYC — многофункциональный фактор, увеличивающий скорость деления клеток, которая способствует процессу перепрограммирования. Практически все программы использования различных комбинаций генов включают Oct4. Первоначально доставка осуществлялась с помощью ретровирусов, которые интегрировались в геном целевых клеток. Однако последние исследования показали, что интеграция не была существенной и что перепрограммирование может быть достигнуто с помощью неинтеграционных технологий. Важно то, что синтез генных продуктов идет на высоком уровне параллельно с делением клеток, например, через использование собственной репликации эписом или рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса Сендай (РНК-РНК репликация) или повторные трансфекции РНК с кодированием необходимых генов. Также еще используются методики, которые не позволяют достичь высокого уровня синтеза генных продуктов, но они остаются малоэффективными. Перепрограммируется обычно лишь несколько клеток из целой популяции. Они растут в среде для ЭСК мыши, где появляются как куполообразные рефрактильные колонии, которые могут быть изолированы, и в дальнейшем их количество может быть увеличено. Клетки, которые используются в экспериментах с мышами, как правило, фибробласты, полученные из эмбрионов, — мышиные эмбриональные фибробласты (MEFs). Пока этот процесс исследован недостаточно. Последние исследования показали, что перепрограммированные клетки не являются СК. Исследование механизмов формирования ИПСК показало, что они во многом зависят от использования индуцибельных структурных генов, особенно доксициклиновой системы. В этой системе ген «интереса» помещен под контроль тетрациклинового элемента реакции (TRE), основанного на операторе Tet от E. coli. Клетки также поставляются с генами, экспрессированными активатором Tet (rtTA-версия) под контролем конститутивного промотера. Поступление доксициклина способствует активации транскрипции TRE. Первоначально это было использовано для регулирования экспрессии генов Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc (OKSM) в переносчиках-лентивирусах, которые могут интегрироваться в ДНК клеток-мишеней. Если ИПСК активируются дозированно клетками с доксициклином, то после изъятия препарата ИПСК сохраняются и продолжают расти. Это свидетельствует о том, что постоянного переноса генов не требуется, так как ИПСК уже экспрессируют сеть генов плюрипотентности, включая Oct4, Sox2 и Nanog от собственных эндогенных генов, образуя стабильную самоподдерживающую систему [18–20].

Однако постоянная экспрессия генов OKSM препятствует дифференциации ИПСК. Поэтому для достижения дифференциации необходимо блокировать их экспрессию. Установлено, что ИПСК могут происходить из большинства соматических клеток, а не только из редких СК, находящихся в исходном материале. Химерные мыши были получены из ИПСК, содержащих OKSM, под контролем доксициклина и введения этих клеток в мышиные бластоцисты. Полученные мыши используются в качестве источника предшественников В- или зрелых В-лимфоцитов, выделенных микрофлюидным одноклеточным транскрипционным анализом из костного мозга или селезенки и позволяющим идентифицировать новые профили поверхностных маркеров. Такие клетки помещаются по одной в лунки для дифференциации в присутствии факторов роста [21].

Добавление доксициклина индуцировало образование колоний ИПСК в этих клональных структурах. Установлено, что все колонии ИПСК имеют такую же характеристику ДНК генов антител, как и продуцирующие их В-лимфоциты (рис. 3). В случае использования зрелых В-лимфоцитов для получения ИПСК требовалась переэкспрессия дополнительного гена — C/EBPα. Таким образом, в эксперименте было показано, что все предшественники В-лимфоцитов, обработанные доксициклином, в конечном итоге будут генерировать колонии ИПСК. Это еще раз доказывает, что даже клетка, дифференцированная с помощью переарранжировки ДНК, может быть преобразована в ИПСК и что каждая клетка, а не только отдельные субпопуляции, может образовывать ИПСК [22–23].

 

Рис. 3. Формирование ИПСК. Химерные мыши обрабатываются клетками, содержащими доксициклин и индуцибельные OKSM трансгены. В-лимфоциты культивируются и преобразуются в ИПСК

Fig. 3. Formation of iPS cells from fully differentiated precursors. Here chimeric mice are generated with some cells containing doxycycline-inducible OKSM transgenes. B-lymphocytes are cultured and transformed into iPSC

 

Биологические характеристики мышиных ИПСК близки к характеристикам ЭСК мыши. Они растут как рефракционные колонии в среде LIF/2i или в других средах для ЭСК мыши. Они самостоятельно экспрессируют плюрипотентные гены регуляторы сети. Изучение генов эндогенной плюрипотентности показывает, что ингибирующие метилирование ДНК были удалены от их промотеров. Они также имеют и другие характерные маркеры — поверхностные полисахариды SSEA1 клеток и фермент — щелочную фосфатазу. В женских клетках активируются неактивные Х-хромосомы [24].

Когда LIF элиминируется, клетки будут формировать ЭТ с типичными моделями дифференциации. Они также формируют тератомы при введении иммунологически совместимым взрослым животным и образуют все три эмбриональных зародышевых слоя. Лучшее качество мышиных ИПСК — генерирование химерных зародышевых линий при введении в предимплантационный эмбрион, а в некоторых случаях может быть достигнута тетраплоидная комплектация. Интересно, что в процессе активации ИПСК первой появляется щелочная фосфатаза, за ней SSEA1, и только после этого устанавливается эндогенная Nanog-регуляция и создается сеть генов автокаталитической плюрипотентности. Таким образом, мышиные ИПСК не идентичны ЭСК мыши [25].

Тщательное изучение всех экспрессированных профилей генома с помощью RNAseq показывает, что они схожи, но не идентичны. Также часто выявляются остаточные эпигенетические особенности: метилирование ДНК, модификация гистонов, которые были у родительских клеток и не были полностью стерты. Это свидетельствует о том, что ИПСК могут более легко дифференцироваться в типы клеток происхождения, а не в другие типы. Исследования такого рода показали, что клетки могут находиться в различных плюрипотентных состояниях, отличающихся по стабильности, приближающей их к нормальному состоянию ЭСК. Так как такие различия могут существенно повлиять на процесс дифференцировки клеток, необходимо перед началом работы с линией ИПСК клеток тщательно изучить ее биологические особенности [26].

ЭСК человека впервые были получены 1998 г. с использованием тех же методик, что и для мышей. Плюрипотентные клетки человека были получены из их ВМК. Эти клетки растут на подложке как рефракционные колонии, экспрессируют основные гены плюрипотентности и щелочную фосфатазу. Как ПСК они могут дифференцироваться в ЭТ и при введении иммунодефицитным мышам могут образовывать тератомы, содержащие производные всех трех зародышевых слоев (дефинитивную энтодерму, мезодерму и эктодерму) [27].

Несмотря на сходство ЭСК человека и ЭСК мыши, между ними существует ряд различий. ЭСК человека растут как плоские колонии. Для cвоего роста они требуют вместо LIF активин и FGF, а одиночные клетки не могут образовывать новые колонии. Они не экспрессируют стадиеспецифический эмбриональный антиген 1-го типа (SSEA-1 или CD15), хотя имеют набор антигенов, выявленных в клетках эмбриональной карциномы человека: SSEA-3 и SSEA-4, являющихся углеводными поверхностными клеточными структурами, и также TRA 1-60 и 1-81. Женские линии имеют одну инактивированную Х-хромосому. Не установлена возможность ЭСК человека образовывать химерные эмбрионы при введении в бластоцисты человека, так как такой эксперимент является неэтичным. Однако эксперименты с ЭСК приматов показали, что в этом случае химеризм вряд ли возможен. Перечисленные характеристики более близки «первичным» ЭСК мыши, полученным из постимплантационных эпибластов, чем «наивным» ЭСК, полученным из пре-имплантационного эпибласта или ВКМ. Таким образом, ЭСК человека эквивалентны мышиным EpiSC. Также были описаны различные методики, включая переэкспрессию генов, использование лекарственных препаратов и ингибиторов, позволяющих преобразовывать ЭСК человека во что-то похожее на «наивное» состояние мыши [28, 29].

Исходя из вышеперечисленного, остается неясным, существует ли реальное, стабильное «наивное» состояние ЭСК человека. ЭСК человека детально изучались с целью использования их в трансплантологии, чтобы они были иммунологически совместимы с хозяином. ИПСК человека, как и другие клеточные культуры, накапливают соматические мутации. В отличие от «наивных» клеток, ИПСК человека несут около шести несинонимических точечных мутаций, а также могут нести вариации копий. Существование таких мутаций неудивительно, учитывая технологию получения линий ИПСК-человека in vitro. ПСК человека, так же как ЭСК, очень непросто культивировать в основном из-за низкой эффективности клонирования. Таким образом, наиболее эффективным способом получения субкультуры является ручной, путем послойной разрезки колоний на более мелкие части, которые перекрываются и могут увеличиваться. Становятся более доступными и питательные среды для культур клеток. Например, среды с ламинином 521 и Е-кадгерином, свободные от продуктов животного происхождения, позволяют получить ЭСК человека из одной бластомеры. Помимо ЭСК человека и ИПСК третий способ получения плюрипотентных клеточных линий связан с SCNT. Соматическое ядро в среде яйцеклеток перепрограммируется и поддерживает развитие бластулы. На этом этапе ВКМ может быть использована в качестве источника клеток, как естественно оплодотворенная яйцеклетка. Таким образом, были получены несколько линий ЭСК из бластоцист мышиных SCNT. Вероятно, что за несколько дней до созревания ИПСК возможно получение индивидуальных ЭСК человека, генетически таких же, как донорские соматические ядра. Сравнение SCNT ЭСК, полученных лабораторным путем, с ЭСК и ИПСК эмбриона показало, что ЭСК SCNT по общей модели экспрессии генов гораздо ближе к ЭСК эмбриона, чем к ИПСК. Однако в связи с практическими и этическими трудностями вероятнее всего клеточная терапия будет связана с использованием ИПСК трансплантатов [30–31].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом можно выделить следующие типы ПСК: ЭСК мыши и человека, полученные из оплодотворенных или SCNT бластоцист и ИПСК. Они получены многими лабораториями, большинство их свойств изучены. Но это не касается ПСК, полученных от постнатальных животных, человека или из внеэмбриональных источников, таких как амниотическая жидкость или пуповинная кровь. Несмотря на то, что многие лаборатории работают над получением СК от этих объектов, к сожалению, их воспроизводимость низкая, а свойства полученных клеток и даже их существование по-прежнему являются объектом споров. Cуществование таких клеток кажется маловероятным, так как после стадии эпибласта идет деление тела на различные регионы и ПСК практически исчезают из эмбриона. Принятая современная иерархическая система развития не оставляет места ПСК после первой дифференцировки эпибласта. Кроме того, ПСК, введенные во взрослый организм, способствуют ИПСК-индукции генного коктейля у мышей-трансгенов, приводящего к развитию тератом, которые в естественных (природных) условиях встречаются очень редко. Однако большое количество сообщений о клетках с широкими потенциальными возможностями свидетельствует об их возможном выделении. Одним из возможных объяснений может быть то, что существуют различные варианты ПСК, оставшихся от эпибласта, находящихся далеко от индуцирующих сигналов и не принимающих участия в нормальной дифференцировке эпибласта. Такие клетки могут находиться в любом месте, но только те, которые не подвергаются воздействию индуцирующих факторов (Wnts, FGFs, Nodals, BMPs и др.), могут сохранить плюрипотентность до рождения. Одним из таких участков и может быть амниотическая жидкость [32–34].

Такое объяснение совместимо с выводами о том, что ПСК трудно изолировать, что они гораздо чаще встречаются у перинатальных или молодых животных, чем у взрослых. Этим объясняются различия в результатах, полученных в разных лабораториях. Другим важным объяснением является роль культуральной среды. Установлено, что одни и те же клетки имеют более широкий спектр биологических эффектов in vitro, чем in vivo. Поэтому культуральные условия могут быть скорректированы в широком диапазоне. Например, мезенхимальные СК костного мозга, вероятно, функционируют в качестве источника обновления кости in vivo. Но in vitro, при изменении культуральных условий, они могут быть источниками жировой ткани или гладкой мышцы. Вполне вероятно, что культуральные условия in vitro могут, по крайней мере, расширить диапазон дифференциации поведения некоторых популяций клеток [35].

Еще одним препятствием выделения ПСК in vitro является способ их отбора в искусственной питательной среде, где они претерпевают соматические мутации и спонтанные эпигенетические изменения. Новые варианты могут быть легко изолированы, если имеется достаточно большое количество клеток для отбора в течение длительного периода времени. Так, например, при потере эпибластом гена плюрипотентности Oct4 он не экспрессируется ни в одном участке эмбриона мыши, кроме зародышевых клеток. Однако если клетки костного мозга поместить в среду для ЭСК и инкубировать их в течение нескольких недель, то в конечном итоге можно отобрать некоторые клоны Oct4-положительных клеток. Вероятно, что здесь существует сочетание нескольких механизмов: случайные оставшиеся единичные клетки эпибласта, биологические эффекты культуральной среды in vitro и накопление соматических мутаций. Это сложный вопрос вряд ли будет решен до тех пор, пока научные исследования не будут абсолютно надежными и воспроизводимыми. Так, были получены достоверные данные в отношении ЭСК и ИПСК, но таких данных нет в отношении ПСК, полученных из пери- или постнатальных источников [36].

До настоящего времени основное использование ПСК было связано с получением генетически модифицированных мышей по нокаутам конкретных генов. Это имеет большое значение в биологических механизмах развития для понимания роли конкретных генов. В перспективе это также может иметь значение в создании моделей мышей для лечения заболеваний человека, основанных на новых знаниях иммунопатогенеза заболеваний. Также рассматриваются вопросы получения клеток для тестирования на наркотики и самый важный вопрос — создание клеток и тканей для использования в трансплантологии. Захватывающая новая возможность заключается в том, что с помощью межвидовой бластоцистной комплементации возможно создание целых органов для трансплантации. В этом случае готовится система «эмбрион — хозяин», в которой отсутствует ген, необходимый для формирования конкретного органа. Например, отсутствие Pdx1 предотвращает или, по крайней мере, сильно компрометирует образование поджелудочной железы, а отсутствие Nkx2.5 необходимо для формирования сердца. В настоящее время можно с хорошей эффективностью аблатировать гены с помощью технологии CRISPR-Cas9 непосредственно на зиготах, причем не только у мышей. ПСК, содержащие необходимый ген, вводятся в бластоцисту, а уже химерный эмбрион трансплантируется в женский репродуктивный тракт, где развивается до срока [37].

Долгосрочная перспектива заключается в том, чтобы получить органы человека в организме животного-хозяина, имплантировав в эмбрион животного нормальные ПСК человека с соответствующим абляционным геном. Осуществлены успешные эксперименты по генерации органов крыс у мышей и наоборот, но до сих пор в силу разных причин интеграция ПСК человека крупным животным остается на низком уровне. Однако даже если органы человека в будущем могут быть получены, остается нерешенной очень серьезная проблема, связанная с кровеносными сосудами, полученными от хозяина. Кровеносные сосуды обладают высоким иммуногенным эффектом и могут быть причиной отторжения ксенотрансплантата при трансплантации. Бесспорно, что преодоление этих технических проблем займет длительный временной промежуток, однако это интереснейший пример изучения комбинированного потенциала биологических и физиологических особенностей СК и механизмов их развития.

About the authors

Alexander V. Moskalev

Military Medical Academy of S.M. Kirov

Author for correspondence.
Email: alexmav195223@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3403-3850
SPIN-code: 8227-2647

Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Boris Yu. Gumilevskiy

Military Medical Academy of S.M. Kirov

Email: gumbu@mail.ru
SPIN-code: 3428-7704
Scopus Author ID: 6602391269
ResearcherId: J-1841-2017

Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Vasiliy Ya. Apchel

Military Medical Academy of S.M. Kirov; A.I. Herzen Russian State Pedagogical University of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation

Email: apchelvya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7658-4856
SPIN-code: 4978-0785
Scopus Author ID: 6507529350
ResearcherId: Е-8190-2019

Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Vasiliy N. Tsygan

Military Medical Academy of S.M. Kirov

Email: vn-t@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1199-0911
SPIN-code: 7215-6206
Scopus Author ID: 6603136317

Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files