The stimulating effects of exometabolites of microalgae  chlorella vulgaris  on the lactic acid bacteria  bacillus coagulans

Ilya V. Markin; Маркин Илья Владимирович; Evgeny A. Zhurbin; Журбин Евгений Александрович; Pyotr K. Potapov; Потапов Петр Кириллович; Elena S. Shchelkanova; Щелканова Елена Сергеевна; Alexander N. Molodchenko; Молодченко Александр Николаевич; Nikita I.  Stepanenko; Степаненко Никита Ильич

doi:10.17816/brmma75842

Исследование стимулирующего эффекта экзометаболитов микроводоросли chlorella vulgaris на примере молочнокислых бактерий bacillus coagulans

Авторы: Маркин И.В.¹, Журбин Е.А.¹, Потапов П.К.¹, Щелканова Е.С.¹, Молодченко А.Н.¹, Степаненко Н.И.¹
Учреждения:
1. Военный инновационный технополис «ЭРА»
Выпуск: Том 23, № 4 (2021)
Страницы: 187-194
Раздел: Экспериментальные исследования
Статья получена: 08.07.2021
Статья одобрена: 15.09.2021
Статья опубликована: 15.12.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/75842
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma75842
ID: 75842

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Приведены результаты исследования стимулирующего действия экзометаболитов микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS C-2 — индольных соединений, культивируемых на модельном растворе сточных вод. В процессе очистки модельного раствора сточных вод микроводорослью Chlorella vulgaris получена биомасса микроводорослей с высоким содержанием липидов (до 50%), при этом остаточные концентрации поллютантов в растворе составили: катионы аммония — 1,5 мг/л, фосфат-анионы — 3,5 мг/л. Остаточная концентрация микроорганизмов в очищенном модельном образце сточных вод не превышает 0,3 млн КОЕ/мл. В растворе также обнаружены факторы роста индольной природы, которые являются внешними метаболитами микроводоросли. Для подтверждения стимулирующего действия накопленных метаболитов очищенные стоки использовались в микробиологическом синтезе молочной кислоты. Контрольным образцом выступала питательная среда на основе экстракта солодовых ростков. Концентрация глюкозы во всех образцах одинакова и составляет 140 г/л. В качестве тест-культуры использовался штамм молочнокислых бактерий Bacillus coagulans В-10468. Наибольшая концентрация молочнокислых бактерий (100 млн кл/мл) наблюдалась в образце, содержавшем метаболиты микроводорослей. Данная концентрация в 1,7 раза выше, чем в контрольном образце. В дальнейшем скорость роста клеток Bacillus coagulans замедлился, так как на 3-и сутки концентрация молочной кислоты достигла предельных значений 30–50 г/л, что способствовало ингибированию роста клеток бактерий. Использование стимулятора роста на основе очищенных сточных вод микроводорослями при культивировании бактерий вида Bacillus coagulans В-10468 увеличивает удельную скорость накопления биомассы бактерий (0,27 сут^–1), что на 26% больше чем в контрольном образце; увеличивает выход молочной кислоты (120 г/л) на 25% по сравнению с традиционным стимулятором — солодовыми ростками. Получение молочной кислоты с использованием стимуляторов роста, полученных в результате очистки сточных вод микроводорослями, позволит сократить затраты на ее производство. Использование данного технологического решения предоставит возможность снизить себестоимость полимера полилактида, одного из основных материалов для аддитивных технологий.

Ключевые слова

микроводоросли, бактерии, полилактид, молочная кислота, культуральная жидкость, сточные воды, солодовые ростки, аддитивные технологии

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время происходит прогрессивное развитие аддитивных технологий. Ведущая роль данной отрасли отведена технологии 3D-печати, которая получила широкое распространение по причине своей эффективности, высокой скорости печати и доступности. В качестве исходного материала для выполнения 3D-печати используются полимеры, различные металлы, керамика. Наибольшее распространение среди полимеров в сфере аддитивных технологий получили продукт сополимеризации трех мономеров: акрилонитрила, бутадиена и стирола (АБС-пластик) —и полилактид [1–3].

Полилактид по технологическим качествам не уступает традиционным видам пластмассы и при этом является экологически чистым материалом, который полностью разлагается при грамотном компостировании. Сырьем для производства полилактида и одновременно ограничивающим фактором его получения и использования в Российской Федерации является молочная кислота L-формы. Мировой рынок молочной кислоты на 2015 г. составил 354 тысячи тонн. Из них около 120 тысяч тонн приходилось на Северную Америку, 98 тысяч тонн на Европу и Ближний Восток и 106 тысяч тонн на Азиатский регион. В России по данным на 2019 год объем рынка молочной кислоты составил 5248 тонн, 99% которого является импортом из зарубежных стран. Россия в данной отрасли промышленности лишь начинает свое развитие, поэтому зависимость российского рынка от импорта не только ставит его стабильность под угрозу, но и не стимулирует развитие смежных рынков, которые потребляют молочную кислоту.

В настоящее время для промышленного производства молочной кислоты используются штаммы молочнокислых бактерий, способные синтезировать молочную кислоту L-формы, усваивая в процессе жизнедеятельности сбраживаемые сахара [4]. Выход молочной кислоты из сбраживаемого сахара может достигать 95%. Этот вид бактерий является факультативным анаэробом, не способен к синтезу индольных веществ, растет на культуральных средах, содержащих моно-, ди- и полисахариды.

Для синтеза молочной кислоты молочнокислые бактерии помимо источников углерода нуждаются в азоте, фосфоре, железе, цинке, марганце, кобальте и др., недостаток этих элементов в составе питательной среды значительно сказывается на процессах метаболизма клеток: дефицит азота снижает скорость размножения клеток, дефицит фосфорсодержащих соединений — к замедлению биотрансформации углеродсодержащего субстрата [5].

Одним из путей снижения стоимости производства молочной кислоты является поиск новых стимуляторов роста микроорганизмов—продуцентов молочной кислоты. Перспективным источником стимулирующих веществ, витаминов и микроэлементов для молочнокислых бактерий может выступать культуральная жидкость, полученная при культивировании микроводоросли C. vulgaris на модельном растворе сточных вод. Он в своем составе содержит стимуляторы роста — вещества индольной природы, в частности индол-3-уксусную кислоту (ИУК), — аминокислоты, витамины группы В, кобальт, медь, марганец, молибден, железо, цинк, йод [6, 7]. Возможность интеграции производства молочной кислоты с технологиями по очистке сточных вод позволит снизить себестоимость молочной кислоты в результате экономии затрат на воду, энергию и компоненты питательных сред и, как следствие, увеличить объемы производства полилактида.

Цель исследования — изучение стимулирующего эффекта метаболитов микроводоросли C. vulgaris на кинетику накопления биомассы молочнокислых бактерий и, как следствие, целевого продукта — молочной кислоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве продуцента молочной кислоты использовался штамм Bacillus coagulans В-10468 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), источником стимулирующих веществ служил фильтрат микроводорослей вида Chlorella vulgaris IPPAS C-2.

В качестве основы питательной среды для роста молочнокислых бактерий использовался модельный раствор сточных вод, очищенных микроводорослями, источником стимулирующих веществ были экзометаболиты, выделяемые микроводорослями во внешнюю среду в процессе очистки, а источником углерода служила глюкоза. В качестве контроля использовалась питательная среда с использованием стерильной воды, глюкозы и экстракта солодовых ростков [9].

Процесс очистки модельного раствора сточных вод осуществлялся при следующих условиях: температура 20 °С, уровень освещенности 7 клк с фотопериодом 24 ч, аэрация газо-воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,03%, уровень рН 7, количество вносимого посевного материала (концентрированная суспензия микроводорослей): на каждый миллион колониеобразующих единиц микрофлоры сточных вод вносилось 2 миллиона клеток микроводорослей. Очистка модельного раствора продолжалась в течение 11 суток в зависимости от условий культивирования. Конечная концентрация ИУК составила 9,8 × 10^–8 М.

Посевной материал представлял собой суспензию клеток чистой культуры штамма B. сoagulans ВКПМ В-10468, полученную смывом стерильной водой клеток бактерий со скошенной агаризованной среды Лурия. Формула С-моля бактериальной биомассы имеет вид: СН_1,58О_0,28N_0,19[10], из чего было выдвинуто предположение, что соотношение С:N в питательной среде должно быть приблизительно 5:1. При проектировании состава питательных сред учитывалось, что часть углерода расходуется на построение клеток, а часть на биосинтез молочной кислоты, потому углерод был взят в небольшом избытке. В табл. 1 представлены варианты питательных сред, использованных для биосинтеза молочной кислоты.

Таблица 1. Состав питательных сред для синтеза молочной кислоты молочнокислыми бактериями штамма B. сoagulans ВКПМ В-10468

Table 1. Composition of nutrient media for lactic acid synthesis by lactic acid bacteria of B. coagulans strain VKPM V-10468

Источник углерода

Источник стимулирующих веществ

Вода

Глюкоза — 300 мл

(сбраживаемые сахара, в пересчете на глюкозу — концентрация 140 г/л)

Модельный раствор сточных вод, очищенных штаммом C. vulgaris Beijer (IPPAS C-2)

Экстракт солодовых ростков 25% (об.)

Стерильная вода

Биосинтез проводился в орбитальном шейкере-инкубаторе Biosen ES-20/60 (частота 100 мин^–1) при следующих условиях: температура: 52°С, начальный уровень рН: 7, количество посевного материала: 20% (об.) от культуральной среды, титр посевного материала: 700–900 млн кл/мл, время культивирования: 100 ч.

Уровень рН определялся потенциометрически с использованием pH-метра «Эксперт 001» фирмы «Эконикс» (Россия). Концентрация глюкозы и молочной кислоты в культуральной жидкости определялась с использованием анализатора Biosen С-line фирмы EKF Diagnostics (Германия). Удаление клеток микроводорослей из очищенного модельного раствора сточных вод осуществлялось с использованием центрифуги Sigma (Германия) (1500 об/мин в течение 3 мин). Определение общего микробного числа осуществлялось методом Коха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате очистки модельного раствора сточных вод микроводорослями C. vulgaris IPPAS C-2 была получена биомасса микроводорослей с содержанием липидов до 50% от сухого вещества клеток и вода, содержащая катионы аммония не более 1,5 мг/л, фосфат-анионы не более 3,5 мг/л, микрофлору не более 0,3 млн КОЕ/мл, внеклеточные метаболиты микроводорослей (вещества липидной природы, вещества стимулирующего действия) [11]. Эффект гибели микрофлоры достигается за счет выделения клетками микроводорослей в процессе культивирования веществ, проявляющих антибиотические свойства. Это вещества липидной природы, содержащие ненасыщенные жирные кислоты. Такие соединения являются лабильными реакционными соединениями и под действием света, который необходим для культивирования микроводорослей, в результате свободнорадикального окисления образуют токсичные производные, угнетающие рост микрофлоры модельного раствора сточных вод. Угнетение роста микроводорослей не происходило, так как в процессе эволюции у фотосинтетиков сформировалась защитная реакция на действие перекисей, кетонов, альдегидов, образующихся из ненасыщенных липидов под действием света и кислорода [10–13]. Клетки фотосинтетиков начинают активно синтезировать антиоксиданты (токоферолы, каротиноиды), которые реагируют с активными перекисными радикалами и позволяют клеткам микроводорослей сохранить жизнеспособность [14, 15]. Бактерии микрофлоры сточных вод в процессе жизнедеятельности не подвергаются сильному воздействию светового излучения; их антиоксидантная система менее развита, потому активные перекисные радикалы атакуют молекулы белков и нуклеиновых кислот, окисляют липиды цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению метаболизма и гибели бактерий, присутствующих в сточных водах.

Анализ результатов исследования (рис. 1) позволил сделать вывод, что наибольшая концентрация молочнокислых бактерий (100 млн кл/мл) была достигнута на 3-и сутки культивирования на питательной среде, в которой в качестве стимулирующих веществ использовалась культуральная жидкость микроводорослей C. vulgaris (очищенный модельный раствор сточных вод). Концентрация клеток в среднем в 1,7 раза выше, чем в контрольном образце, в котором в качестве источника стимулирующих веществ использовался экстракт солодовых ростков. После 3-их суток культивирования рост клеток молочнокислых бактерий замедлялся, так как к этому времени в культуральной жидкости наблюдалось значительное содержание молочной кислоты 30–50 г/л, ингибирующей рост клеток.

Рис. 1. Кинетика накопления биомассы

Fig. 1. Biomass accumulation kinetics

Максимальная концентрация целевого продукта (рис. 2) наблюдалась на 5-е сутки культивирования с фильтратом культуральной жидкости C. vulgaris и составила 120 г/л. В среднем при использовании в качестве источника стимулирующих веществ фильтрата культуральной жидкости микроводорослей по сравнению с контролем (солодовые ростки) концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости возрастает на 20%. Это можно объяснить тем, что в фильтрате культуральной жидкости микроводорослей присутствуют вещества, стимулирующие рост молочнокислых бактерий (вещества индольной природы), витамины группы В — пиридоксин, тиамин, рибофлавин, которые интенсифицируют реакции синтеза белков и образование пирувата, что позволяет клеткам активнее делиться и накапливать молочную кислоту [16]. При этом подавления роста молочнокислых бактерий из-за действия экзометаболитов микроводорослей не наблюдается, так как их культивирование происходит без светового излучения.

Рис. 2. Кинетика накопления молочной кислоты

Fig. 2. Lactic acid accumulation kinetics

Анализ кинетики убыли глюкозы (рис. 3) позволяет сделать вывод, что этот углеродный субстрат усваивается клетками приблизительно с одинаковой скоростью в течение всего времени культивирования.

Рис. 3. Кинетика убыли углеродсодержащего субстрата

Fig. 3. Carbon substrate loss kinetics

Данный факт объясняется тем, что глюкоза необходима как для размножения клеток и поддержания их нормальной жизнедеятельности, так и для синтеза молочной кислоты. Максимальное усвоение глюкозы наблюдалось при культивировании вида B. сoagulans на модельном растворе сточных вод, очищенных микроводорослями, и составляло 93% (табл. 2).

Таблица 2. Контрольные показатели результатов культивирования молочнокислых бактерий на питательных средах с использованием модельного раствора сточных вод и солодовых ростков

Table 2. Control indicators of culturing results of lactic acid bacteria on nutrient media using the model solution of wastewater and malt sprouts

Субстрат	Скорость потребления глюкозы, г/л*сут	Скорость накопления молочной кислоты, г/л*сут	Процент конверсии глюкозы	Удельная скорость накопления биомассы, сут^–1	Накопленная молочная кислота, г/л
C. vulgaris IPPAS C-2	26	24	92,86	0,27	120
Солодовые ростки	25	19	89,29	0,20	95

Из данных таблицы 2 видно, что использование фильтрата модельного раствора сточных вод в качестве стимулятора роста бактерий, по сравнению с контрольным образцом, приводит к увеличению удельной скорости накопления биомассы на 26%, что, в свою очередь, напрямую влияет на скорость накопления молочной кислоты, которая увеличивается на 21%. Выход молочной кислоты при использовании фильтрата составил 120 г/л, что на 25% выше результата, полученного при использовании солодовых ростков.

Таким образом, проведенные исследования позволяют говорить о перспективности и рентабельности использования для культивирования молочнокислых бактерий модельного раствора сточных вод, очищенного микроводорослями C. vulgaris.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлена целесообразность использования вытяжки C. vulgaris для выращивания молочнокислых бактерий взамен традиционно применяемым питательным средам. Показано, что использование модельного раствора муниципальных сточных вод, очищенных клетками микроводорослей C. vulgaris (штамм Beijer (IPPAS C-2)) в качестве питательной среды для роста молочнокислых бактерий позволяет повысить концентрацию клеток бактерий в среднем в 1,7 раза, а концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости на 21% (масс.) по сравнению с контрольным образцом.

Следовательно, использование для культивирования бактерий вида В. сoagulans модельного раствора сточных вод, очищенного микроводорослями C. vulgaris, позволяет сохранить жизнедеятельность микробиологических штаммов, обеспечить их нормальный рост и увеличение скорости накопления молочной кислоты. Использование стимулятора роста, описанного в исследовании, увеличит скорость накопления биомассы, позволит снизить стоимость производства молочной кислоты.