Email this article Monocytosis in patients with coronavirus pneumonia after treatment with glucocorticoids
- Authors: Shperling M.I.1, Kovalev A.V.1, Sukachev V.S.1, Vlasov A.A.2, Polyakov A.S.1, Noskov Y.A.1, Morozov A.D.1, Merzlyakov V.S.1, Zvyagintsev D.P.1, Kozlov K.V.1, Zhdanov K.V.1
-
Affiliations:
- Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
- 33rd Central Research Test Institute
- Issue: Vol 23, No 4 (2021)
- Pages: 105-112
- Section: Clinical Trials
- Submitted: 14.10.2021
- Accepted: 31.10.2021
- Published: 15.12.2021
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/83090
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma83090
- ID: 83090
Cite item
Full Text
Abstract
Features of variation of peripheral blood leukocyte formula parameters in 86 patients with coronavirus pneumonia with leukocytosis with a background of glucocorticoid treatment were investigated. All patients were divided into 2 groups. Group 1 was 22 individuals who showed clinical signs of the bacterial infection (purulent sputum cough in combination with neutrophilic leukocytosis at hospital the admission). The 2nd group was made up of 64 patients with the glucocorticoids developed against the background of treatment with glucocorticoids (dexamethasone 20 mg/day or prednisolone 150 mg/day, intravenously for 3 days) leukocytosis >10 ×109/l without signs of a bacterial infection. It was found that in patients of the 1st group compared to the 2nd group, levels of the white blood cells and neutrophils significantly (p < 0.001) exceeded the reference values in the absence of a significant change in the number of monocytes. In patients of the 2nd group after a three-day intravenous application of the glucocorticoids on the 4th day of hospitalization, a statistically significant (p <0.001) increase in the number of neutrophils and monocytes was established. When comparing the quantitative parameters of the leukocyte formula between the 2nd group on the 4th day of the hospitalization and the 1st group at admission, there were no differences in the level of leukocytes and neutrophils. Number of monocytes in group 2 (1.11 (0.90; 1.34) × 109/l), on the contrary, statistically significantly (p < 0.001) exceeded their level in the 1st group (0.59 (0.50; 0.77) × 109/l). Thus, an indicator of the number of monocytes in the peripheral blood could be a promising differential diagnostic criterion for the genesis of the leukocytosis in patients with the COVID-19. This parameter may be one of the factors influencing the decision to prescribe the antibacterial therapy.
Full Text
ВВЕДЕНИЕ
Коронавирусная инфекция, вызванная вирусом SARS-CoV-2 (COVID-19), в 19% случаев проявляется специфической вирусной пневмонией, требующей госпитализации и респираторной поддержки [1, 2]. Патогенез поражения легких, вызванного новой коронавирусной инфекцией, может быть описан двумя стадиями. На первой стадии во время репликации вируса происходит прямое вирусопосредованное повреждение тканей, за которым следует вторая стадия, которая характеризуется иммунным ответом с привлечением Т-лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов с высвобождением провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли α, интерлейкин-1, интерлейкин-6, интерферон-γ и др.). Избыточный иммунный ответ приводит к «цитокиновому шторму», который характеризуется крайне высокой концентрацией провоспалительных цитокинов в плазме крови [3–5]. Данное состояние приводит к повышенной проницаемости сосудов с развитием отека легких, прямому повреждению эндотелия (как за счет вирусопосредованного воздействия на эндотелиоциты, так и за счет «цитокинового шторма») с тромбозом мелких сосудов и последующему фиброзу легочной ткани (ввиду взаимодействия вируса SARS-CoV-2 с Toll-like рецепторами на поверхности макрофагов и нейтрофилов с последующей активацией синтеза интерлейкина-1β) [6]. Присоединение бактериальной коинфекции утяжеляет течение вирусной пневмонии, однако частота бактериальных осложнений при COVID-19 составляет 7% случаев [7, 8]. При этом более 90% госпитализированных пациентов с новой коронавирусной инфекцией получают антибактериальную терапию, что может привести к последующей антибиотикорезистентности и появлению нежелательных явлений [7]. Неоправданно частое назначение антибактериальных препаратов обусловлено повышенным риском неблагоприятного исхода при присоединении бактериальной флоры [9], клинико-лабораторными особенностями течения COVID-19, затрудняющими дифференциальный диагноз и прогнозирование осложнений в условиях массовой заболеваемости и ограниченных ресурсов системы здравоохранения.
Согласно «Временным методическим рекомендациям по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции COVID-19»1 признаками присоединения бактериальной инфекции следует считать повышение прокальцитонина более 0,5 нг/мл, лейкоцитоз более 10 × 109/л, появление гнойной мокроты. Уровень прокальцитонина крови является высокоспецифичным лабораторным маркером бактериальных осложнений COVID-19, однако имеет низкую чувствительность и высокую стоимость [10, 11]. Лейкоцитоз может сопровождать как присоединение бактериальной инфекции, так и введение глюкокортикоидов (ГКС), рекомендованных в терапии COVID-19 средней и тяжелой степени [10–13]. Результаты исследований периферической крови при некоторых заболеваниях свидетельствуют о различиях в лейкоцитарной формуле при лейкоцитозе, вызванном бактериальной инфекцией и лечением ГКC [14].
Возникновение нейтрофильного лейкоцитоза в ответ на терапию глюкокортикостероидами описано многими авторами [13, 15, 16]. Одним из основных механизмов является способность ГКС вызывать супрессию апоптоза циркулирующих нейтрофилов, тем самым приводя к снижению выработки ряда молекул клеточной адгезии (sICAM-1, sECAM-1, MAC-1, L-selectin и др.) [17]. В свою очередь уменьшение количества молекул адгезии ведет к снижению адгезионной способности лейкоцитов к эндотелию, торможению трансмиграции и тканевой инфильтрации [18]. Кроме того, описаны механизмы влияния ГКС на содержание моноцитов в периферической крови. Рядом исследователей отмечено, что применение системных ГКС может сопровождаться развитием как моноцитоза, так и моноцитопении [19] что, однако, не было рассмотрено у больных пневмонией, вызванной SARS-CoV-2.
Развитие синдрома активации макрофагов (САМ) подразумевает усиление активности моноцитов при COVID-19 в большей мере, чем при прочих иммуновоспалительных и инфекционных заболеваниях [14, 20]. В то же время получены данные, что тяжелые формы COVID-19 с выраженным САМ часто сопровождаются развитием моноцитопении, что является одним из факторов неблагоприятного прогноза [21]. Данный факт можно объяснить стремительной миграцией моноцитов в очаг воспаления, что, как следствие, приводит к снижению содержания моноцитов в системном кровотоке. Применение системных ГКС в таком случае приводит как к блокаде трансмиграции моноцитов в очаг воспаления [22], так и к стимуляции продукции их противовоспалительного пула (М2-клеток) в костном мозге [19, 23], что может приводить к увеличению количества моноцитов в периферической крови. Полученные результаты свидетельствуют о развитии абсолютного моноцитоза на фоне лечения ГКС больных среднетяжелыми формами COVID-19.
В целом, имеющиеся в литературе сведения об особенностях лейкоцитарной формулы у пациентов, страдающих новой коронавирусной инфекцией, немногочисленны и противоречивы [15].
Цель исследования — изучить особенности изменения параметров лейкоцитарной формулы периферической крови у больных коронавирусной пневмонией с лейкоцитозом на фоне лечения глюкокортикоидами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В выборочное контролируемое аналитическое исследование были включены 86 стационарных больных COVID-19 среднетяжелого течения, находящихся на лечении во временном госпитале (парк «Патриот», Московская область, Россия). Все больные были разделены на 2 группы. 1-ю группу составили 22 человека, у которых имелись клинические признаки бактериальной инфекции (кашель с гнойной мокротой в сочетании с нейтрофильным лейкоцитозом при поступлении в стационар). 2-ю группу составили 64 пациента с развившимся на фоне лечения глюкокортикоидами (дексаметазон 20 мг/сут или преднизолон 150 мг/сут, внутривенно в течение 3 дней) лейкоцитозом выше 10 × 109/л без признаков бактериальной инфекции. Анализировали анамнез, симптомы заболевания, а также показатели клинического анализа крови: абсолютное количество лейкоцитов, нейтрофилов и моноцитов (×109/л). Исследование показателей лейкоцитарной формулы проводилось на гематологических автоматических анализаторах ABX Yumizen H 500 (Франция) с разделением лейкоцитов на 5 популяций (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы, базофилы).
Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.
Численные значения анализируемых показателей каждой группы при соответствии закону нормального распределения, установленного на основании расчета W-критерия Шапиро — Уилка, представляли в виде средней арифметической (М) и стандартного отклонения (σ), в противном случае — в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q25; Q75). Для определения статистической значимости различий количественных переменных между группами использовали U-критерий Манна — Уитни, для внутригруппового сравнения — t-критерий Уилкоксона. Сравнение качественных показателей проводили с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Расчет статистических показателей осуществляли с использованием пакетов программного обеспечения Statistica 12, Microsoft Office Excel 2016. За критический уровень значимости принимали р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Группы статистически не различались по возрасту и полу, сопутствующим заболеваниям, тяжести COVID-19 и уровню С-реактивного белка (СРБ). Основную часть пациентов обеих групп составляли лица среднего и пожилого возраста с сопутствующей артериальной гипертензией (АГ). У всех обследованных при компьютерной томографии фиксировалось поражение легких (табл. 1).
Таблица 1. Клинико-анамнестические показатели обследуемых пациентов
Table 1. Clinical and anamnestic indicators of patients examined
Показатель | 1-я группа | 2-я группа | p |
Возраст, лет | 60 (51 ; 63) | 63 (58,5 ; 66) | 0,57 |
Мужчины, n (%) | 10/45,4 | 30/46,9 | 0,61 |
Женщины, n (%) | 12/54,6 | 34/53,1 | 0,34 |
ИМТ, кг/м2 | 28,06 (24,13 ; 31,34) | 29,76 (25,08 ; 32,20) | 0,51 |
АГ, абс. (%) | 14/63,6 | 43/67,2 | 0,39 |
СД, абс. (%) | 7/31,8 % | 18/28,1 | 0,66 |
Шкала NEWS, балл | 5 (3 ; 6) | 5 (3 ; 6) | 0,82 |
Поражение легких по данным КТ, % | 28 (25 ; 48) | 32 (25 ; 46) | 0,48 |
СРБ, мг/л | 57,82 (37,72 ; 68,12) | 48,18 (32,29 ; 64,68) | 0,21 |
Лейкоциты, × 109/л | 13,4 (11,34 ; 14,68) | 6,35 (5,03 ; 7,88) | < 0,001 |
Нейтрофилы, × 109/л | 10,13 (8,72 ; 11,04) | 4,79 (3,59 ; 6,33) | < 0,001 |
Моноциты, × 109/л | 0,59 (0,50 ; 0,77) | 0,71 (0,51 ; 0,86) | 0,13 |
Примечание: ИМТ — индекс массы тела; СД — сахарный диабет.
У пациентов с признаками присоединения бактериальной инфекции уровни лейкоцитов и нейтрофилов значимо (р <0,001) превышали референтные значения и показатели больных 2-й группы. Исходный показатель количества моноцитов в обеих группах не различался (рис. 1).
Рис. 1. Количество моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов у пациентов обеих групп до начала терапии ГКС
Примечание: * — p < 0,001.
Назначение терапии ГКС во 2-й группе не сопровождалось появлением клинических признаков бактериальной инфекции (гнойной мокроты, второй волны лихорадки). При анализе динамики показателей общего анализа крови пациентов 2-й группы после 3-дневного внутривенного применения ГКС установлено статистически значимое увеличение количества лейкоцитов, нейтрофилов и моноцитов. При этом уровень моноцитов у 54 (84,4%) пациентов превышал референтные значения (> 0,8 × 109/л), табл. 2.
Таблица 2. Показатели клинического анализа крови пациентов 2-й группы до и после лечения глюкокортикоидами
Table 2. Complete blood count parameters in the patients of 2nd group before and after the glucocorticoid therapy
Показатель | Исходно | 4-е сутки | p < |
Лейкоциты, × 109/л | 6,35 (5,03; 7,88) | 12,54 (10,13; 14,09) | 0,001 |
Нейтрофилы, × 109/л | 4,79 (3,59; 6,33) | 9,71 (8,02; 11,23) | 0,001 |
Моноциты, × 109/л | 0,71 (0,51; 0,86) | 1,11 (0,90; 1,34) | 0,001 |
Количественные показатели лейкоцитов и нейтрофилов у пациентов 2-й группы после лечения ГКС практически не отличались от таковых в 1-й группе. Уровень моноцитов во 2-й группе, напротив, статистически значимо превышал их уровень в 1-й группе (рис. 2).
Рис. 2. Количество моноцитов периферической крови в исследуемых группах
Сравнительная оценка показателей лейкоцитарной формулы между группами на 4-й день госпитализации не проводилась. Это связано с тем, что большей части пациентам 1-й группы также были назначены ГКС совместно с антибактериальной терапией, что оказывало непосредственное влияние на изменение параметров лейкоцитарной формулы. Следовательно, повышение абсолютного числа моноцитов в периферической крови при использовании ГКС может являться не только отличительным признаком стероид-индуцированного лейкоцитоза от ассоциированного c бактериальной ко-инфекцией, но и служить косвенным признаком эффективности терапии данными препаратами.
Необходимо также учитывать, что появление относительного моноцитоза у пациентов, находящихся на лечении в стационаре по поводу COVID-19, может указывать на сочетание присутствия SARS-CoV-2 и реактивации герпесвирусной инфекции (EBV-инфекции) [24]. Это также должно служить поводом к обследованию на маркеры EBV-инфекции с целью коррекции тактики ведения пациента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показатель количества моноцитов в периферической крови может быть перспективным дифференциально-диагностическим критерием причины лейкоцитоза у пациентов, болеющих COVID-19. Данный параметр может являться одним из факторов, влияющих на принятие решения о назначении антибактериальной терапии и учитываться при разработке клинических (методических) рекомендаций [25].
Ограничения в проведенном исследовании обусловлены тем, что верификация наличия бактериальной инфекции у пациентов не является полноценной. Это связано с ограниченными лабораторными возможностями по обычной оценке уровня прокальцитонина в крови.
1 Временные методические рекомендации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции COVID-19» Версия 13. Утверждены заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 14.10.2021.
About the authors
Maxim I. Shperling
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Author for correspondence.
Email: mersisaid@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3274-2290
SPIN-code: 7658-7348
Scopus Author ID: 57215661145
ResearcherId: ABC-3170-2021
intern
Russian Federation, Saint PetersburgAlexey V. Kovalev
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: kovalev.mmeda@yandex.ru
SPIN-code: 3478-3858
intern
Russian Federation, Saint PetersburgVitaliy S. Sukachev
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: dr.sukachev@gmail.com
SPIN-code: 4140-6250
Scopus Author ID: 54890504800
ResearcherId: H-6303-2016
candidate of medical sciences
Russian Federation, Saint PetersburgAndrey A. Vlasov
33rd Central Research Test Institute
Email: vlasovandrej@mail.ru
SPIN-code: 2801-1228
candidate of medical sciences
Russian Federation, Volsk-18Alexey S. Polyakov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: doctorpolyakov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9238-8476
SPIN-code: 2700-2420
Scopus Author ID: 56583551700
ResearcherId: M-4229-2016
candidate of medical sciences
Russian Federation, Saint PetersburgYaroslav A. Noskov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: dady-08@mail.ru
SPIN-code: 1645-2231
candidate of medical sciences
Russian Federation, Saint PetersburgAlexandr D. Morozov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: m14232@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2258-5914
SPIN-code: 3874-8152
candidate of medical sciences
Russian Federation, Saint PetersburgVictor S. Merzlyakov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: sidmma@yandex.ru
SPIN-code: 5098-0700
cadet
Russian Federation, Saint PetersburgDmitry P. Zvyagintsev
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: zvyagintsev321@mail.ru
SPIN-code: 9937-6852
cadet
Russian Federation, Saint PetersburgKonstantin V. Kozlov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: kosttiak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4398-7525
SPIN-code: 7927-9076
Scopus Author ID: 56924908500
ResearcherId: H-9944-2013
doctor of medical sciences, professor
Russian Federation, Saint PetersburgKonstantin V. Zhdanov
Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation
Email: zhdanovkv.vma@gmail.com
SPIN-code: 7895-2075
Scopus Author ID: 6602691874
doctor of medical sciences, professor
Russian Federation, Saint PetersburgReferences
- Surveillances V The Epidemiological Characteristics of an Outbreak of 2019 Novel Coronavirus Diseases (COVID-19). Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2020;41(2):145–151. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2020.02.003
- Zaytsev AA, Chernov SA, Kryukov EV, et al. Practical experience of managing patients with new coronavirus infection COVID-19 in hospital (preliminary results and guidelines). Lechaschi Vrach. 2020;(6):74–79. (In Russ.). doi: 10.26295/OS.2020.41.94.014
- Teuwen LA, Geldhof V, Pasut A, et al. COVID-19: the vasculature unleashed. Nat Rev Immunol. 2020;20(7):389–391. doi: 10.1038/s41577-020-0343-0
- Azkur AK, Akdis M, Azkur D, et al. Immune response to SARS-CoV-2 and mechanisms of immunopathological changes in COVID-19. Allergy. 2020;75(7):1564–1581. doi: 10.1111/all.14364
- Minnullin TI, Stepanov AV, Chepur SV, et al. Immunological aspects of SARS-CoV-2 coronavirus damage. Bulletin of the Russian Military Medical Academy. 2021;23(2):187–198. (In Russ.). doi: 10.17816/brmma72051
- Wang J, Jiang M, Chen X, et al. Cytokine storm and leukocyte changes in mild versus severe SARS-CoV-2 infection: Review of 3939 COVID-19 patients in China and emerging pathogenesis and therapy concepts. J Leukoc Biol. 2020;108(1):17–41. doi: 10.1002/JLB.3COVR0520-272R
- Lansbury L, Lim B, Baskaran V, Lim WS. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2020;81(2):266–275. doi: 10.1016/j.jinf.2020.05.046
- Youngs J, Wyncoll D, Hopkins P, et al. Improving antibiotic stewardship in COVID-19: Bacterial co-infection is less common than with influenza. J Infect. 2020;81(3):e55–e57. doi: 10.1016/j.jinf.2020.06.056
- Crotty MP, Akins R, Nguyen A, et al. Investigation of subsequent and co-infections associated with SARS-CoV-2 (COVID-19) in hospitalized patients. мedRxiv. 2020;2:1–19. doi: 10.1101/2020.05.29.20117176
- Vazzana N, Dipaola F, Ognibene S. Procalcitonin and secondary bacterial infections in COVID-19: association with disease severity and outcomes. Acta Clin Belgica Int J Clin Lab Med. 2020:1–5. doi: 10.1080/17843286.2020.1824749
- Zaitsev AA, Chernov SA, Stets VV, et al. Algorithms for the management of patients with a new coronavirus COVID-19 infection in a hospital. Guidelines. Consilium Medicum. 2020;22(11):91–97. (In Russ.). doi: 10.26442/20751753.2020.11.200520
- Lee H. Procalcitonin as a biomarker of infectious diseases. Korean J Intern Med. 2013;28(3):285–291. doi: 10.3904/kjim.2013.28.3.285
- Shoenfeld Y, Gurewich Y, Gallant LA, et al. Prednisone-induced leukocytosis. Am J Med. 1981;71(5):773–778. doi: 10.1016/0002-9343(81)90363-6
- Martinez FO, Combes TW, Orsenigo F, et al. Monocyte activation in systemic Covid-19 infection: Assay and rationale. EBioMedicine. 2020;59:(102964):1–7. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102964
- Zaitsev AA, Golukhova EZ, Mamalyga ML, et al. Efficacy of methylprednisolone pulse therapy in patients with COVID-19. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2020;22(2):88–91. (In Russ.). doi: 10.36488/cmac.2020.2.88-91
- Dubinski D, Won SY, Gessler F, et al. Dexamethasone-induced leukocytosis is associated with poor survival in newly diagnosed glioblastoma. J Neurooncol. 2018;137(3):503–510. doi: 10.1007/s11060-018-2761-4
- Liles WC, Dale DC, Klebanoff SJ Glucocorticoids inhibit apoptosis of human neutrophils. Blood. 1995;86(8):3181–3188.
- Burton JL, Kehrli ME, Kapil S, et al. Regulation of l-selectin and CD18 on bovine neutrophils by glucocorticoids: effects of cortisol and dexamethasone. J Leukoc Biol. 1995;57(2):317–325. doi: 10.1002/jlb.57.2.317
- Ehrchen JM, Roth J, Barczyk-Kahlert K. More Than Suppression: Glucocorticoid Action on Monocytes and Macrophages. Front Immunol. 2019;10:2028. doi: 10.3389/fimmu.2019.02028
- Gómez-Rial J, Rivero-Calle I, Salas A. Role of Monocytes/Macrophages in COVID-19 Pathogenesis: Implications for Therapy. Infect Drug Resist. 2020;13:2485–2493. doi: 10.2147/IDR.S258639
- Qin C, Zhou L, Hu Z, et al. Dysregulation of Immune Response in Patients With Coronavirus 2019 (COVID-19) in Wuhan, China. Clin Infect Dis. 2020;71(15):762–768. doi: 10.1093/cid/ciaa248
- Solinas C, Perra L, Aiello M, et al. A critical evaluation of glucocorticoids in the management of severe COVID-19. Cytokine Growth Factor Rev. 2020;54:8–23. doi: 10.1016/j.cytogfr.2020.06.012
- Liu B, Dhanda A, Hirani S, et al. CD14++CD16+ Monocytes Are Enriched by Glucocorticoid Treatment and Are Functionally Attenuated in Driving Effector T Cell Responses. J Immunol. 2015;194(11):5150–5160. doi: 10.4049/jimmunol.1402409
- Solomay TV, Semenenko TA, Filatov NN, et al. Reactivation of Epstein – Barr virus (Herpesviridae: Lymphocryptovirus, HHV-4) infection during COVID-19: epidemiological features. Problems of Virology. 2021;66(2):152–161 (In Russ.). doi: 10.36233/0507-4088-40
- Blinov DV, Akarachkova ES, Orlova AS, et al. New framework for the development of clinical guidelines in Russia. Farmakoekonomika. Modern Pharmacoeconomics and Pharmacoepidemiology. 2019;12(2):125–144. (In Russ.). doi: 10.17749/2070-4909.2019.12.2.125-144
Supplementary files
