The stimulating effects of exometabolites of microalgae  chlorella vulgaris  on the lactic acid bacteria  bacillus coagulans

Ilya V. Markin; Маркин Илья Владимирович; Evgeny A. Zhurbin; Журбин Евгений Александрович; Pyotr K. Potapov; Потапов Петр Кириллович; Elena S. Shchelkanova; Щелканова Елена Сергеевна; Alexander N. Molodchenko; Молодченко Александр Николаевич; Nikita I.  Stepanenko; Степаненко Никита Ильич

doi:10.17816/brmma75842

The stimulating effects of exometabolites of microalgae chlorella vulgaris on the lactic acid bacteria bacillus coagulans

Authors: Markin I.V.¹, Zhurbin E.A.¹, Potapov P.K.¹, Shchelkanova E.S.¹, Molodchenko A.N.¹, Stepanenko N.I.¹
Affiliations:
1. Military Innovative Technopolis "ERA"
Issue: Vol 23, No 4 (2021)
Pages: 187-194
Section: Experimental trials
Submitted: 08.07.2021
Accepted: 15.09.2021
Published: 15.12.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/75842
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma75842
ID: 75842

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

This study aimed to determine the stimulating effect of exometabolites of microalgae Chlorella Vulgaris IPPAS C-2 — indole compounds that are cultured on wastewater model solution. The purification process of a model wastewater solution with Chlorella Vulgaris microalgae obtained biomass of microalgae with a high lipid content (up to 50%), whereas the residual concentrations of pollutants in the solution were ammonium cations of 1.5 mg/l and phosphate anions of 3.5 mg/l. The residual concentration of microorganisms in the purified model sample of wastewater does not exceed 0.3 million CFU/ml. Growth factors of indole nature, which are external metabolites of microalgae, were also found in the solution. Purified effluents were used in the microbiological synthesis of lactic acid to confirm the stimulating effect of accumulated metabolites. The control sample was a nutrient medium based on malt germ extract. The glucose concentration in all samples is the same and is 140 g/l. A strain of lactic acid bacteria Bacillus coagulans B-10468 was used as a test culture. The highest concentration of lactic acid bacteria (100 million cells/ml) was observed in a sample containing microalgae metabolites. This concentration is 1.7 times higher than in the control sample. In the future, the growth rate of Bacillus coagulans cells slowed down since the concentration of lactic acid reached the limit values of 30–50 g/l on the 3rd day, which contributed to the bacterial cell growth inhibition. The use of a growth stimulator based on treated wastewater by microalgae in the cultivation of bacteria of the species Bacillus coagulans B-10468 increases the specific rate of accumulation of bacterial biomass (0.27 day^–1), which is 26% more than in the control sample; increases the yield of lactic acid (120 g/l) by 25% compared with the traditional stimulant — malt sprouts. The lactic acid production using growth stimulants from wastewater treatment with microalgae will reduce the cost of its production. The use of this technological solution will provide an opportunity to reduce the cost of polymer, polylactide, which is one of the main materials for additive technologies.

Keywords

microalgae, bacteria, polylactide, lactic acid, culture fluid, sewage, malt sprouts, additive technologies

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время происходит прогрессивное развитие аддитивных технологий. Ведущая роль данной отрасли отведена технологии 3D-печати, которая получила широкое распространение по причине своей эффективности, высокой скорости печати и доступности. В качестве исходного материала для выполнения 3D-печати используются полимеры, различные металлы, керамика. Наибольшее распространение среди полимеров в сфере аддитивных технологий получили продукт сополимеризации трех мономеров: акрилонитрила, бутадиена и стирола (АБС-пластик) —и полилактид [1–3].

Полилактид по технологическим качествам не уступает традиционным видам пластмассы и при этом является экологически чистым материалом, который полностью разлагается при грамотном компостировании. Сырьем для производства полилактида и одновременно ограничивающим фактором его получения и использования в Российской Федерации является молочная кислота L-формы. Мировой рынок молочной кислоты на 2015 г. составил 354 тысячи тонн. Из них около 120 тысяч тонн приходилось на Северную Америку, 98 тысяч тонн на Европу и Ближний Восток и 106 тысяч тонн на Азиатский регион. В России по данным на 2019 год объем рынка молочной кислоты составил 5248 тонн, 99% которого является импортом из зарубежных стран. Россия в данной отрасли промышленности лишь начинает свое развитие, поэтому зависимость российского рынка от импорта не только ставит его стабильность под угрозу, но и не стимулирует развитие смежных рынков, которые потребляют молочную кислоту.

В настоящее время для промышленного производства молочной кислоты используются штаммы молочнокислых бактерий, способные синтезировать молочную кислоту L-формы, усваивая в процессе жизнедеятельности сбраживаемые сахара [4]. Выход молочной кислоты из сбраживаемого сахара может достигать 95%. Этот вид бактерий является факультативным анаэробом, не способен к синтезу индольных веществ, растет на культуральных средах, содержащих моно-, ди- и полисахариды.

Для синтеза молочной кислоты молочнокислые бактерии помимо источников углерода нуждаются в азоте, фосфоре, железе, цинке, марганце, кобальте и др., недостаток этих элементов в составе питательной среды значительно сказывается на процессах метаболизма клеток: дефицит азота снижает скорость размножения клеток, дефицит фосфорсодержащих соединений — к замедлению биотрансформации углеродсодержащего субстрата [5].

Одним из путей снижения стоимости производства молочной кислоты является поиск новых стимуляторов роста микроорганизмов—продуцентов молочной кислоты. Перспективным источником стимулирующих веществ, витаминов и микроэлементов для молочнокислых бактерий может выступать культуральная жидкость, полученная при культивировании микроводоросли C. vulgaris на модельном растворе сточных вод. Он в своем составе содержит стимуляторы роста — вещества индольной природы, в частности индол-3-уксусную кислоту (ИУК), — аминокислоты, витамины группы В, кобальт, медь, марганец, молибден, железо, цинк, йод [6, 7]. Возможность интеграции производства молочной кислоты с технологиями по очистке сточных вод позволит снизить себестоимость молочной кислоты в результате экономии затрат на воду, энергию и компоненты питательных сред и, как следствие, увеличить объемы производства полилактида.

Цель исследования — изучение стимулирующего эффекта метаболитов микроводоросли C. vulgaris на кинетику накопления биомассы молочнокислых бактерий и, как следствие, целевого продукта — молочной кислоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве продуцента молочной кислоты использовался штамм Bacillus coagulans В-10468 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), источником стимулирующих веществ служил фильтрат микроводорослей вида Chlorella vulgaris IPPAS C-2.

В качестве основы питательной среды для роста молочнокислых бактерий использовался модельный раствор сточных вод, очищенных микроводорослями, источником стимулирующих веществ были экзометаболиты, выделяемые микроводорослями во внешнюю среду в процессе очистки, а источником углерода служила глюкоза. В качестве контроля использовалась питательная среда с использованием стерильной воды, глюкозы и экстракта солодовых ростков [9].

Процесс очистки модельного раствора сточных вод осуществлялся при следующих условиях: температура 20 °С, уровень освещенности 7 клк с фотопериодом 24 ч, аэрация газо-воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,03%, уровень рН 7, количество вносимого посевного материала (концентрированная суспензия микроводорослей): на каждый миллион колониеобразующих единиц микрофлоры сточных вод вносилось 2 миллиона клеток микроводорослей. Очистка модельного раствора продолжалась в течение 11 суток в зависимости от условий культивирования. Конечная концентрация ИУК составила 9,8 × 10^–8 М.

Посевной материал представлял собой суспензию клеток чистой культуры штамма B. сoagulans ВКПМ В-10468, полученную смывом стерильной водой клеток бактерий со скошенной агаризованной среды Лурия. Формула С-моля бактериальной биомассы имеет вид: СН_1,58О_0,28N_0,19[10], из чего было выдвинуто предположение, что соотношение С:N в питательной среде должно быть приблизительно 5:1. При проектировании состава питательных сред учитывалось, что часть углерода расходуется на построение клеток, а часть на биосинтез молочной кислоты, потому углерод был взят в небольшом избытке. В табл. 1 представлены варианты питательных сред, использованных для биосинтеза молочной кислоты.

Таблица 1. Состав питательных сред для синтеза молочной кислоты молочнокислыми бактериями штамма B. сoagulans ВКПМ В-10468

Table 1. Composition of nutrient media for lactic acid synthesis by lactic acid bacteria of B. coagulans strain VKPM V-10468

Источник углерода

Источник стимулирующих веществ

Вода

Глюкоза — 300 мл

(сбраживаемые сахара, в пересчете на глюкозу — концентрация 140 г/л)

Модельный раствор сточных вод, очищенных штаммом C. vulgaris Beijer (IPPAS C-2)

Экстракт солодовых ростков 25% (об.)

Стерильная вода

Биосинтез проводился в орбитальном шейкере-инкубаторе Biosen ES-20/60 (частота 100 мин^–1) при следующих условиях: температура: 52°С, начальный уровень рН: 7, количество посевного материала: 20% (об.) от культуральной среды, титр посевного материала: 700–900 млн кл/мл, время культивирования: 100 ч.

Уровень рН определялся потенциометрически с использованием pH-метра «Эксперт 001» фирмы «Эконикс» (Россия). Концентрация глюкозы и молочной кислоты в культуральной жидкости определялась с использованием анализатора Biosen С-line фирмы EKF Diagnostics (Германия). Удаление клеток микроводорослей из очищенного модельного раствора сточных вод осуществлялось с использованием центрифуги Sigma (Германия) (1500 об/мин в течение 3 мин). Определение общего микробного числа осуществлялось методом Коха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате очистки модельного раствора сточных вод микроводорослями C. vulgaris IPPAS C-2 была получена биомасса микроводорослей с содержанием липидов до 50% от сухого вещества клеток и вода, содержащая катионы аммония не более 1,5 мг/л, фосфат-анионы не более 3,5 мг/л, микрофлору не более 0,3 млн КОЕ/мл, внеклеточные метаболиты микроводорослей (вещества липидной природы, вещества стимулирующего действия) [11]. Эффект гибели микрофлоры достигается за счет выделения клетками микроводорослей в процессе культивирования веществ, проявляющих антибиотические свойства. Это вещества липидной природы, содержащие ненасыщенные жирные кислоты. Такие соединения являются лабильными реакционными соединениями и под действием света, который необходим для культивирования микроводорослей, в результате свободнорадикального окисления образуют токсичные производные, угнетающие рост микрофлоры модельного раствора сточных вод. Угнетение роста микроводорослей не происходило, так как в процессе эволюции у фотосинтетиков сформировалась защитная реакция на действие перекисей, кетонов, альдегидов, образующихся из ненасыщенных липидов под действием света и кислорода [10–13]. Клетки фотосинтетиков начинают активно синтезировать антиоксиданты (токоферолы, каротиноиды), которые реагируют с активными перекисными радикалами и позволяют клеткам микроводорослей сохранить жизнеспособность [14, 15]. Бактерии микрофлоры сточных вод в процессе жизнедеятельности не подвергаются сильному воздействию светового излучения; их антиоксидантная система менее развита, потому активные перекисные радикалы атакуют молекулы белков и нуклеиновых кислот, окисляют липиды цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению метаболизма и гибели бактерий, присутствующих в сточных водах.

Анализ результатов исследования (рис. 1) позволил сделать вывод, что наибольшая концентрация молочнокислых бактерий (100 млн кл/мл) была достигнута на 3-и сутки культивирования на питательной среде, в которой в качестве стимулирующих веществ использовалась культуральная жидкость микроводорослей C. vulgaris (очищенный модельный раствор сточных вод). Концентрация клеток в среднем в 1,7 раза выше, чем в контрольном образце, в котором в качестве источника стимулирующих веществ использовался экстракт солодовых ростков. После 3-их суток культивирования рост клеток молочнокислых бактерий замедлялся, так как к этому времени в культуральной жидкости наблюдалось значительное содержание молочной кислоты 30–50 г/л, ингибирующей рост клеток.

Рис. 1. Кинетика накопления биомассы

Fig. 1. Biomass accumulation kinetics

Максимальная концентрация целевого продукта (рис. 2) наблюдалась на 5-е сутки культивирования с фильтратом культуральной жидкости C. vulgaris и составила 120 г/л. В среднем при использовании в качестве источника стимулирующих веществ фильтрата культуральной жидкости микроводорослей по сравнению с контролем (солодовые ростки) концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости возрастает на 20%. Это можно объяснить тем, что в фильтрате культуральной жидкости микроводорослей присутствуют вещества, стимулирующие рост молочнокислых бактерий (вещества индольной природы), витамины группы В — пиридоксин, тиамин, рибофлавин, которые интенсифицируют реакции синтеза белков и образование пирувата, что позволяет клеткам активнее делиться и накапливать молочную кислоту [16]. При этом подавления роста молочнокислых бактерий из-за действия экзометаболитов микроводорослей не наблюдается, так как их культивирование происходит без светового излучения.

Рис. 2. Кинетика накопления молочной кислоты

Fig. 2. Lactic acid accumulation kinetics

Анализ кинетики убыли глюкозы (рис. 3) позволяет сделать вывод, что этот углеродный субстрат усваивается клетками приблизительно с одинаковой скоростью в течение всего времени культивирования.

Рис. 3. Кинетика убыли углеродсодержащего субстрата

Fig. 3. Carbon substrate loss kinetics

Данный факт объясняется тем, что глюкоза необходима как для размножения клеток и поддержания их нормальной жизнедеятельности, так и для синтеза молочной кислоты. Максимальное усвоение глюкозы наблюдалось при культивировании вида B. сoagulans на модельном растворе сточных вод, очищенных микроводорослями, и составляло 93% (табл. 2).

Таблица 2. Контрольные показатели результатов культивирования молочнокислых бактерий на питательных средах с использованием модельного раствора сточных вод и солодовых ростков

Table 2. Control indicators of culturing results of lactic acid bacteria on nutrient media using the model solution of wastewater and malt sprouts

Субстрат	Скорость потребления глюкозы, г/л*сут	Скорость накопления молочной кислоты, г/л*сут	Процент конверсии глюкозы	Удельная скорость накопления биомассы, сут^–1	Накопленная молочная кислота, г/л
C. vulgaris IPPAS C-2	26	24	92,86	0,27	120
Солодовые ростки	25	19	89,29	0,20	95

Из данных таблицы 2 видно, что использование фильтрата модельного раствора сточных вод в качестве стимулятора роста бактерий, по сравнению с контрольным образцом, приводит к увеличению удельной скорости накопления биомассы на 26%, что, в свою очередь, напрямую влияет на скорость накопления молочной кислоты, которая увеличивается на 21%. Выход молочной кислоты при использовании фильтрата составил 120 г/л, что на 25% выше результата, полученного при использовании солодовых ростков.

Таким образом, проведенные исследования позволяют говорить о перспективности и рентабельности использования для культивирования молочнокислых бактерий модельного раствора сточных вод, очищенного микроводорослями C. vulgaris.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлена целесообразность использования вытяжки C. vulgaris для выращивания молочнокислых бактерий взамен традиционно применяемым питательным средам. Показано, что использование модельного раствора муниципальных сточных вод, очищенных клетками микроводорослей C. vulgaris (штамм Beijer (IPPAS C-2)) в качестве питательной среды для роста молочнокислых бактерий позволяет повысить концентрацию клеток бактерий в среднем в 1,7 раза, а концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости на 21% (масс.) по сравнению с контрольным образцом.

Следовательно, использование для культивирования бактерий вида В. сoagulans модельного раствора сточных вод, очищенного микроводорослями C. vulgaris, позволяет сохранить жизнедеятельность микробиологических штаммов, обеспечить их нормальный рост и увеличение скорости накопления молочной кислоты. Использование стимулятора роста, описанного в исследовании, увеличит скорость накопления биомассы, позволит снизить стоимость производства молочной кислоты.